Summary
הבנה משופרת של ביולוגיה של סרטן הלבלב היא צורך קריטי כדי לאפשר הפיתוח של אפשרויות טיפוליות טובות יותר לטיפול בסרטן הלבלב. כדי לענות על צורך זה, אנו מדגימים מודל orthotopic של סרטן הלבלב המאפשר ניטור בלתי פולשני של התקדמות הסרטן באמצעות
Abstract
Introduction
סרטן הלבלב הוא הגורם המוביל הרביעי של מוות הקשור לסרטן, עם שיעור הישרדות לאחר 5 שנים של 4-6%. 1,2 רק 15% מהחולים מאובחנים מוקדם מספיק במחלה כדי להיות זכאי לניתוח, וגידולים להישנות ב> 80% מהחולים הללו. 3,4 Gemcitabine משמש לטיפול באדנוקרצינומה בלבלב, לעומת זאת, chemoresistance שכיח ולעתים קרובות יש לתרופת השפעה מועטת על הישרדות כוללת. 5 אסטרטגיות תרופתיות חדשות לטיפול בסרטן הלבלב יש צורך בביקורתיות. פיתוחם תלוי בהבנה השתפרה באופן משמעותי מהצעדים של התקדמות מחלה המרכזיים שעשויות להיות רגישה להתערבות טיפולית.
מודלים orthotopic של סרטן הלבלב לחקות היבטים מרכזיים של המחלות האנושית, מה שהופך אותם אידיאליים לכלי מחקר על הביולוגיה של סרטן הלבלב. 6-9 בניגוד למבחנים במבחנה של התנהגות תא סרטן הלבלב מבוססי תאיםד תת עורית במודלי vivo של סרטן הלבלב, מודלים orthotopic לאפשר חקירה של אינטראקציות תא סרטניים עם microenvironment הלבלב. קינטיקה של התקדמות מחלה הן מאוד לשחזור בדגמי orthotopic ומתרחש על מסגרת זמן קצרה (שבועות), מה שהופך אותם מתאימים היטב לבדיקות טרום קליניות של תרופות חדשות. זאת בניגוד למודלים מהונדסים שבו התפרצות מחלה מתרחשת על פני פרק זמן ארוך יותר ומשתנה יותר (חודשים עד 1 שנה). -10 כאשר בשימוש עם שורות תאים יותר אגרסיביות, יש לי דגמי orthotopic של סרטן לבלב דפוסי גרורות ספונטניות דומים לאלה שראו ב חולים. 8 ביטוי של גני כתב bioluminescent כמו הגחלילית לוציפראז מאפשר ניטור האורך של גידול, הפצה גרורתי, הישנות ותגובה לתרופות. 6,11
כאן אנו מתארים מודל orthotopic של סרטן הלבלב אשר מנצל MatrIgel למסירת תא מקומי ובהדמית פליטת אור vivo לניטור בלתי פולשני של התקדמות גידול. מודל orthotopic זה של סרטן הלבלב מאפשר ניתוחים לא פולשנית של התקדמות מחלה ותגובה להתערבויות טיפוליות במודלי syngenic או xenograft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול שמפגינים מבוצע תחת הדרכתו ואישורו של הטיפול בבעלי החיים של המוסד של המחבר ועדת שימוש. כל הניסויים מבוצעים בעמידה בכל ההנחיות הרלוונטיות, תקנות וגופים הרגולטוריים.
1. Transducing שורות תאי סרטן הלבלב
- תאי סרטן לבלב transduce להביע לוציפראז כפי שתוארו לעיל. 12,13 PANC-1 ו-1 Capan שורות תאי סרטן לבלב transduced עם הגחלילית לוציפראז משמשים כאן.
הערה: עשוי לשמש גם לוציפראז Renilla או לוציפראז חיידקים.
2. הכנת תא סרטן הלבלב
- תרבות transduced תאי סרטן לבלב עד 70% ומחוברות.
- הרם את תאי הלבלב ולהבטיח את יכולת הקיום היא יותר מ -90%.
- Resuspend ב2 תאי x 10 7 / מ"ל בתערובת של Matrigel 03:02 הצונן: פוספט שנאגרו סאלine (PBS).
- שמור על ההשעיה Matrigel התאים על קרח לפני ההזרקה לתוך הלבלב.
הערות: כדי להבטיח התמצקות מהירה של Matrigel, להפחית את עוצמת קול PBS כדי להסביר את עוצמת הקול של גלולה התא. ידית Matrigel באמצעות מכשירים ומזרקים קרים כקרח בכל העת כדי למנוע התמצקות לפני הזריקה. מספר התא הציע הוא מדריך וצריך להיקבע באופן אמפירי עבור כל שורת תאים.
3. הכנת עכבר
- להרדים את העכבר באמצעות שאיפת 2-3% isoflurane. לקבוע עומק ההרדמה על ידי חוסר הדוושה רפלקס לקמצוץ הבוהן עדין.
- החל סיכה לעיניים, כדי למנוע התייבשות.
- מקם את העכבר על גבה על 37 מעלות צלזיוס וכרית חימום בעדינות להפוך להעלות את הצד השמאלי של בטן העכבר.
- הכן את הבטן עם תמיסת יוד povidone 10%.
הערות: Injectabהרדמה le עשויה לשמש במקום הרדמה נשאפת. הצום טרום ניתוח לא הכרחי.
4. Laparotomy
- שימוש במכשירי ניתוח סטריליים לעשות חתך 1.5 ס"מ בעור כ 1 ס"מ לרוחב משמאל לקו האמצע.
- ביצוע חתך 1.5 ס"מ בשריר הבטן הבסיסי.
- אתר את הטחול באמצעות המלקחיים ולהסיר בעדינות את הטחול מחלל הבטן. אבטח את הטחול יחד קלון צמר גפן סטרילי כדי לחשוף את הלבלב הבסיסי.
- אתר את הזנב של הלבלב בסמוך לטחול.
- באמצעות מזרק אינסולין G 0.3 מ"ל 29, להזריק 20 μl של ההשעיה Matrigel התאים ללבלב.
- בעקבות הזרקה, מחזיק את המזרק בלבלב במשך 30-60 שניות, עד Matrigel יש הקרושה. צעד חשוב זה ממזער זליגת תא.
- בדוק את האתר של הזרקה כדי להבטיח שאין דליפה התרחשה.
- להחזיר את הטחול והלבלב לחלל הבטן.
שים לב: שמור על עצמך כדי למנוע ניקוב צד הגב של הלבלב שעלולה להיות רזה.
5. סגירת דופן בטן
- סגור את שרירי הבטן של העכבר עם תפר 4-0 קלוע נספג במחט סיבוב באמצעות תפר מתמשך.
- סגור את העור החיצוני עם תפר 6-0 חוט חד שאינם נספג במחט חיתוך באמצעות תפר מתמשך.
- הסר את העכבר מחומר ההרדמה בשאיפה והזריקו עצירות 0.05-0.1 מ"ג / ק"ג תת עורי.
- אפשר העכבר כדי להתאושש בכלוב שלה מונח על 37 מעלות צלזיוס עם כרית חימום גישה החופשית למזון ומים. אם עכברים מראים סימנים של כאב כגון קמר או ניידות מוגבלת, יכולים להינתן עצירות כל שעה 12 על פני תקופה שעות 36.
- לאחר ריפוי פצע (7-10 ימים), להרדים את העכבר ולהסיר את התפרים החיצוניים.
6. מעקב bioluminescent של canc הלבלבהתקדמות ER
- להרדים את העכבר באמצעות שאיפת isoflurane.
- להזריק 150 מ"ג / ק"ג D-luciferin דרך וריד זנב.
- מניחים את העכבר במערכת ההדמיה bioluminescent וללכוד לבן אור ופליטת אור תמונות כפי שתואר לעיל. 14,15
- הסר את העכבר מחומר ההרדמה בשאיפה ולאפשר לו להתאושש בכלוב בביתה.
הערה: ההדמיה Bioluminescent אינה פולשני וניתן לבצע מעת לעת כדי לחקור קינטיקה צמיחת גידול. לגידול תמונה בזנב הלבלב שזה חשוב לשים את העכבר בצד השמאל שלה, ולכן את הנקודות הסרטניים לכיוון המצלמה. אנחנו צילמו פעם בשבוע עם התדירות מוגברת עד שלוש פעמים בשבוע לפני נקודת סיום הניסוי באמצעות ומינה השנייה הדמיה מערכת (פרקין אלמר, לשעבר Caliper מדעי חיים) פועלת תוכנת 4.3.1 הדמיה לחיות עם 4 binning, FOV 12.5, F-stop 1, חשיפה 1-60 שניות (שנקבע על ידי Exp הגבוה ביותרosure בלי הרוויה פיקסל).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטה זו מתארת מודל orthotopic של סרטן הלבלב באמצעות הליכים כירורגיים, כולל אינדוקציה של הרדמה, laparotomy, הזרקה של תאים סרטניים ובסגירת Matrigel בטן (איור 1 א). את התאים המוזרקים בצורת בועה בשטח של הלבלב (איור 1). התקדמות סרטן הלבלב עשויה להיות הלא פולשני בפיקוח באמצעות הדמיה פליטת אור vivo כדי לעקוב אחר התפשטות סרטן תאים והפצה (איור 2). גרורות בכבד היה מצויינים על ידי תצפית של פליטת אור בכבד במהלך כריתה כירורגית (איור 2) ואישר vivo לשעבר ביסטולוגיה (איור 4). גידולים ראשוניים היו לכרות את גידול עם זנב הלבלב וטחול בגיל 6 שבועות לאחר השתלה. דינמיקת גדילת גידול במודל זה הן הזרקת orthotopic לשעתק ודומה מאוד לקינטיקה של דגמי השתלת orthotopic של הרשות הפלסטינית סרטן ncreatic (איור 3). גידול בלבלב באופן מקומי הוא פולשנית ושולח גרורות לאיברים כולל כבד (איור 4).
איור 1. מודל orthotopic עכבר של התקדמות סרטן הלבלב.) ט. העכבר הרדים קבוע במקום באמצעות קלטת והבטן היא לחטא. השני. לאחר laparotomy אורך הטחול וזנב הלבלב exteriorized עדינות והחזיקו במקום על מקלון צמר גפן סטרילי. ג. תאים סרטניים בלבלב Matrigel-משובצים מוזרקים לתוך זנב הלבלב. IV. הבטן סגורה בשתי שכבות. תמונת B) מראה מוגדל טחול ולבלב exteriorized. את התאים המוזרקים יוצרים בועה (ראש החץ). ftp_upload/50395/50395fig1large.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. ההדמיה bioluminescent של גידול בלבלב orthotopic (א) עשרה ימים לאחר הזרקה, (ב) 31 ימים לאחר הזרקה, ו (ג) חמישה ימים לאחר כריתת גידול.
איור 3. בצמיחת גידול ראשונית vivo של Capan-1 שורות תאי PANC-1 והיה פיקוח לאורך זמן (ימים לאחר הזרקה) על ידי הדמיה פליטת אור (n = 4). קינטיקה של גידול לאחר הזרקה של תאים סרטניים בלבלב Matrigel-מוטבע דומים למודלי orthotopic באמצעות השתלה של חלקים סרטניים בלבלב.
_upload/50395/50395fig4.jpg "alt =" איור 4 "/>
איור 4. Hematoxylin וחתכים eosin מוכתם של (א) גידול בלבלב העיקרי PANC-1, ו (ב) גרורות בכבד מPANC-1 גידול בלבלב ראשי. * פלישה מקומית של תאי סרטן לבלב לאיברים שמסביב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים מודל orthotopic להערכת אורך של התפתחות גידולי לבלב והתקדמות. קינטיקה צמיחת גידול הראשונית הן שחזור (איור 3) ועשויה להיות הלא פולשני פיקוח באמצעות הדמיה פליטת אור של תאי לוציפראז-מתויגים, לדוגמה, עבור ניתוחים של תגובת גידול לתרופות לסרטן לבלב אנטי רומן. עולה בקנה אחד עם המחלות של בני אדם, המודל מראה פלישת לבלב מקומית (איור 4 א) המאפשרת חקירה של אינטראקציות תא סרטניים עם microenvironment הלבלב. השימוש בשורות תאי לוציפראז-מתויגים מאפשרת ניתוח של תדירות, מיקום וקינטיקה של הפצה גרורתי. שימוש בשורות תאי לוציפראז-מתויגים מאפשרת זיהוי של גרורות לפני שהם הופכים לכאורה מבחינה ויזואלית ולוקליזציה של גרורות ברקמה עשויה להיות מאושרת על ידי לשעבר vivo הדמיה והיסטולוגיה. כמו בסיטואציה הקלינית, המודל מראה גרורות לorgעוז, כולל בלוטות הלימפה mesenteric, כבד, מערכת העיכול וחלל הצפק (איור 4). הדמיה פליטת אור 8 עשוי לשמש גם כדי לקבוע כריתה מוצלחת, ושכיחות וקינטיקה של הישנות גידול ראשוניים (איור 2 ג). 16
הכנה וטיפול בתאי סרטן לבלב זהירה הוא חיונית לשחזור של הדגם. היחס של Matrigel לPBS כבר מותאם להתמצקות מהירה של התא גלולה לאחר הזרקה. נפח תאי pelleted (כ -35 μl במשך 10 7 תאים סרטניים) צריך להיות מופחת מהנפח של PBS ליחס 3:2 סופי של Matrigel: תאים + PBS. במהלך הזרקה, דליפת תא למנוע על ידי שמירה על המחט באתרו במשך 30-60 שניות עד Matrigel בסס (איור 1). אם דליפה מתרחשת שהוא זוהה בקלות כמו Matrigel הוא צבעוני והעכברים האלה עשויים להיות שליליים וניתוחים נוספים ROM. מניעת זליגה של תאי גידול מבטיחה כי גרורות מתרחשת מהפצת תאים סרטנית ולא כתוצר של טכניקת ההזרקה.
קינטיקה של התפתחות גידול תושפע ממספר התאים מוזרקים וצריך להיקבע באופן אמפירי עבור כל שורת תאים. מצאנו דפוסי צמיחת גידול לשחזור לאחר הזרקה של 4 10 5 PANC-1 או Capan-1 תאי x (איור 3). הסף לזיהוי bioluminescent של גרורות יהיה מושפע ממאפיינים של הביטוי המשמש לבנות כולל כוח האמרגן והשימוש בלוציפראז קודון, אופטימיזציה. בנוסף למודלים xenograft המתוארים כאן, בטכניקות יכולים לשמש גם עם שורות תאי לבלב syngenic לבחון התקדמות לבלב בהגדרת immunocompetent. דינמיקת גידול דומות נצפתה בעכברים ממין זכר או נקבה (מידע לא מוצג).
השיטה מתוארת הואמחדש כבר שונה למודל השתלת orthotopic של סרטן הלבלב. במודל זה, גידולים גדלים מתחת לעור בעכברים תורמים, אז חתיכת 1 מ"מ 3 היא מושתל לתוך כיס קטן בזנב הלבלב של עכבר נמען. 6-8,17 צמיחת גידול ראשונית עשויים להיות פיקוח באמצעות הדמיה פליטת אור באמצעות גידולים תורמים נגזר מתאי גידול לוציפראז-מתויגים. בניגוד למודל orthotopic המתואר כאן, מודלים השתלה דורשים זמן נוסף (עד לחודש 1) ועכברים נוספים עבור דור של גידולים תורמים. תוצאות תוך שימוש במודלי השתלה עשויות להיות מושפעות מהרכב ההטרוגני של חתיכות סרטניים המושתלות. הראנו כאן כי את הקינטיקה לאחר הזרקה של תאי Matrigel-משובצים דומה למודל המושתל. מודלים השתלה היו בשימוש כדי ללמוד ולהרחיב את דגימות חולה קליניות. 18-21
דגמי orthotopic המתוארים כאן להשלים מהונדס מ 'odels של סרטן הלבלב טרום פולשני וחודרני. 10,22,23 מודלים מהונדסים לסכם היבטים מרכזיים של סרטן הלבלב אנושי, כולל מוטציות אונקוגן אבל מראה השתנות משמעותית בהופעת מחלה (7 שבועות ל> שנה 1). 10,23 מודלים מהונדסים רוב לעשות לא להביע לוציפראז וכך אינם מתאימים בהדמית פליטת אור vivo של התקדמות מחלה. בניגוד לכך, מודלים orthotopic של סרטן הלבלב להראות קינטיקה שחזור של התקדמות גידול ולאפשר ניטור לא פולשני, מה שהופך אותם מתאימים היטב למחקרים טרום קליניים טיפוליים.
גישות טיפוליות חדשות יש צורך קריטי למאבק בשיעורי ההישרדות הנמוכים במיוחד לטיפול בסרטן הלבלב. על ידי התרת הדמיה של מחלה גרורתית חוזרת, דגמי orthotopic של סרטן הלבלב שתוארו כאן הם רלוונטיים להגדרה הקלינית, שבו רוב הטיפולים שוטפים הם פליאטיבי. בנוסף, מודלים orthotopicהם בעלי ערך רב לחקר ביולוגיה של גידול בלבלב והערכת אסטרטגיות טיפוליות חדשניות בהגדרת vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי ביטוח הבריאות הממלכתית ומועצה למחקר רפואית, אוסטרליה (1008865), מועצה למחקר האוסטרלי (LE110100125), המכון הלאומי לסרטן (CA138687-01), אריקה סלואן נתמך על ידי מלגה בתחילת קריירה מהלאומי לסרטן השד קרן, אוסטרליה. קורינה קים-פוקס נתמך על ידי מענק מהליגה שוויצרי הסרטן ומלגת HDR ממונש מכון למדעי תרופות. Angst אליאן נתמך על ידי מענק מרן סרטן הליגה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clean Bench coat | |||
| Heating pad | Set to 37 °C | ||
| Ivis Lumina ll Bioluminescent imager | Caliper | Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab) | |
| Dissecting scissors | |||
| Iris forceps (serrated) | |||
| Needle holder | |||
| 27 G 0.3 ml insulin syringe | Terumo | T35525M2913 |
References
- American Cancer Society. Facts and Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Hariharan, D., Saied, A., Kocher, H. M. Analysis of mortality rates for pancreatic cancer across the world. HPB (Oxford). 10, 58-62 (2008).
- Li, D., Xie, K., Wolff, R., Abbruzzese, J. L. Pancreatic cancer. Lancet. 363, 1049-1057 (2004).
- Oettle, H., et al. Adjuvant chemotherapy with gemcitabine vs observation in patients undergoing curative-intent resection of pancreatic cancer: a randomized controlled trial. JAMA. 297, 267-277 (2007).
- Andersson, R., et al. Gemcitabine chemoresistance in pancreatic cancer: molecular mechanisms and potential solutions. Scand. J. Gastroenterol. 44, 782-786 (2009).
- Angst, E., et al. Bioluminescence imaging of angiogenesis in a murine orthotopic pancreatic cancer model. Mol. Imaging Biol. 12, 570-575 (2010).
- Angst, E., et al. N-myc downstream regulated gene-1 expression correlates with reduced pancreatic cancer growth and increased apoptosis in vitro and in vivo. Surgery. 149, 614-624 (2011).
- Hotz, H. G., et al. An orthotopic nude mouse model for evaluating pathophysiology and therapy of pancreatic cancer. Pancreas. 26, 89-98 (2003).
- Partecke, L. I., et al. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the Panc02 and 6606PDA cell lines. Eur. Surg. Res. 47, 98-107 (2011).
- Hingorani, S. R., et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer Cell. 4, 437-450 (2003).
- Sloan, E. K., et al. The sympathetic nervous system induces a metastatic switch in primary breast cancer. Cancer Res. 70, 7042-7052 (2010).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
- Morizono, K., et al. Lentiviral vector retargeting to P-glycoprotein on metastatic melanoma through intravenous injection. Nat. Med. 11, 346-352 (2005).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. J. Vis. Exp. (56), e3175 (2011).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. J. Vis. Exp. (52), e2775 (2011).
- Burton, J. B., et al. Adenovirus-mediated gene expression imaging to directly detect sentinel lymph node metastasis of prostate cancer. Nat Med. 14, 882-888 (2008).
- Vezeridis, M. P., Doremus, C. M., Tibbetts, L. M., Tzanakakis, G., Jackson, B. T. Invasion and metastasis following orthotopic transplantation of human pancreatic cancer in the nude mouse. J. Surg. Oncol. 40, 261-265 (1989).
- Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5645-5649 (1992).
- Reyes, G., et al. Orthotopic xenografts of human pancreatic carcinomas acquire genetic aberrations during dissemination in nude mice. Cancer Res. 56, 5713-5719 (1996).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).
- Furukawa, T., Kubota, T., Watanabe, M., Kitajima, M., Hoffman, R. M. A novel "patient-like" treatment model of human pancreatic cancer constructed using orthotopic transplantation of histologically intact human tumor tissue in nude mice. Cancer Res. 53, 3070-3072 (1993).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res. 66, 605-612 (2006).
- Brembeck, F. H., et al. The mutant K-ras oncogene causes pancreatic periductal lymphocytic infiltration and gastric mucous neck cell hyperplasia in transgenic mice. Cancer Res. 63, 2005-2009 (2003).
