Summary
Une meilleure compréhension de la biologie du cancer du pancréas est critique nécessaire pour permettre le développement de meilleures options thérapeutiques pour traiter le cancer du pancréas. Pour répondre à ce besoin, nous démontrons un modèle orthotopique de cancer du pancréas qui permet une surveillance non invasive de la progression du cancer à l'aide
Abstract
Introduction
Le cancer du pancréas est la quatrième cause de décès liée au cancer, avec un taux de survie à 5 ans de 4-6%. 1,2 Seulement 15% des patients sont diagnostiqués assez tôt dans la maladie pour être admissible à la chirurgie, et les tumeurs réapparaissent à> 80% de ces patients. 3,4 gemcitabine est utilisé pour le traitement des adénocarcinomes pancréatiques, cependant, la chimiorésistance est commun et souvent le médicament a peu d'impact sur la survie globale. 5 nouvelles stratégies pharmacologiques pour le traitement du cancer du pancréas est critique nécessaire. Leur développement dépend considérablement amélioré la compréhension des étapes clés de la progression de la maladie qui peuvent être sensibles à l'intervention thérapeutique.
Orthotopiques modèles de cancer du pancréas émulent les principaux aspects de la maladie humaine, faisant d'eux des outils idéaux pour étudier la biologie du cancer du pancréas. 6-9 Contrairement aux essais in vitro du comportement des cellules de cancer du pancréas à base de cellules d'und sous-cutanée dans des modèles in vivo de cancer du pancréas, les modèles orthotopiques permettre étude des interactions cellulaires tumorales avec le microenvironnement du pancréas. La cinétique de la progression de la maladie sont très reproductibles dans les modèles orthotopiques et se produisent sur une courte période de temps (semaines), ce qui les rend bien adaptés aux tests pré-cliniques de nouveaux traitements. Ceci est en contraste avec les modèles transgéniques où l'apparition de la maladie se fait sur une période plus longue et plus variable (mois à 1 an). 10 Lorsqu'il est utilisé avec des lignées cellulaires les plus agressifs, les modèles orthotopiques de cancer du pancréas ont des modèles de métastase spontanée similaires à ceux observés dans les patients. 8 Expression des gènes rapporteurs bioluminescents tels que la luciférase de luciole facilite le suivi longitudinal de la croissance tumorale, la dissémination métastatique, la récurrence et la réponse à la thérapeutique 6,11.
Nous décrivons ici un modèle orthotopique de cancer du pancréas qui utilise Matrigel pour la livraison de la cellule localisée et en imagerie par bioluminescence in vivo pour la surveillance non invasive de la progression tumorale. Ce modèle orthotopique de cancer du pancréas permet des analyses non-invasives de progression de la maladie et de la réponse aux interventions thérapeutiques dans des modèles syngéniques ou xénogreffe.
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Protocol
Le protocole étant démontrée est réalisée sous la direction et l'approbation du soin des animaux de l'institution de l'auteur et du comité de l'emploi. Toutes les expériences sont réalisées en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation.
1. Transduction Cance lignées cellulaires
- les cellules cancéreuses pancréatiques transduisent d'exprimer la luciférase comme décrit précédemment. 12,13 Panc-1 et des lignées de cellules Capan-1 pancréatiques cancéreuses transduites avec la luciférase de luciole sont utilisés ici.
Note: la luciférase de Renilla ou la luciférase bactérienne peuvent également être utilisés.
2. Préparation des cellules du cancer du pancréas
- Culture transduction des cellules cancéreuses pancréatiques jusqu'à 70% de confluence.
- Soulever les cellules pancréatiques et assurer la viabilité est supérieure à 90%.
- Remettre en suspension à 2 x 10 7 cellules / ml dans un mélange 3:2 Matrigel réfrigéré: Phosphate Buffered saline (PBS).
- Conserver la suspension cellulaire sur Matrigel-glace avant l'injection dans le pancréas.
Notes: Pour assurer la solidification rapide de Matrigel, réduire le volume de PBS pour tenir compte du volume du culot cellulaire. Poignée Matrigel en utilisant des instruments glacées et des seringues à tout moment pour empêcher la solidification avant l'injection. Le nombre de cellules proposé est un guide et ne doit être déterminé de manière empirique pour chaque lignée cellulaire.
3. Préparation de la souris
- Anesthésier la souris à l'aide d'inhalation 2-3% d'isoflurane. Déterminer la profondeur de l'anesthésie par le manque de pédale réflexe à un pincement de l'orteil doux.
- Appliquer du lubrifiant sur les yeux pour éviter la dessiccation.
- Placer la souris sur son dos sur un coussin chauffant ° C 37 et tourner doucement la souris pour soulever le côté gauche de l'abdomen.
- Préparation de l'abdomen avec une solution de polyvidone iodée à 10%.
Notes: InjectabLe anesthésie peut être utilisé à la place de l'anesthésie par inhalation. Le jeûne pré-opératoire n'est pas nécessaire.
4. Laparotomie
- Utilisation d'instruments chirurgicaux stériles faire une incision cm 1.5 dans la peau d'environ 1 cm latéral gauche de la ligne médiane.
- Faire une incision cm 1,5 dans le muscle abdominal sous-jacent.
- Localisez la rate à l'aide des pinces et retirez délicatement la rate de la cavité abdominale. Fixez le spleen le long d'un coton-tige stérile pour exposer le pancréas sous-jacent.
- Localiser la queue du pancréas à côté de la rate.
- L'utilisation d'un G 0,3 ml 29 seringue à insuline, injecter 20 ul de la suspension Matrigel cellules dans le pancréas.
- Après l'injection, tenir la seringue dans le pancréas pendant 30-60 secondes jusqu'à ce que le Matrigel a solidifié. Cette étape importante qui réduit les fuites de cellule.
- Inspectez le site d'injection afin de s'assurer qu'aucune fuite s'est produite.
- Retour de la rate et le pancréas de la cavité abdominale.
Remarque: Prenez soin de ne pas percer la face dorsale du pancréas qui peut être mince.
5. Fermeture de la paroi abdominale
- Fermer la musculature abdominale de souris avec un fil de suture tressé résorbable 4-0 avec une aiguille ronde en utilisant un point en continu.
- Fermez la peau extérieure avec un monofilament non résorbable 6-0 suture avec une aiguille de coupe en utilisant un point en continu.
- Débranchez la souris de l'anesthésique inhalé et injecté 0,05-0,1 mg / kg de buprénorphine sous-cutanée.
- Laisser la souris pour récupérer dans sa cage placée sur une ° C coussin chauffant 37 avec accès libre à la nourriture et à l'eau. Si les souris montrent des signes de douleur comme se courber ou à mobilité réduite, la buprénorphine peut être donnée toutes les 12 heures pendant une période de 36 heures.
- Après la guérison des plaies (7-10 jours), anesthésier la souris et enlever les sutures externes.
6. Suivi bioluminescentes de Canc du pancréaser Progression
- Anesthésier la souris à l'aide d'inhalation isoflurane.
- Injecter 150 mg / kg D-luciférine via veine de la queue.
- Placez la souris dans le système d'imagerie par bioluminescence et de capturer des images en lumière blanche et bioluminescence comme décrit précédemment. 14,15
- Débranchez la souris de l'anesthésique par inhalation et lui permettre de se remettre dans sa cage.
Note: imagerie bioluminescente est non-invasive et peut être effectuée périodiquement pour étudier la cinétique de la croissance tumorale. Pour tumeur de l'image dans la queue du pancréas, il est important de mettre la souris sur le côté gauche, alors les points tumorales vers la caméra. Nous imager une fois par semaine avec la fréquence est augmentée jusqu'à trois fois par semaine avant le point limite expérimental utilisant un système d'imagerie Lumina II (Perkin-Elmer, ancien Caliper Life Sciences) exécutant le logiciel 4.3.1 Imaging Vivre avec binning 4, FOV 12,5, F-stop 1, exposition de 1 - 60 sec (déterminé par le plus expOsure sans saturation des pixels).
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Representative Results
Cette méthode décrit un modèle orthotopique de cancer du pancréas en utilisant des procédures chirurgicales, y compris l'induction de l'anesthésie, la laparotomie, l'injection de cellules cancéreuses dans la fermeture Matrigel et abdominale (figure 1A). Les cellules injectées forment une bulle dans la surface du pancréas (figure 1B). la progression du cancer du pancréas peut être surveillé de manière non invasive en utilisant l'imagerie par bioluminescence in vivo pour suivre la prolifération des cellules cancéreuses et de diffusion (figure 2). métastases hépatiques a été signalée par l'observation de la bioluminescence dans le foie pendant la résection chirurgicale (figure 2) et confirmé par histologie ex vivo (figure 4B). Les tumeurs primaires ont été réséquées avec la queue du pancréas et de la rate à 6 semaines après l'implantation. La dynamique de la croissance tumorale dans ce modèle d'injection orthotopique sont reproductibles et ressemblent beaucoup à la cinétique de modèles de transplantation orthotopique de pa cancer du ncreatic (figure 3). La croissance tumorale dans le pancréas est localement invasive et métastases aux organes comme le foie (Figure 4).
Figure 1. Un modèle de souris orthotopique de la progression du cancer du pancréas. A) i. La souris anesthésiée est fixé à l'aide de ruban et l'abdomen est désinfecté. ii. Après laparotomie longitudinale de la rate et de la queue du pancréas sont doucement extériorisés et maintenus en place sur un coton-tige stérile. iii. Cellules tumorales pancréatiques Matrigel embarqués sont injectés dans la queue du pancréas. iv. L'abdomen est fermé en deux couches. L'image B) agrandie montrant la rate et le pancréas extériorisé. Les cellules injectées forment une bulle (pointe de flèche). ftp_upload/50395/50395fig1large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.
Figure 2. Imagerie bioluminescente de tumeur pancréatique orthotopique (a) de dix jours après l'injection, (B) 31 jours après l'injection, et (C) cinq jours suivant la résection tumorale.
La figure 3. En croissance de la tumeur primaire in vivo de Panc-1 et Capan-1 lignes de cellules a été suivie au cours du temps (en jours après injection) par imagerie par bioluminescence (n = 4). La cinétique de croissance de la tumeur après l'injection des cellules tumorales pancréatiques Matrigel embarqués sont similaires à l'aide de modèles orthotopiques transplantation de pièces tumorales pancréatiques.
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Figure 4. Hématoxyline et l'éosine-sections colorées (A) d'une tumeur pancréatique primaire Panc-1, et (B) des métastases hépatiques de Panc-1 tumeur pancréatique primaire. * Invasion locale des cellules du cancer du pancréas dans l'organe périphérique.
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Discussion
Nous décrivons ici un modèle orthotopique pour l'évaluation longitudinale du développement des tumeurs du pancréas et de la progression. Cinétique de croissance tumeur primaire sont reproductibles (figure 3) et peuvent être non invasive surveillé utilisant l'imagerie par bioluminescence de cellules de luciférase marqués, par exemple pour l'analyse de la réponse tumorale à de nouvelles thérapies anti-cancer du pancréas. Conformément à la maladie humaine, le modèle montre invasion du pancréas local (figure 4A) qui permet d'étudier les interactions des cellules tumorales avec le microenvironnement du pancréas. L'utilisation de lignées cellulaires luciférase étiquette permet des analyses de fréquence, le lieu et la cinétique de dissémination métastatique. L'utilisation de lignées cellulaires luciférase marqués facilite la détection des métastases avant qu'ils ne deviennent visuellement apparente et la localisation des tissus de métastases peuvent être confirmés par ex vivo l'imagerie et l'histologie. Comme dans la situation clinique, le modèle montre métastases organs, y compris les nœuds lymphatiques mésentériques, le foie, le tube digestif et la cavité péritonéale (Figure 4). 8 de l'imagerie par bioluminescence peuvent également être utilisés pour déterminer la résection réussie, et l'incidence et la cinétique de récidive de la tumeur primaire (figure 2C). 16
Une préparation minutieuse et la manipulation de cellules de cancer du pancréas est essentielle pour la reproductibilité du modèle. Le rapport de Matrigel à PBS a été optimisé pour une solidification rapide du culot cellulaire après l'injection. Le volume du culot cellulaire (environ 35 ul pendant 10 7 cellules tumorales) doit être soustrait du volume de PBS pour un rapport de 3:2 finale de Matrigel: cellules + PBS. Lors de l'injection, une fuite de cellule est empêchée en maintenant l'aiguille en place pendant 30 à 60 secondes jusqu'à ce que la solidification de Matrigel (figure 1). Si une fuite se produit, elle est facilement détecté comme Matrigel est coloré et les souris peuvent être exclus from d'autres analyses. Prévention des fuites de cellules tumorales en sorte que les métastases se produit à partir de la diffusion des cellules tumorales plutôt que comme un artefact de la technique d'injection.
La cinétique de développement de la tumeur seront influencés par le nombre de cellules injectées et doit être déterminé de manière empirique pour chaque lignée cellulaire. Nous avons trouvé les modèles de croissance tumorale reproductibles après injection de 4 x 10 5 Panc-1 ou Capan-1 cellules (Figure 3). Le seuil de détection de bioluminescence des métastases sera influencée par les caractéristiques de la construction d'expression utilisé, y compris la force du promoteur et de l'utilisation de la luciférase codon optimisé. En plus des modèles de xénogreffes décrites ici, les techniques peuvent aussi être utilisées avec des lignées de cellules pancréatiques syngéniques d'examiner la progression du pancréas dans un cadre immunocompétent. Dynamique de tumeurs similaires ont été observés chez les souris mâles ou femelles (données non présentées).
Le procédé décrit, ilre a été modifié pour un modèle de transplantation orthotopique de cancer du pancréas. Dans ce modèle, les tumeurs sont cultivées sous-cutanée chez la souris des donateurs, puis une mm 3 pièce 1 est transplanté dans une petite poche dans la queue du pancréas d'une souris receveuse. 6-8,17 croissance de la tumeur primaire peut être surveillé en utilisant l'imagerie par bioluminescence en utilisant tumeurs donateurs dérivée de cellules tumorales luciférase marqués. En contraste avec le modèle orthotopique décrit ici, les modèles de transplantation ont besoin de temps supplémentaire (jusqu'à 1 mois) et les souris supplémentaires pour la production de tumeurs des bailleurs de fonds. Résultats en utilisant des modèles de transplantation peuvent être influencées par la composition hétérogène de morceaux de tumeurs transplantées. Nous avons montré ici que la cinétique après l'injection de cellules Matrigel-embarqués sont similaires au modèle transplanté. Transplantation modèles ont été utilisés pour étudier et développer des échantillons cliniques de patients. 18-21
Les modèles orthotopiques décrits ici se complètent transgénique modèles de cancer du pancréas pré-invasives et invasives. 10,22,23 modèles transgéniques récapitulent les principaux aspects du cancer du pancréas humain, y compris les mutations d'oncogènes, mais montrent une grande variabilité dans l'apparition de la maladie (7 semaines à> 1 an). 10,23 plupart des modèles transgéniques ne pas exprimer la luciférase et ne sont donc pas adapté à l'imagerie par bioluminescence in vivo de progression de la maladie. En revanche, les modèles orthotopiques de cancer du pancréas montrent cinétique reproductibles de la progression tumorale et permettent une surveillance non invasive, ce qui les rend bien adaptés à des études thérapeutiques précliniques.
De nouvelles approches thérapeutiques sont absolument nécessaires pour lutter contre les taux exceptionnellement bas de survie au cancer du pancréas. En permettant la visualisation de la maladie métastatique et récurrent, les modèles orthotopiques de cancer du pancréas décrits ici sont pertinents pour le milieu clinique, où la plupart des traitements actuels sont palliatifs. En outre, les modèles orthotopiquessont très précieux pour étudier la biologie des tumeurs du pancréas et de l'évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre de vivo.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Conseil de recherches médicales, en Australie (1008865), l'Australian Research Council (LE110100125), l'Institut national du cancer (CA138687-01), Erica Sloan est soutenu par une bourse de début de carrière du National Cancer du sein Santé nationale et du Fondation, en Australie. Corina Kim-Fuchs est soutenu par une bourse de la Ligue suisse contre le cancer et une bourse HDR à partir de Monash Institute of Pharmaceutical Sciences. Eliane Angst est soutenu par une subvention du Cancer Ligue Berne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clean Bench coat | |||
| Heating pad | Set to 37 °C | ||
| Ivis Lumina ll Bioluminescent imager | Caliper | Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab) | |
| Dissecting scissors | |||
| Iris forceps (serrated) | |||
| Needle holder | |||
| 27 G 0.3 ml insulin syringe | Terumo | T35525M2913 |
References
- American Cancer Society. Facts and Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Hariharan, D., Saied, A., Kocher, H. M. Analysis of mortality rates for pancreatic cancer across the world. HPB (Oxford). 10, 58-62 (2008).
- Li, D., Xie, K., Wolff, R., Abbruzzese, J. L. Pancreatic cancer. Lancet. 363, 1049-1057 (2004).
- Oettle, H., et al. Adjuvant chemotherapy with gemcitabine vs observation in patients undergoing curative-intent resection of pancreatic cancer: a randomized controlled trial. JAMA. 297, 267-277 (2007).
- Andersson, R., et al. Gemcitabine chemoresistance in pancreatic cancer: molecular mechanisms and potential solutions. Scand. J. Gastroenterol. 44, 782-786 (2009).
- Angst, E., et al. Bioluminescence imaging of angiogenesis in a murine orthotopic pancreatic cancer model. Mol. Imaging Biol. 12, 570-575 (2010).
- Angst, E., et al. N-myc downstream regulated gene-1 expression correlates with reduced pancreatic cancer growth and increased apoptosis in vitro and in vivo. Surgery. 149, 614-624 (2011).
- Hotz, H. G., et al. An orthotopic nude mouse model for evaluating pathophysiology and therapy of pancreatic cancer. Pancreas. 26, 89-98 (2003).
- Partecke, L. I., et al. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the Panc02 and 6606PDA cell lines. Eur. Surg. Res. 47, 98-107 (2011).
- Hingorani, S. R., et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer Cell. 4, 437-450 (2003).
- Sloan, E. K., et al. The sympathetic nervous system induces a metastatic switch in primary breast cancer. Cancer Res. 70, 7042-7052 (2010).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
- Morizono, K., et al. Lentiviral vector retargeting to P-glycoprotein on metastatic melanoma through intravenous injection. Nat. Med. 11, 346-352 (2005).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. J. Vis. Exp. (56), e3175 (2011).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. J. Vis. Exp. (52), e2775 (2011).
- Burton, J. B., et al. Adenovirus-mediated gene expression imaging to directly detect sentinel lymph node metastasis of prostate cancer. Nat Med. 14, 882-888 (2008).
- Vezeridis, M. P., Doremus, C. M., Tibbetts, L. M., Tzanakakis, G., Jackson, B. T. Invasion and metastasis following orthotopic transplantation of human pancreatic cancer in the nude mouse. J. Surg. Oncol. 40, 261-265 (1989).
- Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5645-5649 (1992).
- Reyes, G., et al. Orthotopic xenografts of human pancreatic carcinomas acquire genetic aberrations during dissemination in nude mice. Cancer Res. 56, 5713-5719 (1996).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).
- Furukawa, T., Kubota, T., Watanabe, M., Kitajima, M., Hoffman, R. M. A novel "patient-like" treatment model of human pancreatic cancer constructed using orthotopic transplantation of histologically intact human tumor tissue in nude mice. Cancer Res. 53, 3070-3072 (1993).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res. 66, 605-612 (2006).
- Brembeck, F. H., et al. The mutant K-ras oncogene causes pancreatic periductal lymphocytic infiltration and gastric mucous neck cell hyperplasia in transgenic mice. Cancer Res. 63, 2005-2009 (2003).
