Summary
Pyrosequencing er en alsidig teknik, der letter mikrobiel genomsekvensering, der kan bruges til at identificere bakteriearter, diskriminere bakteriestammer, og påvise genetiske mutationer, som giver resistens over for antimikrobielle midler. I denne video, vil proceduren for mikrobiel amplicon generation amplikon pyrosekventering, og DNA sekvensanalyse påvises.
Abstract
Pyrosequencing er en alsidig teknik, der letter mikrobiel genomsekvensering, der kan bruges til at identificere bakteriearter, diskriminere bakteriestammer og påvise genetiske mutationer, som giver resistens over for antimikrobielle midler. Fordelene ved pyrosekventering for Microbiology applikationer omfatter hurtig og pålidelig høj-throughput screening og præcis identifikation af mikrober og mikrobielle genom mutationer. Pyrosequencing indebærer sekventering af DNA ved at syntetisere den komplementære streng en enkelt base ad gangen, mens bestemmelse af specifikke nukleotid blive inkorporeret under syntesen reaktionen. Reaktionen sker på immobiliseret enkeltstrenget skabelon-DNA, hvor de fire deoxyribonucleotider (dNTP'er) tilsættes sekventielt og de inkorporerede dNTP'er er enzymatisk nedbrudt før tilsætning af den næste dNTP til syntesereaktionen. Påvisning af specifikke basen indarbejdet i skabelonen overvåges ved generation af chemiluminescent signaler. Rækkefølgen af dNTP'er, der producerer de kemiluminescerende signaler bestemmer DNA-sekvensen af templaten. Den realtid sekventering evne Pyrosequencing teknologi muliggør hurtig mikrobiel identifikation i en enkelt analyse. Endvidere, det pyrosekventering instrumentet kan analysere den fulde genetiske mangfoldighed af antimikrobiel resistens, herunder indtastning af SNP'er, punktmutationer, insertioner og deletioner, samt kvantificering af multiple genkopier, der kan forekomme i nogle anti-mikrobiel resistens mønstre.
Introduction
Pyrosequencing er en hurtig og præcis metode til sekvens nukleinsyrer, der er baseret på princippet "sekvensering ved syntese". "Sekventering ved syntese" indebærer anvendelse af en enkelt streng DNA-template til at syntetisere den komplementære streng én base ad gangen, og detektion af inkorporeret base (A, T, G eller C) ved hvert trin ved påvisning af et kemiluminescerende signal. Den pyrosekventering Reaktionen omfatter template-DNA, dNTP'er (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA-polymerase, ATP-sulfurylase, luciferin, luciferase og apyrase. Syntesen Reaktionen initieres ved tilsætning af et af de fire dNTP'er og DNA-polymerase til det enkeltstrengede biotinyleret template-DNA. DNA-polymerase inkorporerer komplementære dNTP på skabelonen, med den efterfølgende frigivelse af pyrophosphat (figur 1). ATP-sulfurylase forholdsmæssigt konverterer pyrophosphat til ATP. ATP fungerer som en katalysator for luciferase-medieret omdannelse af luciferin til oxyluciferin, somgenererer lys (figur 2). Intensiteten af lys er proportional med antallet af inkorporerede nukleotider og afgør om en eller flere specifikke dNTP'er (dATP, dTTP, dGTP eller dCTP) er til stede på template-strengen sekventielt (figur 3). Enhver personlige dNTP'er nedbrydes ved apyrase før tilsætning af den næste dNTP til videreførelse af syntesereaktionen. Denne "sekventering ved syntese" reaktion gentages med tilsætning af hver af de fire dNTP'er indtil DNA-sekvensen af den enkeltstrengede DNA-skabelon bestemmes.
For at se en animation af pyrosekventering reaktion Klik her for at se filmen .
Protocol
Indledning: En enkelt bakteriekoloni bør anvendes til at pode en passende dyrkningsmedium, der inkuberes natten over. En bakteriel pellet behandles derefter at oprense genomisk DNA under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt genomisk isolation kit. Den oprensede genomiske DNA bør have en 260/280 (nm) forholdet> 1,8 for at sikre, at prøven er fri for protein kontaminering. Mængden af genomisk DNA, der kræves for generation af pyrosekventering skabelon er 10-20 ng.
A. Forstærkning af Template
(PyroMark PCR Handbook, www.qiagen.com / håndbøger 1)
Opsætning af PCR-reaktionen
Bemærk: En primer skal biotinyleres ved 5'-enden, og det anbefales, at det være HPLC oprenset til skabelon forberedelse. Vi anbefaler PyroMark Assay Design Software 2.0 til PCR og SEkvens primer design, der er optimeret til korte read sekventering dog Primer-BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome ) fra NCBI kan også anvendes til primer design.
- Optø alle nødvendige løsninger (anført i tabel 1), og bland hver grundigt. Opsæt reaktionen i henhold til tabel 1.. Alt arbejde kan udføres ved stuetemperatur.
Bemærk: PCR Master Mix indeholder MgCl2 til en slutkoncentration på 1,5 mM, hvilket giver tilfredsstillende resultater i de fleste tilfælde. Hvis en højere Mg2 +-koncentration er nødvendig, kan op til 3,5 pi 25 mM MgCl2 sættes til en reaktion.
- Bland reaktionsblandingen ved forsigtigt at pipettere op og ned, så Passende mængder kommes PCR-rør.
- Tilføj template DNA til hvert PCR-rør. Vi anbefaler 10 ng genomisk DNA.
- Programmer den termiske variator henhold til tabel 2.. En endelig hold ved 4 ° C anbefales til bekvemmelighed. Hvis du bruger en termiske variator uden opvarmet låg, reaktioner overlay med 100 ul mineralolie.
- Anbring PCR-rørene i cyklusmekanismen og påbegynde cyklussen programmet.
B. Vacuum Workstation Protocol
Immobilisering den biotinylerede PCR-produkter
- Foretag en master blanding ifølge fig. 4.
Bemærk: Før pipettering, rystes flaske streptavidinbelagte sepharoseperler at sikre en homogen suspension.
- Afhængig af mængden af PCR brugte produkt 60-75 pi mester mix dispensere i hver brønd på en PCR plade til at give et samlet volumen på 80 pi per brønd.
- Tilføj 5-20 pi biotinyleret PCR-produkt til hver brønd.
- Seal brøndene med strip caps og agitere PCR plade ved 1.400 rpm i 5-10 minutter ved stuetemperatur (15-25 ° C) under anvendelse af en orbitalryster.
Denaturering af DNA og tilsætning af sekvenseringsprimer
- Fortynde sekventeringsprimere til 0,3 uM med annealingspuffer og dispensere 25 ul i hver brønd på en reaktion plade. Placer pladen på arbejdsstationen.
- Fyld arbejdsstationens trug ifølge figur 5 diagrammet.
- Tænd vakuumpumpen, og sørg for kontakten på vakuum værktøj er indstillet til ON (figur 6). Skyl filteret prober med høj renhed vand (Milli-Q 18.2 MW x cm eller tilsvarende) i truget 5 (figur 5). Refill truget med frisk høj renhed vand til brug i trin 12.
- Arbejde hurtigt, placere PCR plade med perler på arbejdsstationen. Sikre, at begge plader er i samme retning som når prøverne blev fyldt.
- Med vakuum switch ON, sænk vakuumværktøj i brøndene på PCR pladen til 20 sekunder eller indtil alt volumen er blevet aspireret. Perlerne vil blive fanget ved vakuum værktøj (fig. 7).
- Med vakuum stadig ON, skylles værktøjet med 70% ethanol (trug 1) i 20 sekunder eller indtil alt volumen er blevet aspireret.
- Med vakuum ON, skylles værktøj med denatureringsopløsning (trough 2) for 20 sekunder, eller indtil al volumen er blevet aspireret.
Bemærk: Denaturering opløsning indeholder natriumhydroxid, hvilket er et øje og hudirriterende. Altid bære en lab coat, handsker og beskyttelsesbriller.
- Med vakuum ON skylles værktøjet med vaskebuffer (trug 3) for 20 sekunder, eller indtil al volumen er blevet aspireret.
- Med vakuum ON, hæve vakuum redskab til over 90 ° lodret i 5 sekunder for at tillade al væske løbe ud af vakuum værktøj. Slukke pumpen og justere vakuum værktøj med reaktionen plade. Sænk vakuum værktøjet ibrønde og ryst forsigtigt fra side til side for at frigøre perlerne i brøndene indeholdende sekvenseringsprimeren.
- For at rense vakuum værktøj, agitere filteret prober i ultrarent vand (trug 4) i 10 sek.
- Tænd vakuum ON og skyl værktøj med høj renhed vand (trough 5) i 20 sekunder, eller indtil al volumen er blevet aspireret.
- Hæv vakuum redskab til over 90 ° C lodret i 5 sekunder, og derefter skifte vakuum OFF og gemme i stillingen "parkering".
Annealing sekvenseringsprimeren til DNA-strenge
- Placer reaktionspladen i en forvarmet plade holder.
- Anbring pladen på en varmeblok ved 80 ° C i 2 minutter.
- Tag pladen ud af holderen og plads på disken til afkøling ved stuetemperatur i 5 min.
Pyromark Q24 Operation
Bemærk: Tænd for instrumentet på afbryderen placeret over ledningen. Stjernetup kan tage op til 1 min.
- Fyld en patron i henhold til instruktionerne i PyroMark Gold Q24 Reagenser Håndbog 2. For at bestemme mængder, der er nødvendige, nedsat en drive fil i instrumentets software, og under menuen vælge Pre Run Information
- Hvis instrumentet var allerede på, at den ikke udfører en løbetur, og derefter åbne låget. En hørbar advarselssignal lyde, hvis låget åbnes, når det er usikkert at gøre det.
- Åbn patronen porten og indsæt patronen med etiketten vendt fremad (figur 8). Sørg for, at patronen er sat korrekt (en linje skal være synlige på forsiden), og luk lågen.
- Åbn plade bedrift ramme og positionere pladen med prøver inde i instrumentet.
- Luk plade bedrift ramme og instrumentet låg (figur 9).
Start en løbetur
- Sæt USB stick med Kør filens oprettet med instrumentets software i USB-porten på forsiden af instrumentet.
- Vælg "Kør" i hovedmenuen og tryk på "OK".
- Brug piltasterne til at vælge den ønskede run fil, og tryk "Vælg".
Bemærk: Instrumentet vil begynde dispensering reagenser, når alt forudindstillet tryk og temperatur niveauer er nået (dette kan tage flere minutter). Under en løbetur, viser instrumentets skærm pyrogram for det valgte godt i real-tid. Brug pilene for at se pyrogram andre brønde.
Fuldfører en løbetur
- Når instrumentet bekræfter, at kørslen er færdig, og kørslen filen er gemt på USB-stick, tryk på "Close".
- Fjern USB stick. Hvis det blev fjernet, før kørslen færdig, skal du indsætte USB stick. Vælg "Administration" og derefter "Kopier gemte Runs".
- Den kører filen kan nu åbnes og analyseres ved hjælp af instrumentets software og sammenlignettil et bibliotek af kendte mikrober anvender Identifire softwaren.
Representative Results
Resultaterne af en typisk pyrosekventering kørsel ved hjælp af softwaren viser placeringen af de forlæns og baglæns primere anvendt til amplikon generation, og sekvenseringsprimeren anvendes til pyrosekventering reaktion inden den konserverede 16S ribosomale sekvens (figur 10). Den hypervariable sekvens mellem primer bindingssteder giver mulighed for bakteriel identifikation af et stort antal bakteriearter anvender det konserverede sekventeringsprimer (5'-TACATGCAAGTCGA). Som en intern kvalitetskontrol, den variable region DNA-sekvensen bracketing kan kontrolleres for at sikre, at den korrekte DNA-region er blevet analyseret . Den pyrosekventering software giver mulighed for sammenligning og tilpasning af den genererede sekvens til en intern database af bakterielle ribosomale sekvenser for bakteriel identifikation. Desuden kan en sekvens analyseres for at bestemme mutationer, der bibringer antibiotisk resistens. For eksempel analyse af mutationer i 23S ribosomale gener Helicobrakter pylori viser to mutation mønstre (GAA eller AGA), der bibringer antibiotikaresistens (figur 11). Analyse af flere isolater fra den samme patient kan samtidig analyseres til at spore udviklingen af resistens over tid for at hjælpe i epidemiologiske undersøgelser af resistens over for lægemidler udbrud.
Figur 1. Biotinyleret PCR-produkt anvendes som en skabelon til at inkorporere dNTP'er ved DNA-polymerase, hvilket fører til dannelse af pyrophosphat (PPI).
Figur 2. ATP-sulfurylase forholdsmæssigt konverterer pyrophosphat til ATP. ATP fungerer som en katalysator for den luciferase-medieret omdannelse af luciferin til oxyluciferin, der genererer lys, der er proproportional til mængden af ATP. Lyset er registreret som peak på pyrogram trace og indikerer, nukleotid inkorporering. De personlige dNTPs nedbrydes af apyrase før næste dNTP tilsættes til videreførelse af syntesen.
Figur 3. Intensiteten af lyset genereres indikerer, hvis en eller flere specifikke dNTP'er (dATP, dTTP, dGTP eller dCTP) blev inkorporeret i template-strengen sekventielt.
Figur 4.. Flowdiagram for udarbejdelse af master-mix til at immobilisere biotinylerede PCR-produkt.
ge = "altid"> Figur 5. PyroMark arbejdsstation med PCR plade, PyroMark tallerken og trough steder.
Figur 6.. Placeringer af Vacuum tænd og sluk positioner.
Figur 7. Vacuum værktøj. Korrekt håndtering af vakuum værktøj.
Figur 8. Cartridge gate åbnes med patron på plads.
Figur 9. Cartridge isat korrekt med gate lukket.
Figur 10.. Pyrosekventering baserede bakterielle identifikation resultater. PCR primere er designet til konserverede regioner af DNA-template, og sekventeringsprimeren er placeret umiddelbart opstrøms for en velkarakteriseret identificere hypervariable DNA-sekvens inden for amplikon (vist med blåt).
Figur 11. Påvisning af antibiotika resistens i Helicobacter pylori ved hjælp Pyrosequencing. Analyse af mutationer i 23S gener, som giver antibakteriel resistens i Helicobacter pylori indeholder GAA eller AGA-sekvenser. Klik her for at se større figur .
| Volumen pr reaktion | Slutkoncentration | |
| Pyro PCR Master Mix, 2x | 12,5 pi | 1x |
| CoralLoad koncentrat, 10x | 2,5 pi | 1x |
| 25 mM MgCl2 (ekstraudstyr) | Variabel | ≥ 1,5 mM |
| Q-Solution, 5x (ekstraudstyr) | 5 pi | 1x |
| Primer A / Primer B | Variabel / Variable | 0,2 μM/0.2 uM |
| RNase-frit vand | Variabel | - |
| Samlet volumen (efter tilføjelse template-DNA) | 25 ul |
Tabel 1. PCR reaktionsblandingen.
| & Nbsp; | Yderligere kommentarer | ||
| Indledende PCR aktiveringstrin | 15 min | 95 ° C | HotStartTaq DNA Polymerase aktiveres |
| 3 trins cykling: Denaturation | 30 sek | 94 ° C | |
| Annealing | 30 sek | 60 ° C 56 ° C | For genomisk DNA For bisulfit omdannet DNA |
| Extension | 30 sek | 72 ° C | |
| Antal cyklusser | 45 | ||
| Final forlængelse | 10 min | 72 ° C |
Tabel 2. PCR Cycle specifikationer.
Discussion
Flere nye næste generation sekventering metoder er blevet kommercialiseret. Tre af de mest udbredte metoder er ion halvleder sekventering, enkelt molekyle realtid sekventering og sekventering ved syntese (SBS). 3-11 Hver af disse metoder afhænger af sekventering ved syntese, men anvender nye platforme til påvisning af de inkorporerede nukleotider. I ion halvleder sekventering, serverer en enkelt streng af DNA som en skabelon for sekventering streng. 12. Polymerase og nukleotider tilsættes sekventielt som i pyrosekventering. Når en nukleotid tilsættes til den voksende DNA-streng, er en hydrogen-ion frigivet. Hydrogen-ionen detekteres af en felteffekttransistor baseret sensor.
Enkelt molekyle realtid sekventering afhænger nul tilstand bølgeleder (ZMW). 13. ZMW er en lille struktur, hvor en enkelt polymerase molekyle er fastgjort til bunden af brønden. Det belyses på en sådan måde, at en floreduft molekyle kan detekteres. Hver nukleotid er kodet med et fluorescerende molekyle. Som en fluorescerende mærkede nukleotid inkorporeres, en detektor identificerer nukleotidet. Når den næste nucleotid tilsættes, er den fluorescerende molekyle spaltes. 14.
Sekventering ved syntese (SBS) bruger en unik metode til at opformere mål-DNA'et, således at klynger af unikke sekvenser genereres. 15 Single templates genereres og derefter den komplementære streng syntetiseres. Hvert nukleotid er mærket med et fluorescerende molekyle og efter hver basetilsætning fluorescensen af den tilsatte base registreres.
Disclosures
Produktion og fri adgang til denne artikel er sponsoreret af Qiagen.
Forfattere Ahmed, Durocher, Jessen og Vardi er medarbejdere i Qiagen Inc., der producerer reagenser og instrumenter, der anvendes i denne artikel.
Acknowledgments
Dette projekt var støtte delvist ved Johns Hopkins University, Kontoret for Provost gennem Gateway Science Initiative og Qiagen Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PyroMark PCR Master Mix, 2x | Qiagen | 978703 | |
| CoralLoad Concentrate, 10x | Qiagen | 978703, 978705 | |
| Q-Solution, 5x | Qiagen | 978703, 978705 | |
| MgCl2, 25 mM | Qiagen | 978703, 978705 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| Primers | Qiagen | 978776 or 978777 | Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM. |
| Pyromark Gold Q24 Reagents | Qiagen | 970802 | |
| High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent) | |||
| Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-07 | |
| PyroMark Annealing Buffer | Qiagen | 979009 | |
| PyroMark Denaturation Solution | Qiagen | 979007 | |
| PyroMark Wash Buffer | Qiagen | 979008 | |
| PyroMark Q24 | Qiagen | 9001514 | |
| PyroMark Q24 Cartridge | Qiagen | 979202 | |
| PyroMark Q96 HS Tip Holder Box | Qiagen | 979105 | |
| PyroMark Q24 Vacuum Workstation | Qiagen | 9001516 | |
| PyroMark Q24 Plate Holder | Qiagen | 9022273 | |
| Orbital shaker | Fisher | 11-675-297 | |
| Heat block | Fisher | 11-718Q |
References
- PyroMark PCR Handbook. , [about 27p.]. Available from: http://www.qiagen.com/handbooks (2009).
- PyroMark Q24 User Manual. , [about 27p.]. Available from: http://www.qiagen.com/handbooks (2012).
- Elahi, E., Ronaghi, M. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).
- Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).
- Langaee, T., Ronaghi, M. Genetic variation analyses by pyrosequencing. Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).
- Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis. Nucleic Acids Res. 35 (18), e120 (2007).
- Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes. J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).
- J, Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
- Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data. Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).
- Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release. Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).
- King, C., Scott-Horton, T. Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping. J. Vis. Exp. (11), e630 (2008).
- Rothberg, J. W., Heinz,, et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
- Eid, J., Fehr, A. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
- Sequencing Technology | Sequencing by Synthesis | Illumina [Internet]. , Illumina. Available from: http://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn (2012).
