Pyroséquençage est une technique polyvalent qui facilite le séquençage du génome microbien qui peut être utilisé pour identifier des espèces bactériennes, de discriminer les souches bactériennes, et de détecter des mutations génétiques qui confèrent une résistance aux agents anti-microbiens. Dans cette vidéo, la procédure pour la production microbienne de l'amplicon, amplicon pyrosequencing et analyse de la séquence d'ADN sera démontrée.
Pyroséquençage est une technique polyvalent qui facilite le séquençage du génome microbien qui peut être utilisé pour identifier des espèces bactériennes, de discriminer les souches bactériennes et de détecter des mutations génétiques qui confèrent une résistance aux agents anti-microbiens. Les avantages de pyroséquençage pour des applications microbiologiques comprennent criblage à haut débit rapide et fiable et une identification précise des microbes et des mutations du génome microbien. Pyroséquençage comprend le séquençage de l'ADN en synthétisant le brin complémentaire d'une base unique à la fois, tandis que la détermination de l'être nucléotidique spécifique incorporé au cours de la réaction de synthèse. La réaction se produit sur la matrice ADN simple brin immobilisé, où les quatre désoxyribonucléotides (dNTP) sont ajoutés de façon séquentielle et les dNTP non incorporées sont dégradés par voie enzymatique avant l'addition de la prochaine dNTP à la réaction de synthèse. Détection de la base spécifique incorporé dans la matrice est contrôlée par la génération d'chemilumsignaux inescent. L'ordre des dNTP qui produisent des signaux chimiluminescents détermine la séquence d'ADN de la matrice. La capacité de séquençage en temps réel de la technologie de pyroséquençage permet l'identification microbienne rapide dans un seul essai. En outre, l'instrument pyroséquençage, permet d'analyser la diversité génétique complète de la résistance aux médicaments anti-microbienne, y compris le typage des SNP, mutations ponctuelles, insertions et suppressions, ainsi que la quantification de multiples copies du gène qui peuvent survenir dans une certaine résistance anti-microbienne motifs.
Pyroséquençage est une méthode rapide et précise aux acides nucléiques de séquence qui est basé sur le principe de la "séquençage par synthèse". "Le séquençage par synthèse" implique l'utilisation d'une seule matrice d'ADN de brin pour synthétiser le brin complémentaire d'une base en même temps, et la détection de la base constituée (A, T, G ou C), à chaque étape de détection d'un signal chimiluminescent. La réaction pyroséquençage comprend matrice d'ADN, dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), l'ADN polymérase, ATP sulfurylase, la luciférine, la luciférase, et apyrase. La réaction de synthèse est initiée par l'addition de l'un des quatre dNTP et de l'ADN polymérase de l'ADN matrice simple brin biotinylé. ADN polymérase incorpore le dNTP complémentaire sur le modèle, avec la libération subséquente de pyrophosphate (figure 1). ATP sulfurylase convertit proportionnellement le pyrophosphate à l'ATP. ATP agit comme un catalyseur pour la conversion de l'intermédiaire de luciférase de la luciférine à oxyluciférine, quigénère de la lumière (Figure 2). L'intensité de la lumière est proportionnelle au nombre de nucléotides incorporés et détermine s'il ya une ou plusieurs dNTP spécifique (dATP, dTTP, dGTP, dCTP ou) est présent sur le brin matrice de façon séquentielle (figure 3). Toute dNTP non incorporée est dégradée par l'apyrase avant l'addition de la prochaine dNTP pour la poursuite de la réaction de synthèse. Cette "séquençage par synthèse" réaction est répété avec addition de chacune des quatre dNTP jusqu'à ce que la séquence d'ADN de la matrice d'ADN monocaténaire est déterminée.
Pour visualiser une animation de la réaction pyroséquençage Cliquez ici pour voir le film .
Plusieurs nouvelles méthodes de séquençage de nouvelle génération ont été commercialisés. Trois des méthodes les plus couramment utilisés sont le séquençage ion des semi-conducteurs, le séquençage en temps réel de la molécule unique, et le séquençage par synthèse (SBS). 3-11 Chacune de ces méthodes dépend de séquençage par synthèse, mais emploient de nouvelles plates-formes pour la détection des nucléotides incorporés. Dans ion semiconducteur séquençage, un simple brin d'ADN servant de matrice pour le brin de séquençage. Polymérase et 12 nucléotides sont ajoutés séquentiellement comme dans pyroséquençage. Quand un nucléotide est ajouté au brin d'ADN en croissance, un ion d'hydrogène est libéré. L'ion d'hydrogène est détecté par un capteur à effet à base de transistors de champ.
Molécule unité séquençage en temps réel dépend du guide d'ondes en mode zéro (ZMW). 13 Le ZMW est une petite structure où une seule molécule de la polymérase est fixé au fond du puits. Il est éclairé de telle manière qu'une floreMolécule d'odeur peut être détectée. Chaque nucléotide est étiqueté avec une molécule fluorescente. Comme un nucléotide marqué par fluorescence est incorporé, un détecteur identifie le nucléotide. Lorsque le nucléotide suivant est ajouté, la molécule fluorescente est clivé. 14
Le séquençage par synthèse (SBS) utilise une méthode unique pour amplifier l'ADN cible de sorte que des groupes de séquences uniques sont générés. 15 gabarits simples brin sont générées, puis le brin complémentaire est synthétisé. Chaque nucléotide est marqué avec une molécule fluorescente et après chaque addition de base de la fluorescence de la base ajoutée est enregistrée.
The authors have nothing to disclose.
Ce projet a appuyé en partie par l'Université Johns Hopkins, Bureau du prévôt par le Science Initiative passerelle et Qiagen Inc.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
PyroMark PCR Master Mix, 2x | Qiagen | 978703 | |
CoralLoad Concentrate, 10x | Qiagen | 978703, 978705 | |
Q-Solution, 5x | Qiagen | 978703, 978705 | |
MgCl2, 25 mM | Qiagen | 978703, 978705 | |
RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
Primers | Qiagen | 978776 or 978777 | Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM. |
Pyromark Gold Q24 Reagents | Qiagen | 970802 | |
High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent) | |||
Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-07 | |
PyroMark Annealing Buffer | Qiagen | 979009 | |
PyroMark Denaturation Solution | Qiagen | 979007 | |
PyroMark Wash Buffer | Qiagen | 979008 | |
PyroMark Q24 | Qiagen | 9001514 | |
PyroMark Q24 Cartridge | Qiagen | 979202 | |
PyroMark Q96 HS Tip Holder Box | Qiagen | 979105 | |
PyroMark Q24 Vacuum Workstation | Qiagen | 9001516 | |
PyroMark Q24 Plate Holder | Qiagen | 9022273 | |
Orbital shaker | Fisher | 11-675-297 | |
Heat block | Fisher | 11-718Q |