Pyrosequencing, बैक्टीरियल प्रजातियों की पहचान जीवाणु उपभेदों भेदभाव, और विरोधी माइक्रोबियल एजेंटों के लिए प्रतिरोध प्रदान कि आनुवंशिक परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि माइक्रोबियल जीनोम अनुक्रमण सुविधा है कि एक बहुमुखी तकनीक है. इस वीडियो में, माइक्रोबियल amplicon पीढ़ी, amplicon pyrosequencing, और डीएनए अनुक्रम विश्लेषण के लिए प्रक्रिया का प्रदर्शन किया जाएगा.
Pyrosequencing, बैक्टीरियल प्रजातियों की पहचान जीवाणु उपभेदों भेदभाव और विरोधी माइक्रोबियल एजेंटों के लिए प्रतिरोध प्रदान कि आनुवंशिक परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि माइक्रोबियल जीनोम अनुक्रमण सुविधा है कि एक बहुमुखी तकनीक है. सूक्ष्म जीव विज्ञान के लिए आवेदन पत्र pyrosequencing के फायदे तेजी से और विश्वसनीय उच्च throughput स्क्रीनिंग और रोगाणुओं और सूक्ष्म जीनोम परिवर्तन की सटीक पहचान में शामिल हैं. Pyrosequencing संश्लेषण प्रतिक्रिया के दौरान निगमित विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड जा रहा है का निर्धारण करते समय, पूरक किनारा एक समय में एक ही आधार synthesizing द्वारा डीएनए अनुक्रमण शामिल है. प्रतिक्रिया चार deoxyribonucleotides (dNTP) क्रमिक रूप से जोड़ा गया है और अनिगमित dNTPs संश्लेषण प्रतिक्रिया के बगल dNTP के अलावा पहले enzymatically अपमानित कर रहे हैं, जहां स्थिर एकल असहाय टेम्पलेट डीएनए पर होता है. टेम्पलेट में शामिल विशिष्ट आधार की जांच chemilum की पीढ़ी द्वारा नजर रखी हैinescent संकेत. chemiluminescent संकेत है कि उत्पादन dNTPs के आदेश टेम्पलेट के डीएनए अनुक्रम को निर्धारित करता है. pyrosequencing प्रौद्योगिकी के वास्तविक समय अनुक्रमण क्षमता एक एकल परख में तेजी माइक्रोबियल पहचान के लिए सक्षम बनाता है. इसके अलावा, pyrosequencing साधन, SNPs, बिंदु उत्परिवर्तन, निवेशन, और हटाना, साथ ही कुछ विरोधी माइक्रोबियल प्रतिरोध में हो सकता है कि कई जीन प्रतियों की मात्रा का ठहराव की टाइपिंग सहित विरोधी माइक्रोबियल दवा प्रतिरोध का पूरा आनुवंशिक विविधता, विश्लेषण कर सकते हैं पैटर्न.
Pyrosequencing "संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण 'के सिद्धांत पर आधारित है कि अनुक्रम न्यूक्लिक एसिड के लिए एक तेजी से और सही तरीका है. "संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण" एक समय में पूरक किनारा एक आधार synthesize करने के लिए एक भी कतरा डीएनए टेम्पलेट का उपयोग कर, और निगमित आधार (ए, टी, जी, या सी) एक chemiluminescent संकेत का पता लगाने के द्वारा हर कदम पर पता लगाने के शामिल है. pyrosequencing प्रतिक्रिया टेम्पलेट डीएनए, dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), डीएनए पोलीमरेज़, एटीपी sulfurylase, luciferin, luciferase, और apyrase शामिल हैं. संश्लेषण प्रतिक्रिया चार dNTPs और एकल असहाय biotinylated टेम्पलेट डीएनए के लिए डीएनए पोलीमरेज़ में से एक के अलावा द्वारा शुरू की है. डीएनए पोलीमरेज़ पाइरोफॉस्फेट के बाद रिहाई (चित्रा 1) के साथ, टेम्पलेट पर पूरक dNTP को शामिल किया गया. एटीपी sulfurylase अनुपात में एटीपी को पाइरोफॉस्फेट धर्मान्तरित. एटीपी जो oxyluciferin, को luciferin के luciferase की मध्यस्थता रूपांतरण के लिए एक उत्प्रेरक के रूप में कार्य करता हैप्रकाश (चित्रा 2) उत्पन्न करता है. प्रकाश की तीव्रता शामिल nucleotides की संख्या के लिए आनुपातिक है और एक या एक से अधिक विशिष्ट dNTP के (dATP, dTTP, dGTP, या dCTP) क्रमिक टेम्पलेट किनारा (चित्रा 3) पर मौजूद है निर्धारित करता है. कोई अनिगमित dNTP पहले संश्लेषण प्रतिक्रिया को जारी रखने के लिए अगले dNTP के अलावा apyrase द्वारा अपमानित है. एकल असहाय डीएनए टेम्पलेट के डीएनए अनुक्रम निर्धारित किया जाता है जब तक यह "संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण" प्रतिक्रिया चार dNTPs में से प्रत्येक के अलावा के साथ दोहराया है.
Pyrosequencing प्रतिक्रिया का एक एनीमेशन देखने के लिए फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .
कई नए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण तरीकों commercialized किया गया है. सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों में से तीन इन तरीकों में से 3-11 प्रत्येक संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण पर निर्भर करता है. आयन अर्धचालक अनुक्रमण, एक अणु वास्तविक समय अनुक्रमण, और संश्लेषण (एसबीएस) द्वारा अनुक्रमण हैं लेकिन निगमित न्यूक्लियोटाइड का पता लगाने के लिए उपन्यास प्लेटफार्मों को रोजगार. आयन अर्धचालक अनुक्रमण में, डीएनए का एक भी कतरा अनुक्रमण कतरा के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है. 12 पोलीमरेज़ और nucleotides क्रमिक pyrosequencing में के रूप में जुड़ जाते हैं. एक न्यूक्लीओटाइड से बढ़ डीएनए किनारा करने के लिए जोड़ा जाता है, एक हाइड्रोजन आयन जारी की है. हाइड्रोजन आयन एक क्षेत्र प्रभाव ट्रांजिस्टर आधारित संवेदक द्वारा पता चला है.
एकल अणु वास्तविक समय अनुक्रमण शून्य मोड लहर गाइड (ZMW) पर निर्भर करता है. 13 ZMW एक भी पोलीमर्स अणु अच्छी तरह से नीचे से जुड़ा हुआ है, जहां एक छोटी संरचना है. ऐसा लगता है कि एक flore इस तरह से उजागर कर रहा हैखुशबू अणु का पता लगाया जा सकता है. प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड एक फ्लोरोसेंट अणु के साथ टैग है. एक fluorescently टैग न्यूक्लियोटाइड शामिल किया जाता है, एक डिटेक्टर न्यूक्लियोटाइड पहचानती है. अगले न्यूक्लियोटाइड जोड़ा जाता है, फ्लोरोसेंट अणु cleaved है. 14
संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण (एसबीएस) अद्वितीय दृश्यों के समूहों उत्पन्न कर रहे हैं कि लक्ष्य डीएनए ऐसे बढ़ाना एक अनोखी विधि का उपयोग करता है. 15 एकल असहाय टेम्पलेट्स उत्पन्न कर रहे हैं और फिर पूरक कतरा संश्लेषित है. प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड एक फ्लोरोसेंट अणु के साथ लेबल है और प्रत्येक बेस इसके बाद जोड़ा बेस के प्रतिदीप्ति दर्ज की गई है.
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना के जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय, गेटवे विज्ञान पहल और Qiagen इंक के माध्यम से प्रोवोस्ट के कार्यालय के हिस्से में समर्थन किया गया था
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
PyroMark PCR Master Mix, 2x | Qiagen | 978703 | |
CoralLoad Concentrate, 10x | Qiagen | 978703, 978705 | |
Q-Solution, 5x | Qiagen | 978703, 978705 | |
MgCl2, 25 mM | Qiagen | 978703, 978705 | |
RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
Primers | Qiagen | 978776 or 978777 | Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM. |
Pyromark Gold Q24 Reagents | Qiagen | 970802 | |
High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent) | |||
Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-07 | |
PyroMark Annealing Buffer | Qiagen | 979009 | |
PyroMark Denaturation Solution | Qiagen | 979007 | |
PyroMark Wash Buffer | Qiagen | 979008 | |
PyroMark Q24 | Qiagen | 9001514 | |
PyroMark Q24 Cartridge | Qiagen | 979202 | |
PyroMark Q96 HS Tip Holder Box | Qiagen | 979105 | |
PyroMark Q24 Vacuum Workstation | Qiagen | 9001516 | |
PyroMark Q24 Plate Holder | Qiagen | 9022273 | |
Orbital shaker | Fisher | 11-675-297 | |
Heat block | Fisher | 11-718Q |