Summary
Pyrosequencing, बैक्टीरियल प्रजातियों की पहचान जीवाणु उपभेदों भेदभाव, और विरोधी माइक्रोबियल एजेंटों के लिए प्रतिरोध प्रदान कि आनुवंशिक परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि माइक्रोबियल जीनोम अनुक्रमण सुविधा है कि एक बहुमुखी तकनीक है. इस वीडियो में, माइक्रोबियल amplicon पीढ़ी, amplicon pyrosequencing, और डीएनए अनुक्रम विश्लेषण के लिए प्रक्रिया का प्रदर्शन किया जाएगा.
Abstract
Pyrosequencing, बैक्टीरियल प्रजातियों की पहचान जीवाणु उपभेदों भेदभाव और विरोधी माइक्रोबियल एजेंटों के लिए प्रतिरोध प्रदान कि आनुवंशिक परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि माइक्रोबियल जीनोम अनुक्रमण सुविधा है कि एक बहुमुखी तकनीक है. सूक्ष्म जीव विज्ञान के लिए आवेदन पत्र pyrosequencing के फायदे तेजी से और विश्वसनीय उच्च throughput स्क्रीनिंग और रोगाणुओं और सूक्ष्म जीनोम परिवर्तन की सटीक पहचान में शामिल हैं. Pyrosequencing संश्लेषण प्रतिक्रिया के दौरान निगमित विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड जा रहा है का निर्धारण करते समय, पूरक किनारा एक समय में एक ही आधार synthesizing द्वारा डीएनए अनुक्रमण शामिल है. प्रतिक्रिया चार deoxyribonucleotides (dNTP) क्रमिक रूप से जोड़ा गया है और अनिगमित dNTPs संश्लेषण प्रतिक्रिया के बगल dNTP के अलावा पहले enzymatically अपमानित कर रहे हैं, जहां स्थिर एकल असहाय टेम्पलेट डीएनए पर होता है. टेम्पलेट में शामिल विशिष्ट आधार की जांच chemilum की पीढ़ी द्वारा नजर रखी हैinescent संकेत. chemiluminescent संकेत है कि उत्पादन dNTPs के आदेश टेम्पलेट के डीएनए अनुक्रम को निर्धारित करता है. pyrosequencing प्रौद्योगिकी के वास्तविक समय अनुक्रमण क्षमता एक एकल परख में तेजी माइक्रोबियल पहचान के लिए सक्षम बनाता है. इसके अलावा, pyrosequencing साधन, SNPs, बिंदु उत्परिवर्तन, निवेशन, और हटाना, साथ ही कुछ विरोधी माइक्रोबियल प्रतिरोध में हो सकता है कि कई जीन प्रतियों की मात्रा का ठहराव की टाइपिंग सहित विरोधी माइक्रोबियल दवा प्रतिरोध का पूरा आनुवंशिक विविधता, विश्लेषण कर सकते हैं पैटर्न.
Introduction
Pyrosequencing "संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण 'के सिद्धांत पर आधारित है कि अनुक्रम न्यूक्लिक एसिड के लिए एक तेजी से और सही तरीका है. "संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण" एक समय में पूरक किनारा एक आधार synthesize करने के लिए एक भी कतरा डीएनए टेम्पलेट का उपयोग कर, और निगमित आधार (ए, टी, जी, या सी) एक chemiluminescent संकेत का पता लगाने के द्वारा हर कदम पर पता लगाने के शामिल है. pyrosequencing प्रतिक्रिया टेम्पलेट डीएनए, dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), डीएनए पोलीमरेज़, एटीपी sulfurylase, luciferin, luciferase, और apyrase शामिल हैं. संश्लेषण प्रतिक्रिया चार dNTPs और एकल असहाय biotinylated टेम्पलेट डीएनए के लिए डीएनए पोलीमरेज़ में से एक के अलावा द्वारा शुरू की है. डीएनए पोलीमरेज़ पाइरोफॉस्फेट के बाद रिहाई (चित्रा 1) के साथ, टेम्पलेट पर पूरक dNTP को शामिल किया गया. एटीपी sulfurylase अनुपात में एटीपी को पाइरोफॉस्फेट धर्मान्तरित. एटीपी जो oxyluciferin, को luciferin के luciferase की मध्यस्थता रूपांतरण के लिए एक उत्प्रेरक के रूप में कार्य करता हैप्रकाश (चित्रा 2) उत्पन्न करता है. प्रकाश की तीव्रता शामिल nucleotides की संख्या के लिए आनुपातिक है और एक या एक से अधिक विशिष्ट dNTP के (dATP, dTTP, dGTP, या dCTP) क्रमिक टेम्पलेट किनारा (चित्रा 3) पर मौजूद है निर्धारित करता है. कोई अनिगमित dNTP पहले संश्लेषण प्रतिक्रिया को जारी रखने के लिए अगले dNTP के अलावा apyrase द्वारा अपमानित है. एकल असहाय डीएनए टेम्पलेट के डीएनए अनुक्रम निर्धारित किया जाता है जब तक यह "संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण" प्रतिक्रिया चार dNTPs में से प्रत्येक के अलावा के साथ दोहराया है.
Pyrosequencing प्रतिक्रिया का एक एनीमेशन देखने के लिए फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Protocol
परिचय: एक ही बैक्टीरियल कॉलोनी रातोंरात incubated है कि एक उचित संस्कृति शोरबा टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. एक बैक्टीरिया गोली तो एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीनोमिक अलगाव किट का उपयोग जीनोमिक डीएनए को शुद्ध करने के लिए कार्रवाई की है. शुद्ध जीनोमिक डीएनए एक 260/280 (एनएम) अनुपात नमूना प्रोटीन प्रदूषण से मुक्त है विश्वास दिलाता हूं कि> 1.8 होना चाहिए. pyrosequencing टेम्पलेट की पीढ़ी के लिए आवश्यक जीनोमिक डीएनए की मात्रा 10-20 एनजी है.
टेम्पलेट के ए प्रवर्धन
(PyroMark पीसीआर हैंडबुक, www.qiagen.com / हैंडबुक 1)
पीसीआर प्रतिक्रिया स्थापना
ध्यान दें: एक प्राइमर अपने 5 'अंत में biotinylated किया जाना चाहिए, और यह कि यह टेम्पलेट तैयार करने के लिए शुद्ध एचपीएलसी हो कि सिफारिश की है. हम पीसीआर और सेवा क्षेत्र के लिए PyroMark परख डिजाइन सॉफ्टवेयर 2.0 की सिफारिशकम पढ़ने अनुक्रमण के लिए अनुकूलित कर रहे हैं कि quence प्रथम डिजाइन, तथापि, प्राइमर बम का विस्फोट ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome एन सी बी आई से) भी कर सकते हैं प्रथम डिजाइन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- सभी आवश्यक समाधान (1 टेबल में सूचीबद्ध) पिघलना और प्रत्येक मिश्रण अच्छी तरह से. 1 टेबल के अनुसार प्रतिक्रिया सेट करें. सभी काम के कमरे के तापमान पर किया जा सकता है.
नोट: पीसीआर मास्टर मिक्स ज्यादातर मामलों में संतोषजनक परिणाम प्रदान करता है जो 1.5 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 2 MgCl शामिल हैं. एक उच्च 2 मिलीग्राम + एकाग्रता की आवश्यकता है, 25 मिमी 2 MgCl के ऊपर से 3.5 μl एक प्रतिक्रिया के लिए जोड़ा जा सकता है.
- अच्छी तरह से धीरे नीचे pipetting और से प्रतिक्रिया मिश्रण मिश्रण, तो पीसीआर ट्यूब में उचित मात्रा में बांटना.
- Templat जोड़ेंप्रत्येक पीसीआर ट्यूब को ई डीएनए. हम जीनोमिक डीएनए के 10 एनजी सलाह देते हैं.
- तालिका 2 के अनुसार थर्मल cycler कार्यक्रम. 4 में एक अंतिम पकड़ डिग्री सेल्सियस सुविधा के लिए सिफारिश की है. 100 μl खनिज तेल के साथ एक गर्म ढक्कन के बिना एक थर्मल cycler का उपयोग करते हैं, ओवरले प्रतिक्रियाओं.
- Cycler में पीसीआर ट्यूब प्लेस और साइकिल कार्यक्रम शुरू करते हैं.
बी वैक्यूम कार्य केंद्र प्रोटोकॉल
Biotinylated पीसीआर उत्पादों immobilizing
- चित्रा 4 के अनुसार एक मास्टर मिश्रण बनाओ.
नोट: pipetting से पहले, धीरे से एक समरूप निलंबन सुनिश्चित करने के लिए streptavidin में लिपटे Sepharose मोतियों की बोतल हिला.
- इस्तेमाल किया पीसीआर उत्पाद की मात्रा पर निर्भर करता है, अच्छी तरह से प्रति 80 μl की कुल मात्रा देने के लिए एक पीसीआर थाली के प्रत्येक कुएं में 60-75 μl मास्टर मिश्रण बांटना.
- प्रत्येक अच्छी तरह से 5-20 μl biotinylated पीसीआर उत्पाद जोड़ें.
- पट्टी क्षमताओं के साथ कुओं सीलएक कक्षीय प्रकार के बरतन का उपयोग कर कमरे के तापमान (15-25 डिग्री सेल्सियस) पर 5-10 मिनट के लिए 1400 rpm पर पीसीआर प्लेट पी एस और आंदोलन.
डीएनए का विकृतीकरण और प्राइमर अनुक्रमण के अलावा
- बफर annealing साथ 0.3 माइक्रोन तक अनुक्रमण प्राइमरों पतला और एक प्रतिक्रिया थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में 25 μl बांटना. कार्य केंद्र पर थाली रखें.
- चित्रा 5 चित्र के अनुसार कार्य केंद्र नली भरें.
- वैक्यूम पंप को चालू करें, और निर्वात उपकरण पर स्विच (चित्रा 6) पर करने के लिए सेट कर दिया जाता है सुनिश्चित करें. गर्त 5 में उच्च शुद्धता पानी (मिल्ली क्यू 18.2 मेगावाट एक्स सेमी या समकक्ष) (चित्रा 5) के साथ फिल्टर जांच फ्लश. चरण 12 में उपयोग के लिए नए सिरे से उच्च शुद्धता पानी के साथ फिर से भरना गर्त.
- जल्दी से कार्य करना, कार्य केंद्र पर मोतियों के साथ पीसीआर प्लेट स्थिति. दोनों प्लेटों के नमूने भरी हुई थी जब रूप में एक ही ओरिएंटेशन में हैं सुनिश्चित करें.
- पर वैक्यूम स्विच के साथ, वैक्यूम कम20 सेकंड के लिए या सभी मात्रा aspirated किया गया है जब तक पीसीआर थाली के कुओं में उपकरण. मोती निर्वात उपकरण (चित्रा 7) द्वारा कब्जा कर लिया जाएगा.
- पर अभी भी शून्य के साथ, 20 सेकंड के लिए 70% इथेनॉल (गर्त 1) के साथ उपकरण फ्लश या सभी मात्रा aspirated किया गया है जब तक.
- पर वैक्यूम के साथ, 20 सेकंड के लिए विकृतीकरण समाधान (गर्त 2) के साथ उपकरण फ्लश या सभी मात्रा aspirated किया गया है जब तक.
नोट: विकृतीकरण समाधान एक आंख और त्वचा अड़चन है जो सोडियम हाइड्रोक्साइड, शामिल हैं. हमेशा एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, और सुरक्षात्मक काले चश्मे पहनते हैं.
- पर वैक्यूम के साथ, 20 सेकंड के लिए धोने बफर (गर्त 3) के साथ उपकरण फ्लश या सभी मात्रा aspirated किया गया है जब तक.
- पर वैक्यूम के साथ, सभी तरल निर्वात उपकरण से बाहर पलायन करने की अनुमति देने के लिए, 5 सेकंड के लिए 90 डिग्री से परे खड़ी करने के लिए वैक्यूम उपकरण बढ़ा. पंप बंद कर देते हैं, और प्रतिक्रिया की थाली के साथ निर्वात उपकरण संरेखित. में निर्वात उपकरण लोअरकुओं और धीरे कुओं युक्त अनुक्रमण प्राइमर में मोतियों को रिहा करने के पक्ष की ओर से हिला.
- निर्वात उपकरण को साफ करने के लिए, 10 सेकंड के लिए उच्च शुद्धता पानी (गर्त 4) में फिल्टर जांच आंदोलन.
- पर वैक्यूम स्विच और सभी मात्रा aspirated किया गया है जब तक कि 20 सेकंड या के लिए उच्च शुद्धता पानी (गर्त 5) के साथ उपकरण फ्लश.
- 5 सेकंड के लिए 90 से परे डिग्री सेल्सियस खड़ी करने के लिए वैक्यूम उपकरण उठाएँ, तो वैक्यूम रवाना स्विच और "पार्किंग" स्थिति में दुकान.
डीएनए किस्में अनुक्रमण प्राइमर एनीलिंग
- एक पूर्व गर्म थाली धारक में प्रतिक्रिया प्लेट रखें.
- 2 मिनट के लिए 80 पर एक हीटिंग ब्लॉक डिग्री सेल्सियस पर प्लेट हीट.
- 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा करने के लिए काउंटर पर धारक और जगह से थाली निकालें.
Pyromark Q24 ऑपरेशन
नोट: बिजली की हड्डी के ऊपर स्थित बिजली स्विच का उपयोग कर साधन को स्विच ऑन करें. सितारामेढा 1 मिनट तक का समय लग सकता है.
- PyroMark गोल्ड Q24 अभिकर्मकों हैंडबुक 2 में दिए गए निर्देशों के अनुसार एक कारतूस भरें. साधन सॉफ्टवेयर में एक चलाने फ़ाइल सेट, आवश्यक मात्रा में निर्धारित करते हैं, और उपकरण मेनू के तहत पूर्व भागो सूचना का चयन करने के लिए
- साधन पर पहले से ही था, यह एक रन प्रदर्शन नहीं कर रहा है कि यह सुनिश्चित करने और फिर ढक्कन खुला. यह ऐसा करने के लिए असुरक्षित है जब ढक्कन खोला है अगर एक श्रव्य चेतावनी संकेत उत्सर्जित हो जाएगा.
- कारतूस गेट खोलें और लेबल (चित्रा 8) आगे का सामना करना पड़ के साथ कारतूस डालने. कारतूस ठीक से (एक लाइन मोर्चे पर दिखाई जानी चाहिए) डाला जाता है कि यह सुनिश्चित करने और गेट बंद कर दें.
- थाली होल्डिंग फ्रेम खोलें और साधन के अंदर नमूनों के साथ थाली की स्थिति.
- थाली होल्डिंग फ्रेम और साधन ढक्कन (चित्रा 9) बंद करें.
एक रन शुरू
- रन फाइल के साथ यूएसबी स्टिक डालेंएस साधन के सामने यूएसबी पोर्ट में साधन सॉफ्टवेयर के साथ बनाया.
- मुख्य मेनू में "भागो" का चयन करें और "ठीक है" दबाएँ.
- वांछित रन फ़ाइल का चयन करें और "चुनें" प्रेस करने के लिए स्क्रॉल तीर.
नोट: साधन सब पूर्व निर्धारित दबाव और तापमान का स्तर (यह कई मिनट लग सकते हैं) तक पहुँच जाता है जब अभिकर्मकों वितरण शुरू हो जाएगा. एक रन के दौरान, साधन स्क्रीन वास्तविक समय में चयनित अच्छी तरह से pyrogram प्रदर्शित करता है. अन्य कुओं की pyrogram देखने के लिए स्क्रॉल तीर.
एक रन पूरा करने
- साधन रन समाप्त हो गया है कि पुष्टि करता है और रन फ़ाइल यूएसबी स्टिक को बचा लिया गया है, "बंद" दबाएँ.
- यूएसबी स्टिक निकालें. दौड़ समाप्त करने से पहले इसे हटा दिया गया था, यूएसबी स्टिक लगाएं. "प्रशासन" और फिर "कॉपी क़तार रन" का चयन करें.
- चलाने फाइल अब खोला और साधन सॉफ्टवेयर का उपयोग विश्लेषण और तुलना की जा सकतीIdentifire सॉफ्टवेयर का उपयोग ज्ञात रोगाणुओं का एक पुस्तकालय के लिए.
Representative Results
सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक ठेठ pyrosequencing रन का परिणाम amplicon के उत्पादन के लिए प्रयोग किया जाता है आगे और रिवर्स प्राइमरों के स्थान पर, और संरक्षित -16 राइबोसोमल अनुक्रम (चित्रा 10) के भीतर pyrosequencing प्रतिक्रिया के लिए इस्तेमाल अनुक्रमण प्राइमर से पता चलता है. प्राइमर के बीच hypervariable अनुक्रम साइटों संरक्षित अनुक्रमण प्राइमर (5'-TACATGCAAGTCGA) का उपयोग बैक्टीरियल प्रजातियों में से एक बड़ी संख्या में बैक्टीरिया की पहचान के लिए अनुमति देता है. एक आंतरिक गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में, डीएनए अनुक्रम bracketing चर क्षेत्र सही डीएनए क्षेत्र का विश्लेषण किया गया है कि आश्वस्त करने के लिए जाँच की जा सकती . pyrosequencing सॉफ्टवेयर बैक्टीरिया की पहचान के लिए बैक्टीरियल ribosomal दृश्यों की एक आंतरिक डेटाबेस से उत्पन्न अनुक्रम की तुलना और संरेखण के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, एक दृश्य एंटीबायोटिक दवा प्रतिरोध प्रदान म्यूटेशनों कि निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है. Helicob की 23S ribosomal जीन में उत्परिवर्तन के उदाहरण के लिए, विश्लेषणacter पाइलोरी एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्रदान कि दो उत्परिवर्तन पैटर्न (GAA या आगा) (चित्रा 11) को दर्शाता है. एक ही रोगी से कई आइसोलेट्स का विश्लेषण समवर्ती माइक्रोबियल दवा प्रतिरोध फैलने की महामारी की जांच में सहायता करने के लिए समय के साथ दवा प्रतिरोध के उद्भव को ट्रैक करने के लिए assayed किया जा सकता है.
चित्रा 1. Biotinylated पीसीआर उत्पाद पाइरोफॉस्फेट (पीपीआई) की पीढ़ी के लिए अग्रणी, डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा dNTPs शामिल करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है.
चित्रा 2. एटीपी sulfurylase अनुपात में समर्थक है कि प्रकाश उत्पन्न करता है जो oxyluciferin को luciferin के luciferase की मध्यस्थता रूपांतरण, के लिए एक उत्प्रेरक के रूप में एटीपी. एटीपी कृत्यों को पाइरोफॉस्फेट धर्मान्तरितएटीपी की राशि को portional. प्रकाश pyrogram निशान पर चोटी के रूप में दर्ज की गई और न्यूक्लियोटाइड समावेश इंगित करता है. अगले dNTP संश्लेषण की निरंतरता के लिए जोड़ा जाता है पहले अनिगमित dNTPs apyrase द्वारा अपमानित कर रहे हैं.
चित्रा 3. एक या अधिक विशिष्ट dNTP के (dATP, dTTP, dGTP, या dCTP) क्रमिक टेम्पलेट किनारा पर शामिल किया गया था अगर उत्पन्न प्रकाश की तीव्रता को इंगित करता है.
4 चित्रा. Biotinylated पीसीआर उत्पाद स्थिर मास्टर मिश्रण की तैयारी के लिए फ्लो चार्ट.
जीई = "हमेशा"> चित्रा 5. पीसीआर प्लेट, PyroMark थाली, और गर्त स्थानों के साथ PyroMark कार्य केंद्र,.
6 चित्रा. पदों पर और बंद वैक्यूम स्विच का स्थान.
चित्रा 7. वैक्यूम उपकरण. निर्वात उपकरण के समुचित हैंडलिंग.
चित्रा 8. कारतूस गेट जगह में कारतूस के साथ खुला.
9 चित्रा. गेट बंद के साथ कारतूस ठीक से डाला.
10 चित्रा. आधारित बैक्टीरिया की पहचान परिणाम pyrosequencing. पीसीआर प्राइमरों डीएनए टेम्पलेट के संरक्षित क्षेत्रों के लिए तैयार कर रहे हैं, और अनुक्रमण प्राइमर amplicon (नीले रंग में दिखाया गया है) के भीतर एक अच्छी तरह से विशेषता की पहचान hypervariable डीएनए अनुक्रम का अपस्ट्रीम तुरंत तैनात है.
11 चित्रा. Pyrosequencing उपयोग कर हेलिकोबेक्टर में एंटीबायोटिक दवा प्रतिरोध की जांच. GAA या आगा दृश्यों से युक्त हेलिकोबेक्टर में एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्रदान कि 23S जीन में उत्परिवर्तन का विश्लेषण. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
| प्रतिक्रिया प्रति वॉल्यूम | अंतिम एकाग्रता | |
| आतिशबाज़ी पीसीआर मास्टर मिक्स, 2x | 12.5 μl | 1x |
| CoralLoad ध्यान लगाओ, 10x | 2.5 μl | 1x |
| 25 मिमी 2 MgCl (वैकल्पिक) | परिवर्तनीय | ≥ 1.5 मिमी |
| 5x क्यू समाधान, (वैकल्पिक) | 5 μl | 1x |
| प्राइमर ए / प्राइमर बी | वैरिएबल / चर | 0.2 μM/0.2 माइक्रोन |
| RNase मुक्त पानी | परिवर्तनीय | - |
| कुल मात्रा (टेम्पलेट डीएनए जोड़ने के बाद) | 25 μl |
तालिका 1. पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण.
| और nबसपा, | अतिरिक्त टिप्पणियाँ | ||
| प्रारंभिक पीसीआर सक्रियण कदम | 15 मिनट | 95 डिग्री सेल्सियस | HotStartTaq डीएनए पोलीमरेज़ सक्रिय है |
| 3 कदम साइक्लिंग: विकृतीकरण | 30 सेकंड | 94 डिग्री सेल्सियस | |
| एनीलिंग | 30 सेकंड | 60 डिग्री सेल्सियस 56 डिग्री सेल्सियस | जीनोमिक डीएनए के लिए Bisulfite परिवर्तित डीएनए के लिए |
| विस्तार | 30 सेकंड | 72 डिग्री सेल्सियस | |
| चक्रों की संख्या | 45 | ||
| अंतिम विस्तार | 10 मिनट | 72 डिग्री सेल्सियस |
तालिका 2. पीसीआर साइकिल निर्दिष्टीकरण.
Discussion
कई नए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण तरीकों commercialized किया गया है. सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों में से तीन इन तरीकों में से 3-11 प्रत्येक संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण पर निर्भर करता है. आयन अर्धचालक अनुक्रमण, एक अणु वास्तविक समय अनुक्रमण, और संश्लेषण (एसबीएस) द्वारा अनुक्रमण हैं लेकिन निगमित न्यूक्लियोटाइड का पता लगाने के लिए उपन्यास प्लेटफार्मों को रोजगार. आयन अर्धचालक अनुक्रमण में, डीएनए का एक भी कतरा अनुक्रमण कतरा के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है. 12 पोलीमरेज़ और nucleotides क्रमिक pyrosequencing में के रूप में जुड़ जाते हैं. एक न्यूक्लीओटाइड से बढ़ डीएनए किनारा करने के लिए जोड़ा जाता है, एक हाइड्रोजन आयन जारी की है. हाइड्रोजन आयन एक क्षेत्र प्रभाव ट्रांजिस्टर आधारित संवेदक द्वारा पता चला है.
एकल अणु वास्तविक समय अनुक्रमण शून्य मोड लहर गाइड (ZMW) पर निर्भर करता है. 13 ZMW एक भी पोलीमर्स अणु अच्छी तरह से नीचे से जुड़ा हुआ है, जहां एक छोटी संरचना है. ऐसा लगता है कि एक flore इस तरह से उजागर कर रहा हैखुशबू अणु का पता लगाया जा सकता है. प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड एक फ्लोरोसेंट अणु के साथ टैग है. एक fluorescently टैग न्यूक्लियोटाइड शामिल किया जाता है, एक डिटेक्टर न्यूक्लियोटाइड पहचानती है. अगले न्यूक्लियोटाइड जोड़ा जाता है, फ्लोरोसेंट अणु cleaved है. 14
संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण (एसबीएस) अद्वितीय दृश्यों के समूहों उत्पन्न कर रहे हैं कि लक्ष्य डीएनए ऐसे बढ़ाना एक अनोखी विधि का उपयोग करता है. 15 एकल असहाय टेम्पलेट्स उत्पन्न कर रहे हैं और फिर पूरक कतरा संश्लेषित है. प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड एक फ्लोरोसेंट अणु के साथ लेबल है और प्रत्येक बेस इसके बाद जोड़ा बेस के प्रतिदीप्ति दर्ज की गई है.
Disclosures
इस लेख के उत्पादन और नि: शुल्क प्रवेश क्विएज़न द्वारा प्रायोजित है.
लेखक अहमद, Durocher, Jessen और वर्दी इस लेख में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों और उपकरणों का उत्पादन है कि क्विएज़न इंक के कर्मचारी हैं.
Acknowledgments
इस परियोजना के जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय, गेटवे विज्ञान पहल और Qiagen इंक के माध्यम से प्रोवोस्ट के कार्यालय के हिस्से में समर्थन किया गया था
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PyroMark PCR Master Mix, 2x | Qiagen | 978703 | |
| CoralLoad Concentrate, 10x | Qiagen | 978703, 978705 | |
| Q-Solution, 5x | Qiagen | 978703, 978705 | |
| MgCl2, 25 mM | Qiagen | 978703, 978705 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| Primers | Qiagen | 978776 or 978777 | Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM. |
| Pyromark Gold Q24 Reagents | Qiagen | 970802 | |
| High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent) | |||
| Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-07 | |
| PyroMark Annealing Buffer | Qiagen | 979009 | |
| PyroMark Denaturation Solution | Qiagen | 979007 | |
| PyroMark Wash Buffer | Qiagen | 979008 | |
| PyroMark Q24 | Qiagen | 9001514 | |
| PyroMark Q24 Cartridge | Qiagen | 979202 | |
| PyroMark Q96 HS Tip Holder Box | Qiagen | 979105 | |
| PyroMark Q24 Vacuum Workstation | Qiagen | 9001516 | |
| PyroMark Q24 Plate Holder | Qiagen | 9022273 | |
| Orbital shaker | Fisher | 11-675-297 | |
| Heat block | Fisher | 11-718Q |
References
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