स्थायी सेरेब्रल पोत रोड़ा Published: July 21, 2013 doi: 10.3791/50418

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Melissa F. Davis*^1,2, Christopher Lay*^1,2,3, Ron D. Frostig^1,2,3,4

¹Department of Neurobiology & Behavior, University of California, Irvine, ²The Center for the Neurobiology of Learning and Memory, University of California, Irvine, ³The Center for Hearing Research, University of California, Irvine, ⁴Department of Biomedical Engineering, University of California, Irvine

* These authors contributed equally

Summary

हम एक कृंतक प्रमुख मस्तिष्क रक्त वाहिनियों की स्थायी रोड़ा के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णन है. यह तकनीक बहुत कम परिधीय क्षति, न्यूनतम खून की कमी, लंबे समय तक जीवित रहने की दर बहुत अधिक है, और मानव नैदानिक ​​आबादी के अनुरूप लगातार रोधगलितांश मात्रा के साथ पूरा किया जा सकता है.

Abstract

स्ट्रोक मृत्यु, विकलांगता, और सामाजिक आर्थिक नुकसान दुनिया भर का एक प्रमुख कारण है. सभी स्ट्रोक का बहुमत रक्त प्रवाह में रुकावट (ischemia) ¹ से परिणाम. मध्य प्रमस्तिष्क धमनी (एमसीए), प्रांतस्था ² के पार्श्व सतह पर खून का एक बड़ा बहुमत उद्धार मानव स्ट्रोक ³ का सबसे आम साइट है, और अपने क्षेत्र के भीतर ischemia के व्यापक शिथिलता या मौत ^1,4,5 में परिणाम कर सकते हैं. इस्कीमिक स्ट्रोक के बचे अक्सर हानि या मोटर क्षमताओं का विघटन, संवेदी घाटे, और रोधगलितांश पीड़ित हैं. स्ट्रोक के इन प्रमुख विशेषताओं पर कब्जा, और इस तरह प्रभावी उपचार को विकसित करने के प्रयास में, जोर का एक बड़ा सौदा एमसीए में ischemia के पशु मॉडल पर रखा गया है.

यहाँ हम स्थायी रूप से एक cortical सतह रक्त वाहिका occluding का एक तरीका मौजूद है. हम सबसे आम प्रकार, स्थान, और outcom मॉडल है कि एक प्रासंगिक पोत रोड़ा का एक उदाहरण का उपयोग करते हुए इस विधि पेश करेंगेमानव स्ट्रोक, स्थायी मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (pMCAO) के ए. इस मॉडल में, हम शल्य चिकित्सा वयस्क चूहे में एमसीए बेनकाब और बाद में पोत की डबल संयुक्ताक्षर और transection के माध्यम से रोक देना. इस pMCAO एमसीए कोर्टिकल क्षेत्र, कॉर्टेक्स के एक बड़े हिस्से के सभी में ischemia के कारण एमसीए के समीपस्थ कॉर्टिकल शाखा को रोकता है. रोड़ा का यह तरीका भी प्रांतस्था के एक छोटे क्षेत्र को लक्षित अधिक फोकल ischemia के लक्ष्य को हासिल करने के क्रम में cortical जहाजों का अधिक बाहर का अंश रोक देना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. pMCAO की प्राथमिक नुकसान एक छोटे कपाल - उच्छेदन एमसीए का उपयोग करने की आवश्यकता है के रूप में शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया कम से कम ऊतकों को नुकसान में यह परिणाम है, हालांकि कुछ हद तक आक्रामक है कि कर रहे हैं. इस मॉडल का प्राथमिक लाभ, तथापि, कर रहे हैं: रोड़ा की साइट अच्छी तरह से रक्त प्रवाह में कमी की डिग्री, लगातार कार्यात्मक और हानि तेजी से होता स्नायविक है, परिभाषित किया गया है, रोधगलितांश आकार के अनुरूप है, और अस्तित्व की उच्च दर के लिए लंबे समय की अनुमति देता है अवधि पुरानी मूल्यांकन.

Introduction

प्रभावी रूप से मानव इस्कीमिक स्ट्रोक कि नकल इस्कीमिक परिस्थितियों को उत्पन्न करने के लिए, कई पशु स्ट्रोक मॉडल व्यापक रूप से रोधगलितांश की मात्रा जिसके परिणामस्वरूप अलग से कार्यरत हैं. Photothrombotic मॉडल में, ^{मस्तिष्क,} आसपास के ऊतकों ⁶ भीतर रासायनिक जमावट, विकिरणित वाहिकाओं की रुकावट, और ischemia, जिसके परिणामस्वरूप एक सहज पदार्थ (जैसे गुलाब बंगाल के रूप में) की नसों में इंजेक्शन के बाद लेजर रोशनी का उपयोग बरकरार खोपड़ी के माध्यम से विकिरणित है ^7. Photothrombosis रोधगलितांश की बहुत छोटी, अलग क्षेत्रों में परिणाम कर सकते हैं और आम तौर पर मॉडलिंग "मिनी स्ट्रोक", या "सूक्ष्म स्ट्रोक" का एक साधन के रूप में प्रयोग किया जाता है.

विशेष रूप से मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) में इस्कीमिक स्ट्रोक उत्प्रेरण के लिए और अधिक व्यापक रूप से अपनाया तकनीक, एक रेशा शल्य चिकित्सा द्वारा बाह्य मन्या धमनी में पेश किया और टिप एमसीए के आधार occludes तक उन्नत है जिसमें intraluminal monofilament मॉडल ^8, है. एक प्राथमिकintraluminal रेशा रोड़ा की मेरी चुनौती उच्च मृत्यु दर ⁹ (एमसीए 3 घंटा, स्ट्रोक अनुसंधान के लिए एक प्रासंगिक समय बिंदु के लिए occluded है जब 70%) है. विधि के साथ अन्य मुद्दों संभव subarachnoid नकसीर, अधूरा रोड़ा, और चर रोधगलितांश मात्रा ^10,11 शामिल थे. इस मॉडल प्रांतस्था और subcortically ¹² में दोनों रोधगलितांश की एक व्यापक डिग्री में परिणाम है, और मॉडलों के एक बड़े पैमाने पर मानव स्ट्रोक.

सूक्ष्म और भारी दोनों स्ट्रोक मॉडल महत्वपूर्ण हैं, मानव स्ट्रोक कहीं बीच में आम तौर पर कर रहे हैं. बड़े नैदानिक ​​अध्ययन में, स्ट्रोक रोधगलितांश पर्वतमाला आकार में ipsi-ishemic गोलार्द्ध ⁹ के 4.5-14% जो अनुवाद 28-80 सेमी ^3, से. इसकी तुलना में, हमारे चूहे pMCAO रोधगलितांश आकार पर्वतमाला ipsi-ishemic गोलार्द्ध के 3 से 12% का गठन किया है, जो लगभग 9-35 मिमी ^3, से. हमारे pMCAO मॉडल, इसलिए, बारीकी से मस्तिष्क के प्रतिशत के आधार पर मानव इस्कीमिक स्ट्रोक रोधगलितांश मात्रा में जैसा दिखता हैमात्रा.

मानव की स्थिति के समान कार्यात्मक और व्यवहार घाटे में स्ट्रोक, pMCAO परिणाम की संरचनात्मक क्षति मॉडलिंग के अलावा. कम से कम, स्ट्रोक क्षति ^13-15, हानि या मोटर और संवेदी समारोह ^16,17, नुकसान या पैदा neuronal गतिविधि ^16,18 के विघटन, मस्तिष्क रक्त के प्रवाह ¹⁹ में कटौती के विघटन के लिए contralateral आंदोलन घाटे में स्ट्रोक परिणाम के लिए एक प्रभावी ^{मॉडल, 20,} और रोधगलितांश ^21,22. तदनुसार, हमारे pMCAO मॉडल एमसीए की एक गंभीर रोड़ा संवेदी प्रांतस्था (और पड़ोसी cortices), neuronal गतिविधि के विघटन, एमसीए रक्त प्रवाह में एक गंभीर कमी है, और इस्कीमिक स्ट्रोक ²³ रोधगलितांश-बानगी विशेषताओं के भीतर समारोह की शारीरिक विकलांगता, नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप ^-25, इसलिए मानव स्ट्रोक का एक प्रभावी मॉडल के रूप में सेवारत.

Procedurally, pMCAO हम ध्यान से खोपड़ी और ड्यूरा हटाने में जो एक छोटे कपाल - उच्छेदन शामिलएमसीए के प्रारंभिक (एम 1) खंड पर एक 2 एक्स 2 मिमी "शल्य खिड़की", बस पूर्वकाल और कूल्हों कॉर्टिकल शाखाओं (आंकड़े 1 ए और 1 बी) में एमसीए के प्राथमिक विभाजन से पहले. हम (pMCAO बाहर ले जाने के लिए आवश्यक शल्य चिकित्सा की आपूर्ति के लिए विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका देखें एमसीए नीचे और cortical सतह से ऊपर, meninges की pial परत के माध्यम से एक आधा वक्र रिवर्स काटने सीवन सुई और धागे (6-0 रेशम) पारित ). हम तो एक डबल संयुक्ताक्षर टाई, एमसीए के आसपास दो समुद्री मील कस, और दो समुद्री मील के बीच पोत आड़ा काट. एम 1 के माध्यम से डबल संयुक्ताक्षर और transection बस, lenticulostriate शाखाओं को बाहर का एमसीए के ही कॉर्टिकल शाखाओं प्रभावित इस प्रकार केवल कॉर्टिकल रोधगलितांश (कोई subcortical क्षति) ^26,27 (चित्रा 2) होता हैं कि इस तरह की समस्या होती है. मानव स्ट्रोक अक्सर subcortical रोधगलितांश शामिल है हालांकि, कृन्तकों में इस मॉडलिंग वृद्धि हुई invasiveness (मस्तिष्क जहाजों occluding कॉर्टिकल branchi से पहले की आवश्यकताएनजी गर्दन में मन्या धमनी के माध्यम से पहुँचने धमनियों की आवश्यकता है और तकनीक और रोधगलितांश आकार में वृद्धि की परिवर्तनशीलता में) अतिरिक्त occlusions आवश्यक. एमसीए के पूर्व शाखाओं के लिए उपयोग एक साधारण कपाल - उच्छेदन के माध्यम से संभव नहीं है यहाँ के रूप में वर्णित मॉडल अधिक proximally नहीं किया जा सकता. यह pMCAO के माध्यम से एक subcortical रोधगलितांश प्रेरित करने के लिए शल्य चिकित्सा द्वारा संभव हो सकता है, रोड़ा एक बेहद आक्रामक प्रक्रिया पड़ेगा और इसलिए आदर्श नहीं है होगा.

रोड़ा की प्रभावशीलता histologically लेजर डॉपलर, या लेजर इमेजिंग ^12,24,25 धब्बा (चित्रा 3), या पोस्टमार्टम (चित्रा 2) के माध्यम से इसकी पुष्टि की जा सकती है. यह पिछले अनुसंधान संवेदी उत्तेजना रोधगलितांश के विकास और परिणाम में एक प्रमुख भूमिका निभा सकते हैं कि पता चला है कि ध्यान दिया जाना चाहिए, pMCAO के 2 घंटे के भीतर प्रशासित जब क्षति से सुरक्षा प्रदान करने और 3 घंटे बाद pMCAO में दिलाई जब स्ट्रोक नुकसान में वृद्धि के कारण ^24,25,28. हम 5 घंटा बाद pMCAO में, उत्तेजना नहीं रह परिणाम (अप्रकाशित डेटा) पर एक प्रभाव है कि पुष्टि की है. इसलिए, विषयों का संवेदी उत्तेजना pMCAO न्यूनतम परिवर्तनशीलता के साथ रोधगलितांश मात्रा में प्राप्त करने के बाद 5 घंटे के लिए कम से कम किया जाना चाहिए. तदनुसार, हमारे समूह न्यूनतम संवेदी उत्तेजना के साथ, अंधेरे में, 5 घंटा बाद pMCAO के लिए चूहों संवेदनाहृत रखने के द्वारा इस प्रकार की "अनुपचारित नियंत्रण" चलाता है, और स्पष्ट रूप से कोई गलमुच्छा उत्तेजना.

इसे आगे भी जरूरत से ज्यादा शाखाओं में बंटी, कई प्राथमिक क्षेत्रों, या संप्रेषण धमनियों के अभाव सहित एमसीए संरचना में सामयिक परिवर्तन, पुरुष वयस्क Sprague Dawley चूहों ^29,30 में 10 से 30% की एक आवृत्ति पर हो सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. एमसीए में असामान्यताएं मनाया जाता है, यह इस तरह संवहनी असामान्यताएं के साथ जानवरों जोड़ने रोधगलितांश परिवर्तनशीलता में वृद्धि होगी के रूप में है कि विशेष रूप से इस विषय का उपयोग नहीं करने की सलाह दी जाती है.

इसके अतिरिक्त, ओ के कई व्यावहारिक पहलू हैंस्ट्रोक जांच के लिए लाभप्रद इस रोड़ा विधि बनाने कि उर प्रक्रिया. सबसे पहले, टांके धमनी के आसपास रखा लेकिन संयुक्ताक्षर और transection के बाद के बाद इस्कीमिक मूल्यांकन के बाद आधारभूत मूल्यांकन, इकट्ठा करने के क्रम में कड़ा नहीं किया जा सकता है. इस तरीके में, रोड़ा के लिए आवश्यक शल्य चिकित्सा की तैयारी को प्रभावी ढंग से विषयों के भीतर, के लिए नियंत्रित किया जाता है. विषयों स्थिर रह सकता है या रोड़ा भर में एक stereotaxic फ्रेम के भीतर, यह उपयोग ^25,28 इस विषय में आगे बढ़ या किसी भी प्रयोगात्मक उपकरण के बिना परेशान दौरान, और रोड़ा के बाद, पूर्व करने के लिए प्रत्येक विषय की प्रयोगात्मक आकलन करना संभव है. इसके अलावा, यहां तक कि वृद्ध कृंतक विषयों के भीतर एक बहुत कम मृत्यु दर में इस प्रक्रिया के परिणाम 21-24 उम्र के महीनों (एक बुजुर्ग मानव के समकक्ष) ^31, और इसलिए अधिक बारीकी से सबसे आम मॉडल है कि चूहों में स्ट्रोक के उपचार का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है स्ट्रोक से ग्रस्त मरीजों ^25,28 के आयु वर्ग. पोत transectioपता भी कई व्यावहारिक उद्देश्यों में कार्य करता है. transection के बाद रक्तस्राव के अभाव पोत पूरी तरह से संयुक्ताक्षर दोनों साइटों पर occluded था कि पुष्टि करता है. इसके अतिरिक्त, transection रक्त प्रवाह की एक स्थायी व्यवधान सुनिश्चित करता है. अंत में, transection occluded पोत के बाहर का अंश में पता चला किसी भी रक्त प्रवाह एक वैकल्पिक स्रोत से आना चाहिए कि यह सुनिश्चित करता है.

हम विशेष रूप से इस पांडुलिपि और वीडियो में एमसीए के लिए इस रोड़ा तकनीक का वर्णन है, हालांकि अंत में, एक ही डबल संयुक्ताक्षर transection तकनीक कपाल - उच्छेदन के माध्यम से पहुँचा जा सकता है कि किसी भी मस्तिष्क पोत के लिए लागू किया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला, उदाहरण के लिए, चुनिंदा प्राथमिक somatosensory प्रांतस्था ³² भीतर ischemia के लिए प्रेरित करने के लिए डिज़ाइन तकनीक के समान करने के लिए एक तरह से प्राथमिक, और जमानत के रक्त प्रवाह ²⁴ दोनों ब्लॉक करने के क्रम में बाहर का एमसीए शाखाओं के कई अतिरिक्त स्थायी occlusions के साथ संयोजन के रूप में pMCAO का उपयोग किया.

अंत में, टीस्ट्रोक के मानव नैदानिक ​​साहित्य के साथ जुड़े सबसे आम स्थान (एमसीए), प्रकार (ischemia), और नुकसान की डिग्री (रोधगलितांश): एमसीए करने के लिए आवेदन के रूप में स्थायी रोड़ा के लिए अपने तरीके निकट मानव इस्कीमिक स्ट्रोक के तीन प्राथमिक पहलुओं मॉडल. इसके अलावा, रोड़ा के इस तरीके के मस्तिष्क में एक या कई रोड़ा साइटों के लिए लागू किया जा सकता है, और अस्तित्व के एक उच्च दर के साथ आयु वर्ग के विषयों में आयोजित किया जा सकता है. इस रोड़ा के गतिशील, स्थायी, और अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव प्रकृति को देखते हुए, इस तकनीक से सुरक्षा और स्ट्रोक के उपचार के लिए उपन्यास दृष्टिकोण का मूल्यांकन पूर्व नैदानिक ​​शोधकर्ताओं के लिए एक अतिरिक्त उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है.

Protocol

1. प्रारंभ करना आवश्यक सर्जिकल उपकरण

चित्रा 4 देखें

1. डेंटल ड्रिल (Kavo चिकित्सकीय उपकरण, आदर्श: UMXL-टीएम), 2 बिट ड्रिल, और 3 बिट ड्रिल
2. दो ~ 30 गेज चमड़े के नीचे सुई
3. दाँतेदार चिमटी, घुमावदार टिप वैकल्पिक (सहायक, लेकिन जरूरी नहीं हो सकता है)
4. दो ठीक टिप चिमटी
5. तार कटर
6. सिवनी धागा
7. माइक्रो कैंची

2. सर्जिकल विंडो बनाना

1. संज्ञाहरण: प्रक्रियाएं एनआईएच दिशा निर्देशों के अनुपालन में हैं और यूसी इरविन पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है. प्रायोगिक विषयों में 295-400 ग्राम पुरुष Sprague Dawley चूहों (चार्ल्स नदी प्रयोगशालाओं, विलमिंगटन, एमए, यूएसए) और निम्न संज्ञाहरण प्रक्रिया का इस्तेमाल किया जाना चाहिए रहे हैं:
   1. ज में atropine के एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन (0.05 मिलीग्राम / किग्रा, bw) के बाद एक सोडियम pentobarbital कौर (55 मिलीग्राम / किग्रा bw) के साथ चूहे intraperitoneally इंजेक्षनइंडस्ट्रीज़ पैर, और subcutaneously पानी में 5% डेक्सट्रोज की प्रशासित 3.0 सीसी.
   2. Pentobarbital सोडियम (27.5 मिलीग्राम / किग्रा, bw) इंजेक्शन के रूप में आवश्यक अनुपूरक. निम्नलिखित प्रक्रिया के दौरान कॉर्निया की रक्षा के लिए आंखों के लिए एक नेत्र एंटीबायोटिक मलहम प्रशासन. हर छह घंटे संज्ञाहरण के दौरान श्वसन स्राव को कम 5% डेक्सट्रोज (3 मिलीग्राम) और atropine (0.05 मिलीग्राम / किग्रा, bw) प्रशासन. उपाय शरीर एक गुदा जांच के माध्यम से तापमान, और एक आत्म विनियमन थर्मल कंबल से 37 डिग्री सेल्सियस पर शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए.
2. या तो द्वारा एमसीए जानें:
   1. Thinning एक 2 x 2 मिमी इमेजिंग / खोपड़ी लगभग पारदर्शी है जब तक एक आकार अश्वशक्ति 3 ड्रिल बिट का उपयोग somatosensory प्रांतस्था के ऊपर खिड़की दृश्यमान करने के लिए और फिर एक आकार अश्वशक्ति 2 ड्रिल बिट का उपयोग पूर्ण पारदर्शिता के thinning. एमसीए के स्थान तो इस खिड़की और प्रारंभिक खंड के लगभग स्थान पर प्रयोग किया जाता है इसके समीपस्थ प्रक्षेपवक्र के माध्यम से देखा जा सकता है. एमसीए आम तौर पर इस पार तिरछे चलेंगेपृष्ठीय दिशा को उदर / दुम (उदाहरण के लिए, को देखने के सर्जन के बिंदु से बाएँ गोलार्द्ध जब देखने के शीर्ष पर सही / नीचे करने के लिए छोड़ दिया है) के लिए एक विजय - स्तम्भ में खिड़की. पर्यवेक्षक एम 1 खंड (प्रांतस्था शाखाओं को समीपस्थ) पहले खिड़की के माध्यम से दिखाई डिस्टल शाखाओं के आधार पर स्थित होने का अनुमान है जहां शल्य खिड़की तो ऊपर बनाया जा सकता है. एमसीए के लिए पहुँच प्राप्त करने के क्रम में हटा दिया जाता है कि खोपड़ी की मात्रा को कम करने के लिए, इमेजिंग / visualizing खिड़की बंद करने के लिए तैनात है, लेकिन शल्य खिड़की से अलग किया जाना चाहिए.
      या
   2. एक छोटी सी शल्य खिड़की लगभग 3 मिमी पूर्वकाल और करीब कट्टर मंच ^30,33,34 को रंध्र ओवेल या जबड़े तंत्रिका पार्श्व 1 मिमी, तैनात किया जाना चाहिए. प्रभावी रूप से एमसीए (भी एम 1 खंड के रूप में जाना जाता है) के स्टेम का उपयोग करने के लिए, temporalis पेशी अस्थायी रूप से खोपड़ी की सतह से दूर दिखाई देता है. (नोट: लंबे समय तक जीवित रहने की सर्जरी के मामले में, हमारी प्रयोगशाला का अनुभव था कर दिया गया हैtemporalis मांसपेशी अपने लंगर में संलग्न रहने के लिए अनुमति देकर टी, मांसपेशियों के स्वस्थ खाने के व्यवहार और शरीर के वजन के प्रभावी रखरखाव के लिए अनुमति देता है, खोपड़ी की सतह के लिए फिर से पानी रखना होगा.
3. अपने प्रारंभिक कॉर्टिकल शाखा है, जहां का अनुमान लगाने के क्रम में इमेजिंग खिड़की की विजय - स्तम्भ, उदर कोने (एक संदर्भ के रूप में इस का उपयोग अगर) को एमसीए का पालन करें.
4. (हम इस शल्य खिड़की के रूप में देखें) एक नया पतली खोपड़ी क्षेत्र बनाएँ थोड़ा विजय - स्तम्भ और इमेजिंग खिड़की (एक संदर्भ के रूप में इस का उपयोग अगर) एमसीए के एम 1 खंड (पूर्व कॉर्टिकल शाखाओं में) होना चाहिए, जहां उदर. महत्वपूर्ण नोट: (एक संदर्भ के रूप में इस का उपयोग करते हैं) और शल्य खिड़की इमेजिंग खिड़की के बीच लगभग एक 2 मिमी अंतराल छोड़ दें.
5. सिर्फ आंकड़े 1 ए और 1 बी के रूप में दिखाया धमनी के cortical शाखाओं से पहले एमसीए के स्टेम (भी एम 1 खंड के रूप में जाना जाता है) का पता लगाएँ.
6. अनुमानित एम 1 खंड स्थान ऊपर खोपड़ी पतली, एक आकार एचपी -3 ड्रिल बिट का उपयोग करना. जबयह पूरी तरह से पारदर्शी है जब तक खोपड़ी कुछ पारदर्शी हो जाता है, और अधिक नाजुक आकार अश्वशक्ति-2 ड्रिल बिट और पतली खोपड़ी के लिए स्विच. शल्य खिड़की क्षेत्र वाहिका देखने के लिए, और इस बिंदु पर एम 1 के स्थान का आकलन और 2-3 मिमी एम 1 खंड की लंबाई के दोनों तरफ ऐसी है कि वहाँ खिड़की (पूरा करने के लिए काफी पतली हो जाता है के रूप में नेत्रहीन की पुष्टि यह अनुमति देता प्रविष्टि के लिए कमरा और एमसीए के दोनों तरफ सीवन सुई से बाहर निकलें).

महत्वपूर्ण नोट: खोपड़ी की मोटाई प्लास्टिक की चादर के समान है जब thinning बंद करो. ड्रिल खोपड़ी और ड्यूरा के माध्यम से टूट जाता है अगर पोत टूटना होगा. खोपड़ी दूसरी ओर काफी पतली नहीं है, रोड़ा के लिए इसे हटाने के लिए मुश्किल हो जाएगा और प्रांतस्था या धमनी को नुकसान में परिणाम सकता है.

7. एक 30 गेज (30 जी) चमड़े के नीचे सुई ले लो और दाँतेदार चिमटी का उपयोग कर, सुई की नोक मोड़.
8. पंचर खोपड़ी देखभाल के लिए 30 जी सुई का प्रयोग करेंपूरी तरह से नहीं सीधे एक धमनी के ऊपर एक क्षेत्र में. चिमटी खोपड़ी समझ और ध्यान से शल्य खिड़की का पतला क्षेत्र को दूर करने के लिए अनुमति देने के लिए इस पंचर छेद का प्रयोग करें.
9. , एक नया 30 जी की जरूरत है ले लो चरण 6 में के रूप में अपनी नोक मोड़, और ध्यान से ड्यूरा हटा दें.

नोट: ड्यूरा काटना इसे छील वापस करने के लिए और एमसीए कम दबाव का एक परिणाम के रूप में और अधिक महत्वपूर्ण हो जाएगा का कारण होगा.

3. एमसीए occluding

1. 3-5 मिमी के बारे में करने के लिए सीवन सुई (दौर 3/8, 16 मिमी सीवन सुई) काटने के नीचे एक आधा वक्र रिवर्स ट्रिम करने के लिए तार कटर का उपयोग करें.
2. चित्रा 4E में चित्र में दिखाया गया के रूप में छंटनी सीवन सुई धागा. महत्वपूर्ण नोट: सीवन धागे के दोनों सिरों बराबर लंबाई की हैं तो सुई पिरोया है कि यह महत्वपूर्ण है. यह दोनों धागे की खींच एक ही समय में एम 1 के तहत समाप्त होता है सक्षम बनाता है, सुई तो एमसीए के आसपास दो समुद्री मील टाई करने के लिए सूत्र के दो लंबाई छोड़ने मुक्त काटा जा सकता है.
3. दाँतेदार चिमटी एम 1 के तहत सीवन सुई पर्ची का प्रयोग करें. प्रांतस्था को नुकसान को कम करने के रूप में के रूप में संभव के रूप में उथले तो रह लेकिन साथ ही एमसीए पर बहुत अधिक तनाव से बचने, एमसीए 0.5-1 मिमी के बारे में दूरी के साथ सम्मिलित करें.
4. सीवन सुई यह एमसीए के तहत है कि इस तरह के दूसरी तरफ से बाहर आता है, फ़ीड करने के लिए जारी रखने या सीवन के दूसरे छोर धक्का जबकि विपरीत दिशा से सीवन सुई की नोक खींचने के लिए (के रूप में नीचे दिखाया गया है) एक ठीक टिप चिमटी से नोचना उपयोग दाँतेदार टिप चिमटी के साथ सुई.
5. सीवन सुई पूरी तरह से एमसीए के तहत पारित हो जाता है और बाहर निकाला गया है, धागे की लम्बाई एमसीए के दोनों तरफ बराबर है जब तक सीवन सुई या धागे पर पुल बने हुए हैं. यह एमसीए पर तनाव कम करने के लिए के माध्यम से तंग आ गया है के रूप में धागे पर नीचे दबाने धागा धमनी के तहत गुजरता टूटना को रोकने के लिए सहायक हो सकता है.
6. सीवन सुई के करीब धागा काटें.
7. दो परिणामस्वरूप सिवनी धागे को सुलझाना दोनों ठीक बिंदु चिमटी का प्रयोग करेंइतना छू नहीं कर रहे हैं कि एमसीए के तहत अनुभूत दो स्वतंत्र सूत्र हैं कि. आदर्श रूप में धागे वे एमसीए के नीचे से गुजरती हैं जहां अलग 1 मिमी के बारे में होगा.
8. समुद्री मील के बीच अंतरिक्ष के ~ 1 मिमी transection के लिए कमरे की अनुमति देने के लिए बनाए रखने के लिए प्रयास करने से एमसीए के आसपास धागे के साथ दो अलग समुद्री मील (दो संयुक्ताक्षर) टाई करने के लिए दोनों अच्छी बात चिमटी का प्रयोग करें.

नोट: एक आंतरिक दिखावा नियंत्रण वांछित है, ढीला तो वे सब पर एमसीए कसना नहीं है कि रोड़ा समुद्री मील छोड़ने रोड़ा तैयार करने और समुद्री मील कस और पोत को काटने से पहले डेटा इकट्ठा. यह पहले रोड़ा के लिए कुछ भी पर पकड़ने को रोकने लेकिन बाद में समुद्री मील की कस अनुमति देने के लिए पर्याप्त धागा छोड़ने के लिए धागा ट्रिम. इस तरह, किसी भी आधारभूत इमेजिंग या डेटा संग्रह रोड़ा और थोड़ा देरी से उचित समय बिंदु पर कड़ा गांठ के रूप में एक ही शल्य आक्रमण के सभी के साथ किया जा सकता है.

9. समुद्री मील हो जाने के बादएन तंग, दो समुद्री मील के बीच में एम 1 आड़ा काट के लिए सूक्ष्म कैंची का उपयोग खींच लिया.
10. : लंबी अवधि, जीवित रहने की पढ़ाई के मामले में
    1. सिवनी बाँझ शल्य धागे के साथ जगह में वापस खोपड़ी फ्लैप छिन्न या बाँझ घाव क्लिप का उपयोग ऊतक सुरक्षित.
    2. घाव क्षेत्र (जैसे Bacitracin मरहम के रूप में) और प्रणालीबद्ध एम्पीसिलीन के रोगनिरोधी इंजेक्शन (150 मिलीग्राम / किग्रा आईएम) के द्वारा करने के लिए स्थानीय स्तर पर एंटीबायोटिक दवाओं के प्रशासन.
    3. विषय आंखों के लिए एक नेत्र एंटीबायोटिक मलहम प्रशासन अभी भी anesthetized है जबकि.
    4. संज्ञाहरण के दौरान श्वसन स्राव को कम करने के लिए पूरक atropine (0.05 मिलीग्राम / किग्रा आईएम) प्रशासन.
    5. सर्जरी के समापन और दर्द नियंत्रण के लिए फिर अगले दिन सुबह (~ 12 घंटे बाद) में subcutaneously flunixin meglumine (1.1 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्षन.
    6. जानवरों नाक (इस जानवर जाग रहा है जब तक सांस लेने की सुविधा) इच्छा पर अपनी पूंछ ऊपर है कि इस तरह के एक सूखे, गर्म, तिरछी सतह पर पशु रखें. </ ली>
    7. यह जाग और अपने दम पर सुरक्षित रूप से आगे बढ़ रहा है जब तक पशु मॉनिटर.
    8. पशु मछली पालने का बाड़ा में वापस आ गया है एक बार, पशु की गतिविधि, उपस्थिति, वोकलिज़ेशन, और खिलाने और व्यवहार पीने दैनिक निगरानी की जानी चाहिए.

4. सुखमृत्यु

1. प्रत्येक प्रयोग के समापन पर, चूहों pentobarbital सोडियम (2-3 मिलीलीटर, intraperitoneally) के साथ euthanized किया जाना चाहिए.

Representative Results

एक पोत के सफल रोड़ा अन्य रक्त प्रवाह इमेजिंग तकनीक में इमेजिंग (LSI) धब्बा लेजर का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती है. एमसीए के प्रमुख कॉर्टिकल शाखाओं में रक्त प्रवाह रिकॉर्डिंग प्रणाली में शोर और तकनीक की संवेदनशीलता के स्तर पर निर्भर करता है ~ 25 आधारभूत का% या उससे कम निम्नलिखित रोड़ा करने के लिए छोड़ देना चाहिए. एमसीए रोड़ा पहले और बाद में एमसीए के एक cortical शाखा के एक खंड के एक प्रतिनिधि LSI छवि के लिए चित्रा 3 देखें. वर्णित रोड़ा तकनीक सभी cortical एमसीए शाखाओं अवरुद्ध, एम 1 खंड में एमसीए के लिए आवेदन किया, और संवेदी उत्तेजना ~ 5 घंटा निम्नलिखित रोड़ा के लिए रोका जाता है, तो परिणाम 28.4 की एक cortical रोधगलितांश है ± 2.4 मिमी ³ (के एक प्रतिनिधि राज्याभिषेक टुकड़ा के लिए एक 2,3,5-Triphenyl-tetrazolium क्लोराइड [टीटीसी] वर्णित क्षति के साथ दाग मस्तिष्क, देखें चित्र 2, पीला बेदाग क्षेत्र) ²⁵ रोधगलितांश से मेल खाती है.

चित्रा 1. पीला तीर एम 1 खंड पर pMCAO की अनुमानित स्थान का संकेत मिलता है. इस रोड़ा उदाहरण इस प्रकार केवल कॉर्टिकल शाखाओं को रक्त की आपूर्ति में कटौती, पूर्व सभी cortical शाखाओं को, lenticulostriate शाखाओं को एमसीए सिर्फ बाहर का occluding शामिल है. पार्श्व cortical सतह पर एमसीए की (ए) आरेख. (बी) कोरोनल अनुमानित एमसीए कॉर्टिकल के मद्देनजर और subcortical शाखा स्थानों. इस क्षेत्र के लिए उपयोग की एक अपेक्षाकृत इनवेसिव शल्य प्रक्रिया की आवश्यकता है, हालांकि शाखाओं lenticulostriate को समीपस्थ एमसीए का रोड़ा, cortical और subcortical रोधगलितांश में परिणाम होगा कि ध्यान दें. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2. PMCAO (5 घंटा निम्नलिखित रोड़ा के लिए सुरक्षात्मक संवेदी उत्तेजना को कम करने के लिए लिया देखभाल के साथ) से उत्पन्न रोधगलितांश दिखा एक चूहे के मस्तिष्क से एकल प्रतिनिधि राज्याभिषेक टुकड़ा. 2,3,5-Triphenyl-tetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) समाधान दाग स्वस्थ ऊतकों लाल और कोशिका मृत्यु या रोधगलितांश (तीर द्वारा इंगित) पीला के क्षेत्रों को छोड़ देता है. रोड़ा के स्थान (पूर्व सभी एमसीए कॉर्टिकल शाखाओं लेकिन subcortical शाखाओं को बाहर करने के लिए) की वजह से केवल कॉर्टिकल रोधगलितांश मनाया जाता है कि ध्यान दें, और मस्तिष्क की अत्यधिक मेलिनकृत क्षेत्रों के बावजूद, टीटीसी समाधान नहीं लेते हैं और इसलिए सफेद रंग में ही रहेगा संरचनात्मक रूप से बरकरार जा रहा है.

चित्रा 3. छवि पहले एमसीए के एक एकल कॉर्टिकल शाखा के एक हिस्से में प्रवाह को दर्शाया गया है और एकfter pMCAO रूप इमेजिंग (LSI) धब्बा लेजर का उपयोग imaged. गरम रंगों मजबूत प्रवाह का संकेत मिलता है. वर्णित एमसीए शाखा pMCAO निम्नलिखित ऊपरी दाहिने कोने करने के लिए छोड़ दिया कम से आधारभूत छवि (बाएं) traversing स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है और गायब हो जाता है. नोट: कभी कभी प्रवाह की कुछ न्यूनतम सबूत किसी दिए शाखा में बनी हुई है, लेकिन निम्नलिखित pMCAO स्तरों रोड़ा सफलता पुष्टि करने के लिए आधारभूत प्रवाह का 20% या उससे कम समय के लिए छोड़ देना चाहिए.

. चित्रा 4 सर्जिकल उपकरण pMCAO के लिए आवश्यक (ए) के अतिरिक्त ललित Graefe संदंश -.... 0.5 मिमी टिप्स थोड़ा सा कर्व (बी) सिरेमिक लेपित ड्यूमॉन्ट # 5 संदंश (सी) के अतिरिक्त ललित बॉन कैंची, सीधे (डी) दौर 3/8 (16 मिमी) सिवनी सुई (ई). नोट: सीवन सुइयों श हो सकता हैउपयोगकर्ता वरीयता के अनुसार तार कटर के माध्यम से ortened. तार कटर के साथ छोटा करने के बाद, सीवन सुई निष्फल होना चाहिए. (एफ) 6-0 लट रेशम सीवन. लंबाई में (जी) 30 गेज सुई, आधा.

Discussion

इस प्रोटोकॉल कृंतक प्रांतस्था भीतर ischemia प्रेरित करने के लिए, और प्रयोगात्मक विषयों के लिए न्यूनतम परिधीय प्रभाव के साथ ऐसा करने के क्रम में विकसित किया गया था. डबल रोड़ा और transection विधि पोत स्थायी रूप से occluded किया गया है कि दृश्य पुष्टि के लिए अनुमति देता है, और अत्यधिक आक्रमण या ऊतकों को नुकसान के बिना, और एक उच्च जीवित रहने की दर के साथ किया जा सकता है. इस रोड़ा प्रोटोकॉल एक विशिष्ट cortical डोमेन के भीतर ischemia प्रेरित करने के लिए कपाल - उच्छेदन के माध्यम से पहुँचा जा सकता है कि किसी भी कॉर्टिकल पोत के लिए लागू किया जा सकता है. एक पशु ऐसे कार्यात्मक इमेजिंग या electrophysiological रिकॉर्डिंग के रूप में विभिन्न अनुसंधानात्मक तकनीक, का एक साथ उपयोग की अनुमति एक stereotaxic तंत्र में है जबकि इसके अलावा, इस तरह के occlusions किया जा सकता है. यह भीतर विषय जांच सहित प्रयोगात्मक डिजाइन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू इस रोड़ा तकनीक बनाता है. उदाहरण के लिए, मूल्यांकन arter चारों ओर जगह में टांके के साथ आधारभूत में किया जा सकता है(y लेकिन पूर्व टांके हासिल करने और transecting के लिए), इस्कीमिक शुरुआत के दौरान, और किसी भी पद रोड़ा समय बिंदु पर की आवश्यकता है.

इस रोड़ा के सफल क्रियान्वयन के दो महत्वपूर्ण कदम पर प्रासंगिक है. लक्ष्य पोत पहले, उचित दृश्य उत्प्रेरण ischemia के लिए महत्वपूर्ण है. (एमसीए के प्राथमिक पीछे / पूर्वकाल कॉर्टिकल विभाजन को सिर्फ समीपस्थ हमारे ठेठ मामले में) को समीपस्थ या इच्छित स्थान के लिए बाहर एक स्थान पर रोड़ा रोधगलितांश मात्रा परिवर्तनशीलता की एक बड़ी डिग्री में परिणाम कर सकते हैं, तो ध्यान पुष्टि करने के लिए लिया जाना चाहिए रोड़ा और transection के समुचित साइट. दूसरा, लक्ष्य धमनी के आसपास सीवन सुई गुजर सावधान और सटीक तकनीक की आवश्यकता है. आवश्यकता से, सिवनी तुरंत धमनी नीचे प्रांतस्था का सबसे सतही परत के माध्यम से समाप्त हो जाएगी. इस ओ पर पोत टूटना, नकसीर, या मस्तिष्क को नुकसान में परिणाम सकता है क्योंकि देखभाल, cortical सतह के भीतर भी गहरी डाइविंग से बचने के लिए लिया जाना चाहिएcclusion साइट. रक्त वाहिका रोड़ा सर्जिकल उपकरण के कई प्रकार के उपलब्ध हैं, हमारी प्रयोगशाला प्रयोगकर्ता वरीयता के अनुसार छोटा कर दिया आधा वक्र सीवन सुइयों का उपयोग करते हुए सबसे अधिक सफलता मिली है. अल्ट्रा ठीक संदंश के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया, इस उपकरण उपयोगकर्ता एक धमनी के नीचे और केवल न्यूनतम ऊतकों को नुकसान के साथ cortical सतह से ऊपर सिवनी धागे पारित करने के लिए अनुमति देता है.

एक रोड़ा के सफल समापन पर, रोधगलितांश प्रांतस्था अकेले (चित्रा 2) तक सीमित है. मॉडल एमसीए स्ट्रोक को इस रोड़ा विधि का उपयोग करने के संदर्भ में, यह कई एमसीए स्ट्रोक रोगियों प्रांतस्था और बेसल ganglia दोनों भीतर रोधगलितांश बनाए रखने दिया है कि शोधकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हो सकते हैं. Intralumi से गुजरना है कि सभी विषयों के 47% में बिगड़ा चबाना, निगलने समारोह, और बिगड़ा मोटर प्रदर्शन होती है कि हाल ही में निष्कर्ष दिया ऐसे intraluminal सीवन के रूप में तकनीक पर एमसीए करने के लिए आवेदन के रूप में हालांकि, हमारी प्रयोगशाला में इस रोड़ा विधि के पक्ष मेंएनएएल सिवनी ^35, बिगड़ा मस्तिष्क छिड़काव और कम खाना और पानी के तेज से उत्पन्न सहज मोटर गतिविधि कम भी intraluminal सीवन ^36-40 निम्नलिखित चूहों में गरीब स्नायविक वसूली के लिए योगदान करते हैं. ट्रूमैन एट अल. 2011 भी असामान्य खाने, बिगड़ा पीने के व्यवहार, और यह प्रक्रिया ¹¹ के बाद ज्ञानेन्द्रिय विकलांगता (के रूप में चिपकने वाला हटाने के कार्य द्वारा मात्रा) को सूचित किया है. गंभीर, हम दिखावा intraluminal सीवन जानवरों ¹¹ में एक ही व्यवहार घाटे मनाया. नतीजतन, intraluminal सीवन मस्तिष्क इस्कीमिक स्ट्रोक के लिए सीधे शल्य प्रक्रिया के कारण और नहीं कर रहे हैं जो की preclinical स्ट्रोक अध्ययन में कई गंभीर कारकों जोड़ सकते हैं.

यह चर एटियलजि और मानव इस्कीमिक स्ट्रोक की विकृति मॉडल करने के लिए असंभव है - वास्तव में परिवर्तनशीलता के इस तरह के एक उच्च स्तर के एक प्रयोगात्मक मॉडल में अवांछनीय होगा. पशुओं में स्ट्रोक अनुसंधान Instea चाहिएघ सबसे अच्छा संभव के रूप में मॉडल एटियलजि का प्रयास करते हुए मानव स्ट्रोक क्षति और घाटे के लिए और अधिक अनुरूप परिणाम के उत्पादन पर ध्यान केंद्रित. हम न्यूनतम इनवेसिव प्रकृति, मानव एमसीए ischemia के लिए तुलनीय है कि इशेमिया, रोधगलितांश मात्रा में जिसके परिणामस्वरूप एमसीए का रोड़ा, और pMCAO साथ कई अनुसंधानात्मक तकनीक को शामिल करने की क्षमता इस विधि कुछ पूर्व नैदानिक ​​स्ट्रोक जांचकर्ताओं के लिए एक आकर्षक विकल्प बना सकता है. इसके अतिरिक्त, pMCAO द्वारा यहाँ मॉडलिंग की आड़ विधि किसी भी सतह कॉर्टिकल पोत occluding के लिए एक वैकल्पिक, कम आक्रामक, प्रभावी साधन प्रदान करता है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extra Fine Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Slight Curve (1)	Fine Science Tools	11151-10
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2)	Fine Science Tools	11252-50
Extra Fine Bonn Scissors, straight (1)	Fine Science Tools	14084-08
Round 3/8 (16 mm) Suture Needles	Fine Science Tools	12050-02
6-0 Braided Silk Suture	Fine Science Tools	NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461
30 gauge needle, ½" length	Fine Science Tools	NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL