Pyrosequencing is een veelzijdige techniek die microbiële genoom die kan worden gebruikt om bacteriële species te identificeren, discrimineren bacteriestammen en detecteren genetische mutaties die resistentie tegen antimicrobiële middelen vergemakkelijkt. In deze video, zal de procedure voor microbiële amplicon generatie, amplicon pyrosequencing, en DNA-sequentie-analyse worden aangetoond.
Pyrosequencing is een veelzijdige techniek die microbiële genoom die kan worden gebruikt om bacteriële species te identificeren, onderscheiden bacteriestammen en detecteren genetische mutaties die resistentie tegen antimicrobiële middelen vergemakkelijkt. De voordelen van pyrosequentiebepaling voor microbiologie toepassingen zijn onder meer een snelle en betrouwbare high-throughput screening en accurate identificatie van microben en microbiële genoom mutaties. Pyrosequencing omvat sequentiebepaling van DNA door het synthetiseren van de complementaire streng een basisstation tegelijk, het bepalen van de specifieke nucleotide wezen opgenomen tijdens de synthesereactie. De reactie op geïmmobiliseerd enkelstrengs matrijs-DNA waar de vier deoxyribonucleotiden (dNTP) achtereenvolgens toegevoegd en de niet opgenomen dNTP enzymatisch afgebroken vóór toevoeging van de volgende dNTP de synthesereactie. Detectie van de specifieke base opgenomen in de sjabloon wordt gecontroleerd door generatie chemiluminescent signalen. De volgorde van dNTPs die de chemiluminescerende signalen produceren bepaalt de DNA sequentie van de matrijs. De real-time sequencing vermogen van pyrosequencing technologie maakt snelle microbiële identificatie in een enkele assay. Bovendien is de pyrosequencing instrument kan analyseren volledige genetische diversiteit van antimicrobiële resistentie, inclusief de typering van SNPs, puntmutaties, inserties en deleties, en kwantificering van meerdere genkopieën voordoen bij sommige antimicrobiële resistentie patronen.
Pyrosequencing is een snelle en accurate manier om sequentie nucleïnezuren die is gebaseerd op het principe van "sequentiebepaling door synthese". "Sequencing door synthese" omvat met een enkelstrengs DNA-matrijs van de complementaire streng een basisstation tegelijk synthetiseren, en het detecteren van de opgenomen base (A, T, G of C) bij elke stap door detectie van een chemiluminescent signaal. Het reactiemengsel omvat pyrosequentiebepaling matrijs DNA, dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA-polymerase, ATP sulfurylase, luciferine, luciferase en apyrase. De synthese reactie wordt geïnitieerd door de toevoeging van een van de vier dNTP's en DNA polymerase de enkelstrengige gebiotinyleerde matrijs-DNA. DNA polymerase bevat de aanvullende dNTP op de mal, met de daaropvolgende afgifte van pyrofosfaat (figuur 1). ATP sulfurylase zet de verhouding pyrofosfaat aan ATP. ATP werkt als een katalysator voor de luciferase-gemedieerde omzetting van luciferine tot oxyluciferine, welkegenereert licht (figuur 2). De intensiteit van het licht is evenredig met het aantal nucleotiden opgenomen en bepaalt of een of meer specifieke dNTP's (dATP, dTTP, dGTP en dCTP) aanwezig op de matrijsstreng achtereenvolgens (figuur 3) is. Eventuele niet opgenomen dNTP wordt afgebroken door apyrase vóór toevoeging van de volgende dNTP voor de voortzetting van de synthesereactie. Deze "sequentiebepaling door synthese" reactie wordt herhaald met toevoeging van elk van de vier dNTPs tot de DNA-sequentie van het enkelstrengs DNA-matrijs wordt bepaald.
Om een animatie van de pyrosequentiebepaling reactie te bekijken Klik hier om de film te bekijken .
Verschillende nieuwe next generation sequencing methoden zijn gecommercialiseerd. Drie van de meest gebruikte methoden ion halfgeleider sequencing, molecuul realtime sequencing en sequentiebepaling door synthese (SBS). 3-11 Elk van deze werkwijzen afhankelijk van sequentiebepaling door synthese maar investeren nieuwe platforms voor de detectie van de opgenomen nucleotiden. In ion halfgeleider sequencing, een enkele streng van DNA dient als een matrijs voor de sequentiebepaling streng. 12 Polymerase en nucleotiden opeenvolgend in pyrosequencing toegevoegd. Wanneer een nucleotide wordt toegevoegd aan de groeiende DNA-streng, is een waterstof-ion vrijgegeven. De waterstof ionen wordt gedetecteerd door een veldeffect transistor gebaseerde sensor.
Single molecule realtime sequencing afhankelijk van de nul-stand golfgeleider (ZMW). ZMW 13 is een kleine structuur waarin een polymerase molecule is bevestigd aan de bodem van de put. Het wordt belicht zodanig dat een floregeur molecuul kan worden gedetecteerd. Elke nucleotide is gelabeld met een fluorescerend molecuul. Als fluorescent gelabeld nucleotide wordt geïncorporeerd, een detector identificeert de nucleotide. Wanneer de volgende nucleotide wordt toegevoegd, wordt de fluorescerende molecule gesplitst. 14
Sequentiebepaling door synthese (SBS) maakt gebruik van een unieke methode voor het amplificeren van de doelwit DNA zodat clusters van unieke sequenties worden gegenereerd. Single 15 matrijzen worden gegenereerd en de complementaire streng wordt gesynthetiseerd. Elk nucleotide wordt gelabeld met een fluorescerend molecuul en na elke toevoeging base de fluorescentie van de toegevoegde base wordt opgenomen.
The authors have nothing to disclose.
Dit project was steun voor een deel door de Johns Hopkins University, Bureau van de provoost via de Gateway Science Initiative en Qiagen Inc
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
PyroMark PCR Master Mix, 2x | Qiagen | 978703 | |
CoralLoad Concentrate, 10x | Qiagen | 978703, 978705 | |
Q-Solution, 5x | Qiagen | 978703, 978705 | |
MgCl2, 25 mM | Qiagen | 978703, 978705 | |
RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
Primers | Qiagen | 978776 or 978777 | Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM. |
Pyromark Gold Q24 Reagents | Qiagen | 970802 | |
High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent) | |||
Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-07 | |
PyroMark Annealing Buffer | Qiagen | 979009 | |
PyroMark Denaturation Solution | Qiagen | 979007 | |
PyroMark Wash Buffer | Qiagen | 979008 | |
PyroMark Q24 | Qiagen | 9001514 | |
PyroMark Q24 Cartridge | Qiagen | 979202 | |
PyroMark Q96 HS Tip Holder Box | Qiagen | 979105 | |
PyroMark Q24 Vacuum Workstation | Qiagen | 9001516 | |
PyroMark Q24 Plate Holder | Qiagen | 9022273 | |
Orbital shaker | Fisher | 11-675-297 | |
Heat block | Fisher | 11-718Q |