Summary
Förbättrad förståelse av pankreascancer biologi är kritiskt för att möjliggöra utveckling av bättre terapeutiska alternativ för att behandla cancer i bukspottkörteln. För att tillgodose detta behov, visar vi en orthotopic modell av cancer i bukspottskörteln som tillåter icke-invasiv övervakning av cancer progression hjälp
Abstract
Introduction
Cancer i bukspottskörteln är den fjärde vanligaste orsaken till cancerrelaterad död, med en 5-års överlevnad på 4-6%. 1,2 Endast 15% av patienterna diagnostiseras tidigt i sjukdomen att vara berättigad till operation, och tumörer återkommer i> 80% av dessa patienter. 3,4 Gemcitabin används för behandling av bukspottskörteln adenocarcinom, dock är chemoresistance vanligt och ofta drogen har liten effekt på den totala överlevnaden. 5 nya farmakologiska strategier för att behandla cancer i bukspottkörteln är kritiskt behövs. Deras utveckling beror på väsentligt förbättrad förståelse av de viktigaste stegen i sjukdomsförloppet som kan vara känsliga för terapeutisk intervention.
Orthotopic modeller av cancer i bukspottskörteln efterlikna centrala aspekter av den mänskliga sjukdomen, vilket gör dem idealiska verktyg för att studera biologin av cancer i bukspottskörteln. 6-9 I motsats till in vitro cell-baserade analyser av cancer i bukspottskörteln celluppförande end subkutan djurmodeller för cancer i bukspottskörteln, orthotopic modeller tillåter undersökning av tumörceller interaktioner med bukspottkörtel microenvironmenten. Kinetiken för sjukdomsprogression är mycket reproducerbara i orthotopic modeller och förekommer under en kort tid (veckor), vilket gör dem väl lämpade för pre-klinisk testning av nya läkemedel. Detta är i kontrast till transgena modeller där sjukdomsdebuten sker över en längre och mer varierande tidsram (månader till 1 år). 10 Vid användning med mer aggressiva cellinjer, orthotopic modeller av cancer i bukspottskörteln har mönster av spontan metastas liknande de som ses hos patienter. 8 Redovisning av självlysande reporter gener som eldflugeluciferas underlättar longitudinell uppföljning av tumörtillväxt, metastatisk spridning, återfall och svar på terapi. 6,11
Här beskriver vi en orthotopic modell av cancer i bukspottskörteln som utnyttjar Matrigel för lokaliserad celladministrering och in vivo bioluminescens imaging för icke-invasiv övervakning av tumörprogression. Denna orthotopic modell av cancer i bukspottskörteln tillåter icke-invasiva analyser av sjukdomsutveckling och svarar på terapeutiska åtgärder i syngena eller xenograft modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet som demonstreras utförs under ledning och godkännande av författarens institutionens djurens skötsel och användning kommittén. Alla experiment utförs i enlighet med alla relevanta riktlinjer, föreskrifter och tillsynsmyndigheter.
Ett. Transducerande bukspottkörtel cancer cellinjer
- Transducera pankreascancer celler att uttrycka luciferas såsom tidigare beskrivits. 12,13 Panc-1 och Capan-1 pankreascancer-cellinjer transduceras med eldflugeluciferas används här.
Obs: Renilla luciferas eller bakteriell luciferas kan också användas.
2. Bukspottkörtelcancer Cellberedning
- Kultur omvandlade celler pankreascancer tills 70% sammanflytande.
- Lyft bukspottkörtelns celler och säkerställa lönsamheten är större än 90%.
- Resuspendera vid 2 x 10 7 celler / ml i en 3:02 blandning av kyld Matrigel: Fosfatbuffrad saline (PBS).
- Håll Matrigel-cellsuspensionen på is före injektion in i bukspottskörteln.
Kommentarer: För att säkerställa snabb stelning av Matrigel, minska PBS volym att ta hänsyn till volymen av cellpelleten. Handtag Matrigel med iskalla instrument och sprutor hela tiden för att förhindra stelning före injektion. Den föreslagna cellantal är en guide och bör bestämmas empiriskt för varje cellinje.
Tre. Mus Framställning
- Bedöva musen med inhalerade 2-3% isofluran. Bestäm anestesidjup av brist på pedalen reflex till en mild tå nypa.
- Applicera smörjmedel till ögonen för att förhindra uttorkning.
- Placera musen på rygg på en 37 ° C värmedyna och vrid lätt musen för att höja den vänstra sidan av buken.
- Förbered buken med en 10% povidon-jodlösning.
Anmärkningar: Injectable anestesi kan användas i stället för inhalerat anestesi. Preoperativ fasta är inte nödvändigt.
4. Laparotomi
- Använda sterila kirurgiska instrument gör en 1,5 cm snitt i huden ca 1 cm vänster lateral från mittlinjen.
- Gör en 1,5 cm snitt i den underliggande magmuskelstation.
- Leta mjälten hjälp av pincett och försiktigt bort mjälten från bukhålan. Säkra mjälten längs en steril bomullspinne för att exponera den underliggande bukspottkörteln.
- Lokalisera svansen i bukspottkörteln intill mjälten.
- Med hjälp av en 29 G 0,3 ml spruta, injicera 20 pl av Matrigel-cellsuspension i bukspottkörteln.
- Efter injektionen, håll sprutan i bukspottkörteln under 30-60 sek tills Matrigel har stelnat. Detta viktiga steg minimerar cell läckage.
- Inspektera injektionsstället för att säkerställa att inget läckage uppstod.
- Returnera mjälte och bukspottkörtel till bukhålan.
Obs: Var försiktig för att undvika punktering ryggsidan i bukspottkörteln vilket kan vara tunn.
Fem. Bukväggen Stängning
- Stäng bukmuskulaturen av musen med en absorberbar flätad sutur 4-0 med en rund nål användning av en kontinuerlig söm.
- Stäng den yttre beklädnaden med en icke-absorberbar monofilament 6-0 sutur med en skärande nål användning av en kontinuerlig söm.
- Ta bort musen från den inhalerade bedövningsmedel och injiceras 0,05-0,1 mg / kg buprenorfin subkutant.
- Låt musen för att återhämta sig i sin bur placerades på en 37 ° C värmedyna med fri tillgång till mat och vatten. Om möss visar tecken på smärta såsom hunching eller nedsatt rörlighet, får buprenorfin ges var 12 timme under en 36 timmarsperiod.
- Efter sårläkning (7-10 dagar), söva musen och ta bort de yttre suturer.
6. Bioluminescent Spårning av Pancreatic CancER Progression
- Bedöva musen med inhalerade isofluran.
- Injicera 150 mg / kg D-luciferin via svansvenen.
- Placera musen i självlysande bildsystem och fånga vitt ljus och mareld bilder som tidigare beskrivits. 14,15
- Ta bort musen från den inhalerade anestesimedel och låt den återhämta sig i sitt hem bur.
Notera: Bioluminescent avbildning är icke-invasiv och kan utföras periodiskt för att undersöka tumörtillväxt kinetik. Till bilden tumör i bukspottskörteln svansen är det viktigt att sätta musen på vänster sida, så tumören pekar mot kameran. Vi avbildas en gång per vecka med frekvensen ökas upp till tre gånger per vecka före den experimentella slutpunkt med användning av en Lumina II bildgenererande systemet (Perkin-Elmer, tidigare Caliper Life Sciences) som kör programvara Living Imaging 4.3.1 med binning 4, FOV 12,5, F-stop 1, exponering 1 - 60 sek (bestäms av den högsta exposure utan pixel mättnad).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna metod beskriver en orthotopic modell av cancer i bukspottskörteln med kirurgiska ingrepp, inklusive induktion av anestesi, laparotomi, injektion av cancerceller i Matrigel och förslutning av buken (Figur 1A). De injicerade cellerna bildar en bubbla i ytan i bukspottkörteln (Figur 1B). Cancer i bukspottskörteln progression kan vara icke-invasivt övervakas med hjälp av in vivo mareld imaging att spåra spridning cancercell och spridning (figur 2). Levermetastaser indikerades genom observation av bioluminescens i levern under kirurgisk resektion (figur 2) och bekräftade ex vivo vid histologi (Figur 4B). Primära tumörer resekterades med den pankreatiska svans och mjälte vid 6 veckor efter implantation. Tumörtillväxt dynamiken i denna orthotopic injektion modellen är reproducerbara och liknar kinetik orthotopic transplantation modeller av PA ncreatic cancer (Figur 3). Tumörtillväxt i bukspottkörteln är lokalt invasiv och metastasizes till organ inklusive levern (Figur 4).
Figur 1. En orthotopic musmodell av cancer i bukspottskörteln progression. A) i.. Den sövda musen är fixerad på plats med tejp och buken desinficeras. ii. Efter längsgående laparotomi mjälte och bukspottkörtel-svans är försiktigt exterioriserades och hålls på plats på en steril bomullspinne. iii. Matrigel-inbäddade pankreatiska tumörceller injiceras in i bukspottskörteln svansen. IV. Buken är stängd i två lager. Visande exterioriseras mjälte och pankreas B) Förstorad bild. De injicerade cellerna bildar en bubbla (pilspets). ftp_upload/50395/50395fig1large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Bioluminescent avbildning av orthotopic pankreastumör (A) tio dagar efter injektion, (B) 31 dagar efter injektion, och (C) fem dagar efter tumorresection.
Figur 3. In vivo primär tumörtillväxt av Panc-1 och Capan-1-cellinjer övervakades över tid (dagar efter injektion) genom bioluminescens imaging (n = 4). Kinetiken för tumörtillväxt efter injektion av Matrigel-inbäddade pankreatiska tumörceller liknar orthotopic modeller med hjälp av transplantation av bitar pankreastumör.
_upload/50395/50395fig4.jpg "alt =" Bild 4 "/>
Figur 4. Hematoxylin och eosin-färgade snitt av (A) Panc-1 primär pankreastumör, och (B) levermetastaser från Panc-1 primär pankreastumör. * Lokal invasion av bukspottkörtel-cancerceller i den omgivande organet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en orthotopic modell för longitudinell utvärdering av bukspottkörtel tumörutveckling och progression. Primärtumörtillväxt kinetik är reproducerbar (Figur 3) och kan vara icke-invasivt övervakas med hjälp av mareld avbildning av luciferas-märkta celler, t.ex. för analyser av tumör respons på nya anti-pankreascancer terapi. I överensstämmelse med den mänskliga sjukdomen, visar modellen lokala bukspottkörtel invasion (Figur 4A) som möjliggör undersökning av tumörceller interaktioner med bukspottkörtel microenvironmenten. Användningen av luciferas-taggade cellinjer gör analyser av frekvens, plats och kinetik av metastatisk spridning. Användning av luciferas-taggade cellinjer underlättar upptäckt av metastaser innan de blir synliga för blotta ögat och vävnadslokalisering av metastaser kan bekräftas genom ex vivo imaging och histologi. Liksom i den kliniska situationen, visar modellen metastasering till organs inklusive mesenterala lymfkörtlar, lever, mag-tarmkanalen och bukhålan (Figur 4). 8 Bioluminescence avbildning kan också användas för att bestämma lyckad resektion, och incidensen och kinetik primärtumör återfall (figur 2C). 16
Noggranna förberedelser och hantering av celler cancer i bukspottskörteln är viktigt för reproducerbarhet av modellen. Förhållandet av Matrigel till PBS har optimerats för snabb stelning av cellpelleten efter injektion. Volymen av pelleterade celler (ca 35 l för 10 7 tumörceller) skall subtraheras från den volym PBS för ett slutligt 3:2 förhållande av Matrigel: celler + PBS. Under injektion cell läckage förhindras genom att upprätthålla nålen in situ under 30 till 60 s tills Matrigel har stelnat (Figur 1). Om läckage inträffar är det lätt att upptäcka som Matrigel är färgad och dessa möss kan uteslutas from ytterligare analyser. Förhindra tumörceller läckage säkerställer att metastaser uppstår från tumörceller spridning snarare än som en artefakt av injektionsteknik.
Kinetiken för tumörutveckling kommer att påverkas av antalet celler injiceras och bör bestämmas empiriskt för varje cellinje. Vi fann reproducerbara tumörtillväxt mönster efter injektion av 4 x 10 5 Panc-1 eller Capan-1-celler (Figur 3). Tröskeln för bioluminescent detektion av metastaser kommer att påverkas av egenskaper hos expressionskonstruktet användas innefattande promotorn styrka och användning av kodonoptimerade luciferas. Förutom de xenograft modeller som beskrivs här, kan teknikerna även användas med syngena linjer pankreascell att undersöka bukspottkörtel progression i ett immunkompetent inställning. Liknande tumör dynamik observerades hos han-eller honmöss (data ej visade).
Den beskrivna metoden hanre har modifierats för en orthotopic transplantation modell av cancer i bukspottskörteln. I denna modell är tumörer odlas subkutant i donatormöss, sedan en 1 mm 3 st transplanteras in i en liten ficka i bukspottkörteln svans av en mottagare mus. Kan övervakas med hjälp av mareld avbildning med donor tumörer 6-8,17 Primär tumörtillväxt härledd från luciferas-märkta tumörceller. I motsats till den orthotopic modell som beskrivs här, transplantation modeller kräver extra tid (upp till 1 månad) och ytterligare möss för generering av donor tumörer. Resultat med transplantation modeller kan påverkas av heterogen sammansättning av transplanterade tumörstycken. Vi visade här att kinetiken efter injektion av Matrigel-inbäddade celler liknar den transplanterade modellen. Transplantation modeller har använts för att studera och utveckla kliniska patientprover. 18-21
De orthotopic modeller som beskrivs här kompletterar transgena modeller av pre-invasiv och invasiv cancer i bukspottkörteln. 10,22,23 Transgena modeller rekapitulera viktiga aspekter av mänskligt bukspottkörtelcancer inklusive onkogen mutationer men visar betydande variation i sjukdomsdebuten (7 veckor till> 1 år). 10,23 De transgena modeller gör inte uttrycka luciferas och så är inte lämpliga för in vivo mareld avbildning av sjukdomsprogression. Däremot orthotopic modeller av cancer i bukspottskörteln visar reproducerbara kinetik tumörprogression och tillåta icke-invasiv övervakning, vilket gör dem väl lämpade för pre-kliniska terapeutiska studier.
Nya terapeutiska metoder är kritiskt behövs för att bekämpa de exceptionellt låga överlevnaden för bukspottkörtelcancer. Genom att tillåta visualisering av metastaserad och återkommande sjukdom, beskrev orthotopic modeller av cancer i bukspottskörteln här är relevanta för klinisk miljö, där de flesta nuvarande behandlingar är lindrande. Dessutom orthotopic modellerär mycket värdefulla för att undersöka biologi pankreastumör och utvärdera nya terapeutiska strategier i in vivo-miljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Health och Medicinska forskningsrådet, Australien (1008865), Australian Research Council (LE110100125), National Cancer Institute (CA138687-01), Erica Sloan stöds av en tidig karriär Fellowship från National Breast Cancer Foundation, Australien. Corina Kim-Fuchs stöds av ett stipendium från den schweiziska Cancer League och en HDR stipendium från Monash Institute of Pharmaceutical Sciences. Eliane Angst stöds av ett bidrag från Bern Cancer League.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clean Bench coat | |||
| Heating pad | Set to 37 °C | ||
| Ivis Lumina ll Bioluminescent imager | Caliper | Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab) | |
| Dissecting scissors | |||
| Iris forceps (serrated) | |||
| Needle holder | |||
| 27 G 0.3 ml insulin syringe | Terumo | T35525M2913 |
References
- American Cancer Society. Facts and Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Hariharan, D., Saied, A., Kocher, H. M. Analysis of mortality rates for pancreatic cancer across the world. HPB (Oxford). 10, 58-62 (2008).
- Li, D., Xie, K., Wolff, R., Abbruzzese, J. L. Pancreatic cancer. Lancet. 363, 1049-1057 (2004).
- Oettle, H., et al. Adjuvant chemotherapy with gemcitabine vs observation in patients undergoing curative-intent resection of pancreatic cancer: a randomized controlled trial. JAMA. 297, 267-277 (2007).
- Andersson, R., et al. Gemcitabine chemoresistance in pancreatic cancer: molecular mechanisms and potential solutions. Scand. J. Gastroenterol. 44, 782-786 (2009).
- Angst, E., et al. Bioluminescence imaging of angiogenesis in a murine orthotopic pancreatic cancer model. Mol. Imaging Biol. 12, 570-575 (2010).
- Angst, E., et al. N-myc downstream regulated gene-1 expression correlates with reduced pancreatic cancer growth and increased apoptosis in vitro and in vivo. Surgery. 149, 614-624 (2011).
- Hotz, H. G., et al. An orthotopic nude mouse model for evaluating pathophysiology and therapy of pancreatic cancer. Pancreas. 26, 89-98 (2003).
- Partecke, L. I., et al. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the Panc02 and 6606PDA cell lines. Eur. Surg. Res. 47, 98-107 (2011).
- Hingorani, S. R., et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer Cell. 4, 437-450 (2003).
- Sloan, E. K., et al. The sympathetic nervous system induces a metastatic switch in primary breast cancer. Cancer Res. 70, 7042-7052 (2010).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
- Morizono, K., et al. Lentiviral vector retargeting to P-glycoprotein on metastatic melanoma through intravenous injection. Nat. Med. 11, 346-352 (2005).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. J. Vis. Exp. (56), e3175 (2011).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. J. Vis. Exp. (52), e2775 (2011).
- Burton, J. B., et al. Adenovirus-mediated gene expression imaging to directly detect sentinel lymph node metastasis of prostate cancer. Nat Med. 14, 882-888 (2008).
- Vezeridis, M. P., Doremus, C. M., Tibbetts, L. M., Tzanakakis, G., Jackson, B. T. Invasion and metastasis following orthotopic transplantation of human pancreatic cancer in the nude mouse. J. Surg. Oncol. 40, 261-265 (1989).
- Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5645-5649 (1992).
- Reyes, G., et al. Orthotopic xenografts of human pancreatic carcinomas acquire genetic aberrations during dissemination in nude mice. Cancer Res. 56, 5713-5719 (1996).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).
- Furukawa, T., Kubota, T., Watanabe, M., Kitajima, M., Hoffman, R. M. A novel "patient-like" treatment model of human pancreatic cancer constructed using orthotopic transplantation of histologically intact human tumor tissue in nude mice. Cancer Res. 53, 3070-3072 (1993).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res. 66, 605-612 (2006).
- Brembeck, F. H., et al. The mutant K-ras oncogene causes pancreatic periductal lymphocytic infiltration and gastric mucous neck cell hyperplasia in transgenic mice. Cancer Res. 63, 2005-2009 (2003).
