パイロシーケンシングでは、細菌種を識別する菌株を判別し、抗菌剤に対する耐性を付与する遺伝子の突然変異を検出するために使用することができる微生物のゲノムの配列決定を容易にする汎用性の高い技術である。このビデオでは、微生物のアンプリコンの生成、アンプリコンパイロシーケンシング、およびDNA配列分析のための手順が実証される。
パイロシーケンシングでは、細菌種を識別する菌株を識別および抗微生物剤に対する耐性を付与する遺伝子の突然変異を検出するために使用することができる微生物のゲノムの配列決定を容易にする汎用性の高い技術である。微生物学アプリケーション用パイロシーケンシングの利点は、迅速かつ信頼性の高いハイスループットスクリーニングや微生物や微生物のゲノム変異の正確な識別を含む。パイロは、合成反応中に組み込まれ、特定のヌクレオチドの存在を決定しながら、同時に相補鎖の一塩基を合成することにより、DNAの配列が含まれます。反応には、4つのデオキシリボヌクレオチド(dNTPを)を順次加えて、非法人のdNTPは、合成反応の隣のdNTP添加前に酵素的に分解されて固定化された一本鎖鋳型DNA上で行われます。テンプレートに組み込まれた特定の塩基の検出は、chemilumの発生によって監視されるinescent信号。化学発光シグナルを生成するのdNTP順序は、テンプレートのDNA配列を決定する。パイロシーケンシング技術のリアルタイムシーケンシング機能は、単一のアッセイで迅速な微生物の同定を可能にする。また、パイロシーケンシング器具は、いくつかの抗微生物抵抗で発生する可能性のあるSNPのタイピング、点突然変異、挿入、および削除、ならびに複数の遺伝子コピーの定量化を含む抗微生物薬剤耐性の完全な遺伝的多様性を分析することができパターン。
パイロは "合成による配列決定"の原則に基づいているシーケンス核酸への迅速かつ正確な方法である。 "合成により配列決定は、"一度に一つの基地相補鎖を合成する一本鎖DNAテンプレートを使用し、組み込まれた塩基(A、T、G、C又は)化学発光シグナルの検出によって各段階で検出することを含む。パイロシーケンシング反応は、鋳型DNA、のdNTP(dATPを、dGTPを、dTTPの、dCTPを)、DNAポリメラーゼ、ATPスルフリラーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびアピラーゼが含まれています。合成反応は、4つのdNTPおよびビオチン化一本鎖鋳型DNAにDNAポリメラーゼのいずれかを添加することによって開始される。 DNAポリメラーゼは、ピロリン酸の次のリリース( 図1)で、テンプレートの上に補完的なdNTPを組み込まれています。 ATPスルフリラーゼは比例してATPのピロリン酸に変換されます。 ATPは、オキシルシフェリンにルシフェリンルシフェラーゼ媒介変換のための触媒として作用する光( 図2)を生成します。光の強度は、取り込まれたヌクレオチドの数に比例し、一つ以上の特定のdNTPは(のdATP、dTTPを、dGTPを、またはdCTPを)を順次テンプレート鎖( 図3)上に存在するかどうかを判定する。取り込まれていない任意のdNTPは、従来の合成反応の継続のための次のdNTPを添加するアピラーゼによって分解される。一本鎖DNAテンプレートのDNA配列が決定されるまで、この "合成による配列決定"反応は、4つのdNTPを添加して繰り返される。
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いくつかの新しい次世代シーケンシング法が実用化されている。最も広く使用されている方法の三人は合成によるイオン半導体シーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、およびシーケンシング(SBS)であり、これらのメソッドの3-11各合成による配列決定に依存しますが、取り込まれたヌクレオチドの検出のための新たなプラットフォームを採用しています。イオン半導体シーケンシング、DNAの一本鎖でシーケンストランドのためのテンプレートとして機能します12ポリメラーゼ及びヌクレオチドがパイロシーケンシングのように順次追加されます。ヌクレオチドが成長するDNA鎖に追加されると、水素イオンが放出される。水素イオンは、電界効果トランジスタ基盤のセンサーによって検出される。
単一分子リアルタイムシーケンスは、ゼロモード導波管(ZMW)に依存します13 ZMWが単一ポリメラーゼ分子がウェルの底部に取り付けられている小さな構造です。それは、フロールように点灯している香り分子を検出することができる。各ヌクレオチドは、蛍光分子でタグ付けされています。蛍光標識ヌクレオチドが組み込まれたように、検出器は、ヌクレオチドを識別します。次のヌクレオチドが追加されると、蛍光分子が切断される。14
合成によってシークエンシング(SBS)。15一本鎖テンプレートが生成され、次いで、相補鎖が合成されるユニーク配列のクラスターが生成されるように、標的DNAを増幅するユニークな方法を使用する。各ヌクレオチドは、蛍光分子で標識されており、各基地添加後に添加される塩基の蛍光が記録される。
The authors have nothing to disclose.
このプロジェクトは、ジョンズ·ホプキンス大学、 ゲートウェイ科学イニシアティブ及びキアゲン社を通じて学長のオフィスによって部分的にサポートしていた
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
PyroMark PCR Master Mix, 2x | Qiagen | 978703 | |
CoralLoad Concentrate, 10x | Qiagen | 978703, 978705 | |
Q-Solution, 5x | Qiagen | 978703, 978705 | |
MgCl2, 25 mM | Qiagen | 978703, 978705 | |
RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
Primers | Qiagen | 978776 or 978777 | Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM. |
Pyromark Gold Q24 Reagents | Qiagen | 970802 | |
High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent) | |||
Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-07 | |
PyroMark Annealing Buffer | Qiagen | 979009 | |
PyroMark Denaturation Solution | Qiagen | 979007 | |
PyroMark Wash Buffer | Qiagen | 979008 | |
PyroMark Q24 | Qiagen | 9001514 | |
PyroMark Q24 Cartridge | Qiagen | 979202 | |
PyroMark Q96 HS Tip Holder Box | Qiagen | 979105 | |
PyroMark Q24 Vacuum Workstation | Qiagen | 9001516 | |
PyroMark Q24 Plate Holder | Qiagen | 9022273 | |
Orbital shaker | Fisher | 11-675-297 | |
Heat block | Fisher | 11-718Q |