Summary
Pyrosequencing är en mångsidig teknik som underlättar mikrobiell genomet sekvensering som kan användas för att identifiera bakteriearter, diskriminera bakteriestammar, och upptäcka genetiska mutationer som ger resistens mot antimikrobiella medel. I den här videon, kommer förfarandet för mikrobiell amplicon generation, amplikon Pyrosequencing, och DNA-sekvensanalys påvisas.
Abstract
Pyrosequencing är en mångsidig teknik som underlättar mikrobiell genomet sekvensering som kan användas för att identifiera bakteriearter, diskriminera bakteriestammar och upptäcka genetiska mutationer som ger resistens mot antimikrobiella medel. Fördelarna för Pyrosequencing för mikrobiologi applikationer är snabb och tillförlitlig high-throughput screening och korrekt identifiering av mikrober och mikrobiella mutationer genomet. Pyrosequencing innebär sekvensering av DNA genom att syntetisera den komplementära strängen en enda bas i taget, medan bestämning av specifika nukleotid varelse införlivas under syntesreaktionen. Reaktionen sker på immobiliserat enkelsträngat templat-DNA där de fyra deoxiribonukleotiderna (dNTP) tillsätts sekventiellt och de unincorporated dNTP är ned enzymatiskt före tillsats av nästa dNTP till syntesreaktionen. Detektion av den särskilda bas införlivas med mallen övervakas genom alstring av chemiluminescent signaler. Ordningen på dNTP som producerar de kemiluminescenta signalerna bestämmer DNA-sekvensen av mallen. Den realtid sekvensering förmåga Pyrosequencing teknologin möjliggör snabb mikrobiell identifiering i en enda analys. Dessutom pyrosekvensering instrumentet, kan analysera den fullständiga genetiska mångfalden av antimikrobiell resistens, inklusive typning av SNP, punktmutationer, insättningar och strykningar, samt kvantifiering av multipla genkopior som kan förekomma i någon antibiotikaresistens mönster.
Introduction
Pyrosequencing är en snabb och exakt metod för syror sekvens nukleinsyror som bygger på principen om "sekvensering genom syntes". "Sekvensering genom syntes" innebär att man använder en enda schablonsträng DNA för att syntetisera den komplementära strängen en bas åt gången, och detektering av den inkorporerade basen (A, T, G eller C) vid varje steg för detektering av en kemiluminescent signal. Pyrosequencing reaktion innefattar mall-DNA, dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA-polymeras, ATP sulfurylas, luciferin, luciferas och apyras. Syntesen Reaktionen initieras genom tillsats av en av de fyra dNTP och DNA-polymeras till den enkelsträngade biotinylerade mall-DNA. DNA-polymeras inkorporerar den komplementära dNTP på mallen, med efterföljande frisättning av pyrofosfat (Figur 1). ATP sulfurylas omvandlar proportionellt pyrofosfatet till ATP. ATP fungerar som en katalysator för luciferas-medierad omvandling av luciferin till oxyluciferin, somgenererar ljus (Figur 2). Ljusintensiteten är proportionell mot antalet införlivade nukleotider och avgör om en eller flera särskilda dNTP (dATP, dTTP, dGTP eller dCTP) finns på mallsträngen sekventiellt (Figur 3). Varje unincorporated dNTP bryts ned av apyras före tillsats av nästa dNTP för fortsättning av syntesreaktionen. Denna "sekvensering genom syntes"-reaktion upprepas med tillsats av vardera av de fyra dNTP tills DNA-sekvensen för den enkelsträngade DNA-mallen bestäms.
Om du vill visa en animering av pyrosekvensering reaktionen Klicka här för att se filmen .
Protocol
Inledning: En enda bakteriekoloni bör användas för att inokulera ett lämpligt odlingsbuljong som inkuberas över natt. En bakteriell pelleten behandlas sedan för att rena genom-DNA med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit genomisk isolering. Det renade genomiska DNA bör ha en 260/280 (nm) förhållande> 1,8 för att säkerställa att provet är fritt från protein kontaminering. Mängden genomiska DNA som krävs för generering av Pyrosequencing mallen är 10-20 ng.
A. Förstärkning av mallen
(PyroMark PCR Handbook, www.qiagen.com / handböcker 1)
Inställning av PCR-reaktionen
Obs: En primer måste biotinylerad vid dess 5'-ände, och det rekommenderas att man måste HPLC renas för mall beredning. Vi rekommenderar PyroMark Assay Design Software 2.0 för PCR och sekvens primer design som är optimerade för kort-läs sekvensering, dock Primer-BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome ) från NCBI kan också användas för primer design.
- Tina alla nödvändiga lösningar (listade i tabell 1) och blanda varje noggrant. Ställ upp reaktionen enligt tabell 1. Allt arbete kan utföras vid rumstemperatur.
Obs: PCR Master Mix innehåller MgCl2 för en slutlig koncentration av 1,5 mM, som ger tillfredsställande resultat i de flesta fall. Om en högre Mg 2 + koncentration krävs, kan upp till 3,5 | il av 25 mM MgCl2 sättas till en reaktion.
- Blanda reaktionen genom att försiktigt pipettera upp och ned, sedan fördela lämpliga volymer till PCR-rör.
- Lägg template DNA till varje PCR-rör. Vi rekommenderar 10 ng av genomiskt DNA.
- Programmera värmecykeln enligt tabell 2. En slutlig uppehåll vid 4 ° C rekommenderas för bekvämlighet. Om du använder en termocykler utan ett uppvärmt lock, overlay reaktioner med 100 pl mineralolja.
- Placera PCR-rören i cyklem och starta cyklingen programmet.
B. Vakuum Workstation protokoll
Immobilisering av biotinylerade PCR-produkter
- Gör en Master Mix enligt Figur 4.
Obs: Före pipettering, försiktigt skaka flaskan av streptavidinbelagda Sepharose kulor för att säkerställa en homogen suspension.
- Beroende på volymen av PCR-produkt som används, dispensera 60-75 pl Master Mix i varje brunn i en PCR-platta för att ge en total volym av 80 ul per brunn.
- Lägg 5-20 pl biotinylerad PCR-produkt till varje brunn.
- Täta brunnar med remsan caps och agitera PCR plattan vid 1400 rpm under 5 till 10 min vid rumstemperatur (15-25 ° C) med användning av en orbitalskakare.
Denaturering av DNA och tillsats av sekvenseringsprimer
- Späd sekvenseringsprimrar till 0,3 pM med pamingsbuffert och dispensera 25 | il i varje brunn i en reaktionsplatta. Placera plattan på arbetsstationen.
- Fyll arbetsstationen tråg enligt Figur 5 diagrammet.
- Slå på vakuumpumpen, och se till att omkopplaren på vakuum verktyget är inställd på (Figur 6). Spola filtret sonder med ultrarent vatten (Milli-Q 18,2 MW x cm eller motsvarande) i tråget 5 (Figur 5). Fyll på tråget med färskt ultrarent vatten för användning i steg 12.
- Arbeta snabbt, placera PCR-plattan med pärlor på arbetsstationen. Se till att båda plattorna är i samma orientering som när proverna laddades.
- Med vakuumströmbrytaren ON, sänk vakuumverktyget i brunnarna i PCR-plattan för 20 sek eller tills all volym har aspirerats. Kulorna kommer att fångas in av vakuumet verktyget (figur 7).
- Med vakuumet fortfarande ON, spola verktyg med 70% etanol (tråg 1) under 20 s eller tills all volym har aspirerats.
- Med vakuum på, spola verktyget med denatureringslösning (tråg 2) i 20 sekunder eller tills allt volymen har aspirerat.
Obs: Denatureringslösning innehåller natriumhydroxid, vilket är ett öga och hudirriterande. Alltid bära skyddsrock, handskar och skyddsglasögon.
- Med vakuum på, spola verktyget med tvättbuffert (ränna 3) i 20 sekunder eller tills allt volymen har aspirerat.
- Med vakuum ON, höja det vakuum verktyget till bortom 90 ° vertikalt för 5 sekund, för att tillåta all vätska att rinna ut ur vakuum verktyget. Slå av pumpen och justera vakuum verktyget med reaktionen plattan. Sänk vakuum verktyget ibrunnar och försiktigt skaka från sida till sida för att frigöra kulorna in i brunnar innehållande sekvenseringsprimer.
- För att rengöra vakuum verktyget, skaka filtret sonder i hög renhet vatten (tråg 4) i 10 sek.
- Slå på vakuum och spola instrumentet med hög renhet vatten (tråg 5) under 20 sekunder eller tills allt volymen har aspirerat.
- Höj vakuum verktyget till över 90 ° C vertikalt under 5 sekunder, slå därefter vakuum OFF och lagra i "parkeringsläget".
Glödgning sekvenseringsprimer till DNA-strängar
- Placera reaktionsplattan i en förvärmd hållare.
- Värm plattan på ett värmeblock vid 80 ° C under 2 min.
- Avlägsna plattan från hållaren och placera på disken svalna i rumstemperatur i 5 minuter.
Pyromark Q24 Operation
Obs: Slå på instrumentet med strömbrytaren ovanför nätsladden. Startup kan ta upp till 1 minut.
- Fyll en patron enligt anvisningarna i PyroMark Gold Q24 Reagenser Handbok 2. För att bestämma volymer som krävs, inrätta en körfil i instrumentets programvara, och under menyn Verktyg väljer Pre Run Information
- Om instrumentet var redan på, se till att den inte utför en körning och sedan öppna locket. En hörbar varningssignal hörs om locket öppnas när det är säkert att göra det.
- Öppna kassetten porten och sätt i bläckpatronen med etiketten vänd framåt (Figur 8). Se till att patronen är ordentligt isatt (en linje ska vara synlig på framsidan) och stänga grinden.
- Öppna plattan-innehav ram och placera plattan med prover inuti instrumentet.
- Stäng det plattformade hållramen och instrumentet locket (Figur 9).
Starta en körning
- Sätt i USB-minnet med den run-filens skapade med instrumentet programvaran till USB-porten på framsidan av instrumentet.
- Välj "Kör" i huvudmenyn och tryck på "OK".
- Använd pilknapparna för att välja önskad kör filen och tryck på "Select".
Anm: Instrumentet börjar fördela reagens när alla förinställt tryck och temperaturnivåer uppnås (detta kan ta flera minuter). Under en körning, visar instrumentets skärm den pyrogram för det valda väl i realtid. Använd pilarna för att se pyrogram av andra brunnar.
Slutföra en körning
- När instrumentet bekräftar att körningen är klar och kör filen har sparats på USB-minnet, tryck på "Close".
- Ta bort USB-minnet. Om det togs bort innan körningen klar, sätt in USB-minnet. Välj "Administration" och sedan "Kopiera Ofrälsta Runs".
- Den kör filen kan nu öppnas och analyseras med hjälp av instrumentets programvara och jämförstill ett bibliotek av kända mikrober använder Identifire programvara.
Representative Results
Resultaten av en typisk pyrosequencing körning med hjälp av programmet visar var framåt och bakåt primers som används för amplicon generation, och sekvenseringsprimem används för Pyrosequencing reaktionen inom den konserverade 16S ribosomal sekvens (Figur 10). Den hypervariabla sekvensen mellan primer bindningsställen kan bakteriell identifiering av ett stort antal bakteriearter som använder den konserverade sekvenseringsprimer (5'-TACATGCAAGTCGA). Som en intern kvalitetskontroll, den variabla regionen av DNA-sekvensen bracketing kan kontrolleras för att säkerställa att den korrekta DNA-regionen har analyserats . Pyrosequencing mjukvara möjliggör jämförelser och anpassning av den genererade sekvensen till en intern databas med bakteriernas ribosomala sekvenser för bakteriell identifiering. Dessutom kan en sekvens analyseras för att bestämma mutationer som ger antibiotisk resistens. Till exempel, analys av mutationer i 23S ribosom gener av Helicobtär pylori demonstrerar två mutation mönster (GAA eller AGA) som ger antibiotikaresistens (Figur 11). Analys av multipla isolat från samma patient kan samtidigt analyseras för att spåra uppkomsten av resistens över tiden för att bistå vid epidemiologiska undersökningar av mikrobiella utbrott läkemedelsresistens.
Figur 1. Biotinylerad PCR-produkten användes som en mall för att inkorporera dNTP genom DNA-polymeras, vilket leder till generering av pyrofosfat (PPi).
Figur 2. ATP-sulfurylas omvandlar proportionellt pyrofosfat till ATP. ATP fungerar som en katalysator för luciferas-medierad omvandling av luciferin till oxyluciferin, som genererar ljus som är proproportionellt mot mängden ATP. Ljuset registreras som topp på pyrogram spår och visar nukleotid inkorporering. De oregistrerade dNTP bryts ned av apyras innan nästa dNTP tillsätts för fortsatta syntesen.
Figur 3. Intensiteten av genererade ljus indikerar om en eller flera särskilda dNTP (dATP, dTTP, dGTP eller dCTP) införlivades på schablonsträngen sekventiellt.
Figur 4. Flödesschema för framställning av Master Mix för att immobilisera biotinylerad PCR-produkten.
GE = "alltid"> Figur 5. PyroMark arbetsstation, med PCR-platta, PyroMark plattan, och platser tråg.
Figur 6. Platser av Vakuumbrytare ON och OFF.
Figur 7. Vakuum verktyg. Korrekt hantering av vakuum verktyget.
Figur 8. Cartridge porten öppnas med patronen på plats.
Figur 9. Cartridge ordentligt med grinden stängd.
Figur 10. Pyrosequencing baserade bakteriella identifiering resultat. PCR-primers är utformade för konserverade regioner av DNA-mallen, och den sekvenseringsprimer är belägen omedelbart uppströms om en välkarakteriserad identifiera hypervariabla DNA-sekvens inom amplikonen (visat i blått).
Figur 11. Upptäckt av antibiotika resistens i Helicobacter pylori använder Pyrosequencing. Analys av mutationer i 23S gener som ger antibakteriell resistens i Helicobacter pylori innehåller GAA eller AGA-sekvenser. Klicka här för att visa en större bild .
| Volym per reaktion | Slutlig koncentration | |
| Pyro PCR Master Mix, 2x | 12,5 | il | 1x |
| CoralLoad Concentrate, 10x | 2,5 | il | 1x |
| 25 mM MgCl2 (tillval) | Variabel | ≥ 1,5 mM |
| Q-lösning, 5x (tillval) | 5 | il | 1x |
| Primer A / Primer B | Variabel / Variabel | 0,2 μM/0.2 iM |
| RNas-fritt vatten | Variabel | - |
| Total volym (efter tillsats mall-DNA) | 25 | il |
Tabell 1. PCR-reaktionsblandningen.
| & Nbsp; | Ytterligare kommentarer | ||
| Initial PCR aktiveringssteget | 15 min | 95 ° C | HotStartTaq DNA-polymeras aktiveras |
| 3 steg cykling: denaturering | 30 sek | 94 ° C | |
| Glödgning | 30 sek | 60 ° C 56 ° C | För genom-DNA För bisulfit konverterade DNA |
| Förlängning | 30 sek | 72 ° C | |
| Antal cykler | 45 | ||
| Slutlig förlängning | 10 min | 72 ° C |
Tabell 2. PCR-cykel Specifikationer.
Discussion
Flera nya nästa generations sekvensering metoder har kommersialiserats. Tre av de mest använda metoderna är jon halvledare sekvensering, enda molekyl realtid sekvensering, och sekvensering genom syntes (SBS). 3-11 Var och en av dessa metoder beror på sekvensering genom syntes men anställa nya plattformar för detektion av de införlivade nukleotider. I jon halvledare sekvensering, tjänar en enkel sträng av DNA som en mall för sekvensering strängen. 12 Polymeras och nukleotider tillsättes i följd som i Pyrosequencing. När en nukleotid tillsätts till den växande DNA-sträng, är en vätejon släpps. Den vätejon detekteras av en fälteffekttransistor baserad sensor.
Single molekyl realtid sekvensering beror på nollarbetsläget vågledare (ZMW). 13 Den ZMW är en liten struktur där en enda polymeras molekyl är fäst vid botten av brunnen. Det är belyst på ett sådant sätt att en floredoft molekyl kan detekteras. Varje nukleotid är märkt med en fluorescerande molekyl. Som en fluorescerande taggade inkorporeras, identifierar en detektor nukleotid. När nästa nukleotid tillsätts, är den fluorescerande molekylen klyvs. 14
Sekvensering genom syntes (SBS) använder en unik metod för att amplifiera mål-DNA, så att kluster av unika sekvenser genereras. Genereras och sedan den komplementära strängen syntetiseras 15 Enkelsträngade mallar. Varje nukleotid är märkt med en fluorescerande molekyl och efter varje bastillsats fluorescensen hos den tillsatta basen registreras.
Disclosures
Produktion och fri tillgång till den här artikeln är sponsrad av Qiagen.
Författare Ahmed, Durocher, Jessen och Vardi är anställda av Qiagen Inc. som producerar reagens och instrument som används i den här artikeln.
Acknowledgments
Detta projekt var stöd delvis av Johns Hopkins University, tjänstgörande Provost via Gateway Science Initiative och Qiagen Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PyroMark PCR Master Mix, 2x | Qiagen | 978703 | |
| CoralLoad Concentrate, 10x | Qiagen | 978703, 978705 | |
| Q-Solution, 5x | Qiagen | 978703, 978705 | |
| MgCl2, 25 mM | Qiagen | 978703, 978705 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| Primers | Qiagen | 978776 or 978777 | Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM. |
| Pyromark Gold Q24 Reagents | Qiagen | 970802 | |
| High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent) | |||
| Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-07 | |
| PyroMark Annealing Buffer | Qiagen | 979009 | |
| PyroMark Denaturation Solution | Qiagen | 979007 | |
| PyroMark Wash Buffer | Qiagen | 979008 | |
| PyroMark Q24 | Qiagen | 9001514 | |
| PyroMark Q24 Cartridge | Qiagen | 979202 | |
| PyroMark Q96 HS Tip Holder Box | Qiagen | 979105 | |
| PyroMark Q24 Vacuum Workstation | Qiagen | 9001516 | |
| PyroMark Q24 Plate Holder | Qiagen | 9022273 | |
| Orbital shaker | Fisher | 11-675-297 | |
| Heat block | Fisher | 11-718Q |
References
- PyroMark PCR Handbook. , [about 27p.]. Available from: http://www.qiagen.com/handbooks (2009).
- PyroMark Q24 User Manual. , [about 27p.]. Available from: http://www.qiagen.com/handbooks (2012).
- Elahi, E., Ronaghi, M. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).
- Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).
- Langaee, T., Ronaghi, M. Genetic variation analyses by pyrosequencing. Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).
- Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis. Nucleic Acids Res. 35 (18), e120 (2007).
- Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes. J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).
- J, Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
- Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data. Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).
- Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release. Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).
- King, C., Scott-Horton, T. Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping. J. Vis. Exp. (11), e630 (2008).
- Rothberg, J. W., Heinz,, et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
- Eid, J., Fehr, A. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
- Sequencing Technology | Sequencing by Synthesis | Illumina [Internet]. , Illumina. Available from: http://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn (2012).
