Summary
Wir beschreiben eine sehr reproduzierbare Methode zur dauerhaften Verschluss von einem Nagetier großen zerebralen Blutgefäßen. Diese Technik kann mit sehr wenig peripheren Schäden, minimale Blutverlust, eine hohe Rate der langfristigen Überleben und konsistente Infarktvolumen Einklang mit der menschlichen klinischen Bevölkerung erreicht werden.
Abstract
Der Schlaganfall ist eine führende Ursache von Tod, Invalidität, Verlust und sozioökonomischen weltweit. Die Mehrheit aller Schlaganfälle resultieren aus einer Unterbrechung der Durchblutung (Ischämie) 1. Mittleren Hirnarterie (MCA) liefert eine große Mehrheit von Blut in der Seitenfläche des Kortex 2 ist die häufigste Lokalisation der menschlichen Schlaganfall 3 und Ischämie in seinem Hoheitsgebiet in umfangreichen Dysfunktion oder Tod 1,4,5 führen. Überlebende des ischämischen Schlaganfalls leiden oft unter Verlust oder Störungen der motorischen Fähigkeiten, sensorische Defizite und Infarkt. In dem Bemühen, diese wichtigen Eigenschaften eines Schlaganfalls zu erfassen, und dadurch wirksame Behandlung wird ein großer Wert auf Tiermodellen für Ischämie bei MCA platziert.
Hier präsentieren wir eine Methode dauerhaft Verschließen eines kortikalen Oberfläche der Blutgefäße. Wir präsentieren diese Methode an einem Beispiel eines relevanten Gefäßverschluss, dass die häufigste Art, Lage und outcom modellierte der menschlichen Schlaganfall, permanent mittleren Hirnarterie (pMCAO). In diesem Modell, wir chirurgisch freizulegen MCA in der erwachsenen Ratte und anschließend per Doppelklick Ligatur und Durchtrennung des Gefäß zu verschließen. Diese pMCAO blockiert die proximalen kortikalen Zweig MCA, wodurch Ischämie in allen MCA kortikalen Gebiet ein großer Teil der Hirnrinde. Diese Methode der Okklusion auch mehr distalen Abschnitte der kortikalen Gefäße zu verschließen, um mehr fokale Ischämie-Aktionen in einem kleineren Bereich des Kortex zu erreichen. Die Hauptnachteile pMCAO sind, dass das chirurgische Verfahren ein wenig invasive als kleiner Craniotomie ist erforderlich, um MCA zugreifen, auch wenn dies zu einer minimalen Gewebeschäden. Die wichtigsten Vorteile dieses Modells sind jedoch: die Stelle des Verschlusses ist gut definiert, der Grad der verminderte Durchblutung ist konsistent, funktionale und neurologische Beeinträchtigung erfolgt rasch, ist Infarktgröße konsistent und die hohe Rate der Überleben ermöglicht lange Begriff chronische Einschätzung.
Introduction
Um ischämischen Bedingungen, die effektiv zu imitieren menschliche ischämischen Schlaganfall zu induzieren, werden mehrere Tier Takt Modelle weit verbreitet eingesetzt wird, mit unterschiedlichen Volumina resultierenden Infarkt. Im photothrombotic Modell wird das Gehirn durch die intakte Schädel bestrahlt mit Laserbestrahlung nach intravenöser Injektion einer lichtempfindlichen Substanz (wie Rose-Bengal), was zu photochemischen Koagulation, Verstopfung der bestrahlten Gefäße und Ischämie in das umgebende Gewebe 6, 7. Photothrombose können in sehr kleinen, isolierten Regionen Infarkt führen und ist in der Regel als Mittel der Modellierung "Mini-Schlaganfälle" oder "Mikro-Schläge" verwendet.
Der breitere Anwendung Technik zum Induzieren ischämischen Schlaganfall, insbesondere in der mittleren zerebralen Arterie (MCA), das intraluminale Monofilament Modell 8, bei dem ein Filament chirurgisch in die äußere Halsschlagader eingeführt und vorgeschoben, bis die Spitze die Basis verschließt MCA. A primary Herausforderung intraluminale Filament Okklusion ist die hohe Sterblichkeit (70% bei MCA für 3 Stunden, eine relevante Zeitpunkt für Schlaganfall-Forschung verschlossen ist) 9. Andere Probleme mit der Methode einbezogen möglich Subarachnoidalblutung, unvollständige Okklusion und variable Infarktvolumen 10,11. Dieses Modell führt zu einer umfangreichen Grad der Infarkt sowohl im Cortex und subkortikal 12 und ein Modell eines menschlichen massiven Schlaganfall.
Obwohl sowohl Mikro-und schweren Schlaganfall Modelle wichtig sind, sind menschliche Schlaganfälle typischerweise irgendwo dazwischen. In großen klinischen Studien, Schlaganfall Infarkt reicht in der Größe von 28 bis 80 cm 3, die 4,5 bis 14% der ipsi-ischämische Hemisphäre 9 übersetzt. Im Vergleich dazu unsere Ratte pMCAO Infarkt Größe reicht von etwa 9-35 mm 3, die 3 bis 12% der ipsi-ischämische Hemisphäre darstellt. Unsere pMCAO Modell, daher ähnelt menschlichen ischämischen Schlaganfall Infarkt Bände Prozentsatz des GehirnsVolumen.
Neben der Modellierung der strukturellen Schädigung von Schlaganfall, pMCAO Ergebnisse in funktionale und Verhaltensdefiziten ähnlich dem menschlichen Zustand. Zumindest ein effektives Modell für Schlaganfall führt zu einer Bewegung Defizite Gegenseite zu streicheln Schaden 13-15, Verlust oder Störung der motorischen und sensorischen Funktion 16,17, Verlust oder Störung der neuronalen Aktivität hervorgerufen 16,18, Ermäßigungen in Hirndurchblutung 19, 20 und 21,22 Infarkt. Dementsprechend hat sich unsere pMCAO Modelle eine ernsthafte Verschluss der MCA in körperlicher Behinderung, Verlust der Funktion innerhalb des sensorischen Kortex (und benachbarten Kortex), Störung der neuronalen Aktivität, eine starke Reduktion in MCA Blutfluss und Infarkt-Kennzeichen Attribute des ischämischen Schlaganfalls 23 -25 daher als wirksames Modell der menschlichen Schlaganfall.
Prozedural beinhaltet pMCAO eine kleine Kraniotomie, in denen wir vorsichtig den Schädel und Duraa 2 x 2 mm "chirurgischen Fenster" über den ersten (M1) Segment der MCA, kurz vor der Gabelung der primären MCA in den vorderen und hinteren kortikalen Äste (1A und 1B). Wir passieren eine halbe Kurve Negativ Schneiden Nähnadel und Faden (6-0 Seide) durch die Pia Schicht der Hirnhäute, unterhalb und oberhalb des MCA kortikalen Oberfläche (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte für die chirurgische Versorgung notwendig für die Durchführung pMCAO ). Wir haben dann eine doppelte Ligatur binden, ziehen Sie die beiden Knoten um MCA und durchschneiden das Schiff zwischen den beiden Knoten. Die doppelte Ligatur und Durchtrennung durch M1 tritt nur distal der lentikulostriatalen Verzweigung, so dass nur die kortikalen Äste betroffen MCA-also nur kortikalen Infarkt (kein subcortical Schaden) tritt 26,27 (Abbildung 2) sind. Obwohl menschlichen Schlaganfall oft mit subkortikalen Infarkt, Modellierung dies bei Nagern erfordert erhöhte Invasivität (Verschließen Hirngefäße vor kortikalen Branching erfordert Zugriff Arterien über die Halsschlagader in den Hals und erfordert zusätzliche Einschlüsse) in Technik und erhöhte Variabilität in Infarktgröße. Das hier beschriebene Modell kann nicht mehr proximal durchgeführt werden, wie den Zugriff auf frühere Zweige der MCA ist nicht über eine einfache Kraniotomie möglich. Zwar mag es möglich, eine chirurgisch subkortikalen Infarkt über pMCAO induzieren würde Okklusion bringen eine extrem invasive Verfahren und ist daher nicht ideal.
Wirksamkeit der Okklusion kann über Laser-Doppler-oder Laser-Speckle-Imaging 12,24,25 (Abbildung 3) oder histologisch post-mortem (Abbildung 2) bestätigt werden. Es sollte angemerkt werden, dass die bisherigen Untersuchungen haben gezeigt, dass sensorische Stimulation kann eine wichtige Rolle in der Entwicklung und das Ergebnis der Infarkt spielen; verleiht Schutz vor Beschädigung, wenn innerhalb von 2 h pMCAO verabreicht und verursacht einen Anstieg in der Schlaganfall-Schaden, wenn bei 3 Stunden nach pMCAO verabreicht 24,25,28. Wir haben bestätigt, dass bei 5 h nach pMCAO, Stimulation nicht mehr wirkt zum Ergebnis (unveröffentlichte Daten). Daher sollten sensorische Stimulation von Themen für 5 Stunden nach Infarkt zu pMCAO Bände mit minimaler Variabilität erhalten minimiert werden. Dementsprechend läuft unsere Gruppe "unbehandelten Kontrollen" dieser Art, indem sie narkotisierten Ratten für 5 Stunden nach der pMCAO, in der Dunkelheit, mit minimal sensorische Stimulation, und ausdrücklich nicht Whisker Stimulation.
Es sollte ferner angemerkt werden, dass gelegentliche Variation MCA Struktur, einschließlich übermäßiger Verzweigung, mehrere primäre Segmente oder das Fehlen der Kommunikation Arterien mit einer Frequenz von 10 bis 30% in erwachsenen männlichen Sprague Dawley Ratten 29,30 auftreten. Wenn Anomalien in MCA beobachtet werden, ist es ratsam, nicht zu diesem speziellen Thema wie das Hinzufügen Tiere mit solchen Gefäßveränderungen wird Infarkt Variabilität erhöhen verwenden.
Darüber hinaus gibt es verschiedene praktische Aspekte our Verfahren, die diese Methode vorteilhaft Okklusion für Schlaganfall Untersuchung zu machen. Erstens kann Nähte rund um die Arterie platziert werden, aber nicht angezogen, um eine Beurteilung der Ausgangslage, von post-ischämische Einschätzung nach Unterbindung und Durchtrennung gefolgt sammeln. Auf diese Weise ist die chirurgische Zubereitung, die für den Verschluss wirksam für gesteuert wird, innerhalb der Subjekte. Da Fächer kann stationär bleiben oder in einem stereotaktischen Rahmen während Okklusion ist es möglich, experimentelle Bestimmung der einzelnen Fächer vor leiten, während und nach der Okklusion, ohne den Gegenstand zu stören oder jede Versuchsanordnung verwendet 25,28. Darüber hinaus führt dieses Verfahren zu einer sehr geringen Sterblichkeit, auch innerhalb Alters Nagetier Themen 21-24 Monate alt (äquivalent zu einem älteren Menschen) 31, und können daher verwendet werden, um Behandlungen Schlaganfall bei Ratten zu beurteilen, die genauer modellieren die häufigste Altersklasse von Schlaganfall-Kranken 25,28. Schiff transection dient auch mehrere praktische Zwecke. Das Fehlen von Blutungen nach Durchtrennung bestätigt, dass das Schiff wurde komplett an beiden Seiten Ligatur verschlossen. Zusätzlich sorgt eine permanente Störung Durchtrennung des Blutflusses. Schließlich sorgt, dass eine Durchtrennung des Blutflusses in den distalen Abschnitten des verschlossenen Gefäßes erfasst muss von einer anderen Quelle kommen.
Schließlich, obwohl wir beschreiben speziell diese Technik zur Okklusion MCA in diesem Manuskript und Video kann die gleiche Doppel-Ligatur Durchtrennung Technik irgendeinem Hirngefäßes die über Craniotomie zugegriffen werden kann, angewendet werden. Unser Labor, zum Beispiel in Verbindung pMCAO genutzt mit mehreren zusätzlichen dauerhaften Verschlüssen der distalen Äste MCA, um sowohl primäre und Sicherheiten Blutfluss 24 in einer Art und Weise zu blockieren ähnlich Techniken entwickelt, um selektiv induzieren Ischämie im primären somatosensorischen Kortex 32.
Abschließend tseine Methode zur permanenten Okklusion zu MCA angewendet eng modelliert drei primären Facetten des menschlichen ischämischen Schlaganfall: die häufigste Lokalisation (MCA), Typ (Ischämie), und der Grad der Beschädigung (Infarkt) mit der klinischen Literatur Schlaganfall. Darüber hinaus kann diese Methode der Okklusion auf einzelne oder mehrere Seiten Okklusion im gesamten Gehirn angewendet werden und kann bei älteren Patienten mit einer hohen Rate des Überlebens durchgeführt werden. Angesichts der dynamischen, permanent, und relativ nicht-invasive Natur dieses Okklusion, stellt diese Technik ein zusätzliches Werkzeug für die präklinische Evaluierung Forscher neue Ansätze für den Schutz vor und Behandlung von Schlaganfällen.
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Protocol
1. Erste Schritte: Erforderlich Chirurgische Instrumente
Siehe Abbildung 4.
- Dental Bohrer (Kavo Dental Equipment, Model: UMXL-TM), 2-Bit-Bohrer und 3-Bit-Bohrer
- Zwei ~ 30 Gauge Injektionsnadeln
- Scharfe Pinzette, gebogene Spitze optional (kann hilfreich sein, aber nicht unbedingt erforderlich)
- Zwei feine Spitze Pinzette
- Drahtschneider
- Nahtfaden
- Micro Schere
2. Erstellen des OP-Fenster
- Anästhesie: Die Verfahren sind in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien und wurden von UC Irvine Animal Care und Use Committee genehmigt worden. Versuchspersonen sind 295-400 g männlichen Sprague Dawley Ratten (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) und die folgende Prozedur Anästhesie verwendet werden soll:
- Spritzen Ratte intraperitoneal mit einer Natrium-Pentobarbital Bolus (55 mg / kg KG) durch eine intramuskuläre Injektion von Atropin (0,05 mg / kg, bw) in der h gefolgtind Bein, und verabreichten 3.0 cc von 5% Dextrose in Wasser subkutan.
- Nachtrag von Natrium-Pentobarbital (27,5 mg / kg, bw) Injektionen nach Bedarf. Verwalten eine ophthalmologische antibiotische Salbe für die Augen, um die Hornhäute in den folgenden Verfahren zu schützen. Verwalten 5% Dextrose (3 ml) und Atropin (0,05 mg / kg, bw) alle sechs Stunden verringern Sekreten während der Narkose. Messen der Körpertemperatur über eine rektale Sonde und pflegen Körpertemperatur bei 37 ° C durch einen sich selbst regulierenden Wärmedecke.
- Suchen Sie den MCA entweder durch:
- Ausdünnen eines 2 x 2 mm Bildgebung / Visualisierung Fenster über dem somatosensorischen Kortex mit einer Größe HP 3 Bohrer bis der Schädel ist nahezu transparent und dann dünner die volle Transparenz über eine Größe HP 2 Bohrer. MCA Standort kann dann durch dieses Fenster und seinem proximalen und Weise verwendet werden, um ungefähr die Position des ersten Segments zu sehen. MCA wird in der Regel diagonal laufen über dieseFenster in einem rostral nach kaudal / ventral nach dorsal Richtung (zB von links nach rechts / unten nach oben, wenn sich linke Hemisphäre von Chirurgen Sicht). Chirurgisches Fenster kann dann oben erstellt werden, wenn der Beobachter schätzt die M1 Segment (proximal kortikalen Verzweigung) auf der Basis der distalen Äste sichtbar durch das erste Fenster befinden. Um die Menge des Schädels, der entfernt zu minimieren, um den Zugang zu MCA erhalten, sollte die Imaging / Visualisierung Fenster Nähe positioniert werden, aber getrennt von dem chirurgischen Fenster.
Oder - Eine kleine chirurgische Fenster sollte etwa 3 mm vor und 1 mm lateral des Foramen ovale oder Mandibularnerv nahe dem Bogen Tribüne 30,33,34 angeordnet sein. Um effektiv auf die Stamm der MCA (auch als M1-Segment bekannt), wird der M. temporalis vorübergehend weg vom Schädel Oberfläche reflektiert. (Hinweis: Im Falle der langfristige Überleben Operationen, hat unser Labor Erfahrung gewesen that, indem der Musculus temporalis bleiben, der mit seinem Anker wird der Muskel der Kopfoberfläche wieder anlagern, so dass für ein gesundes Essverhalten und wirksame Aufrechterhaltung des Körpergewichts.
- Ausdünnen eines 2 x 2 mm Bildgebung / Visualisierung Fenster über dem somatosensorischen Kortex mit einer Größe HP 3 Bohrer bis der Schädel ist nahezu transparent und dann dünner die volle Transparenz über eine Größe HP 2 Bohrer. MCA Standort kann dann durch dieses Fenster und seinem proximalen und Weise verwendet werden, um ungefähr die Position des ersten Segments zu sehen. MCA wird in der Regel diagonal laufen über dieseFenster in einem rostral nach kaudal / ventral nach dorsal Richtung (zB von links nach rechts / unten nach oben, wenn sich linke Hemisphäre von Chirurgen Sicht). Chirurgisches Fenster kann dann oben erstellt werden, wenn der Beobachter schätzt die M1 Segment (proximal kortikalen Verzweigung) auf der Basis der distalen Äste sichtbar durch das erste Fenster befinden. Um die Menge des Schädels, der entfernt zu minimieren, um den Zugang zu MCA erhalten, sollte die Imaging / Visualisierung Fenster Nähe positioniert werden, aber getrennt von dem chirurgischen Fenster.
- Folgen Sie dem MCA rostral, ventralen Ecke der Bildgebung Fenster (bei Verwendung dieses als Referenz), um abzuschätzen, wo seine anfängliche kortikale Niederlassung liegt.
- Erstellen Sie eine neue Dünnschicht-Schädel Region (wir bezeichnen dies als die chirurgische Fenster) etwas rostral und ventral der Bildgebung Fenster (bei Verwendung dieses als Referenz), wo die M1-Segment (pre-kortikalen Verzweigung) der MCA sein sollte. WICHTIGER HINWEIS: Lassen Sie etwa eine 2 mm Spalt zwischen der Bildgebung Fenster (bei Verwendung dieses als Referenz) und der chirurgischen Fenster.
- Suchen Sie den Stiel des MCA (auch als M1-Segment bekannt) kurz vor kortikalen Verzweigung der Arterie wie in den 1A und 1B gezeigt.
- Mit einer Größe HP-3 Bohrer, dünn der Schädel über dem geschätzten Segment M1 Lage. Wenn derSchädel wird etwas transparent, der zarter Größe HP-2 Bohrer und dünn der Schädel wechseln, bis es vollständig transparent ist. Bestätigen visuell als chirurgische Fensterfläche wird dünn genug, um Gefäße zu sehen, und beurteilen die Lage der M1 an dieser Stelle und füllen Sie das Fenster, so dass es 2-3 mm auf beiden Seiten der Länge des M1-Segment (dies lässt Raum zum Einsetzen und Ausgang der Nähnadel zu beiden Seiten des MCA).
WICHTIGER HINWEIS: Stoppen Ausdünnung, wenn die Dicke des Schädels ist ähnlich der Plastikfolie. Das Gefäß reißt, wenn der Bohrer bricht durch den Schädel und Dura. Wenn der Schädel ist dünn genug, auf der anderen Seite, wird das Entfernen es zur Occlusion schwierig und kann zu Schäden an der Rinde oder Arterie führen.
- Nehmen Sie eine 30-Gauge (30 G) Injektionsnadel und biegen Sie die Spitze der Nadel, mit Wellenschliff Pinzette.
- Nutzen Sie die 30 G Nadel zu durchstechen der Schädel Pflegevollständig in einem Bereich nicht direkt über einer Arterie. Verwenden Sie diese Punktionsloch damit Pinzette Schädel erfassen und entfernen Sie vorsichtig den verdünnten Bereich der chirurgischen Fenster.
- Nehmen Sie eine neue 30 G Notwendigkeit, beugen ihre Spitze wie in Schritt 6, und entfernen Sie vorsichtig die Dura.
HINWEIS: Schneiden die Dura wird dazu führen, dass schälen und MCA wird mehr im Vordergrund, als Folge der verminderten Druck.
3. Verschließen der MCA
- Verwenden Sie Drahtschneider, um eine halbe Kurve rückwärts Schneiden Nähnadel (rund 3/8, 16 mm Nähnadel) auf ca. 3-5 mm schneiden.
- Führen Sie das getrimmt Nähnadel, wie im Bild in 4E gezeigt. Wichtiger Hinweis: Es ist wichtig, dass die Nadel mit Gewinde versehen ist, so dass beide Enden des Fadens gleicher Länge sind. Dies ermöglicht das Ziehen der beiden Fadenenden M1 in der gleichen Zeit, kann die Nadel dann freigeschnitten verlassen zwei Längen des Fadens die beiden Knoten um MCA binden.
- Verwenden Sie die gezackten der Pinzette rutschen die Nähnadel unter M1. Legen Sie mit ca. 0,5-1 mm Abstand von MCA, bleiben so flach wie möglich, um Schäden an der Rinde zu minimieren, sondern die Vermeidung von zu viel Belastung auf MCA als gut.
- Wenn die Nähnadel heraus kommt die andere Seite, so dass es unter MCA ist, verwenden Sie eine feine Spitze Pinzette (siehe unten), um die Spitze der Nähnadel von der gegenüberliegenden Seite zu ziehen, während weiterhin füttern oder Schieben Sie das andere Ende des Fadens Nadel mit der gezackten Spitze Pinzette.
- Sobald die Nähnadel ist komplett unter MCA geführt und herausgezogen wurde, weiterhin auf die Nähnadel oder Faden ziehen, bis die Länge des Fadens ist gleich auf beiden Seiten des MCA. Durch Drücken auf den Faden, wenn es durch den Druck auf MCA minimieren zugeführt können hilfreich sein, um zu verhindern, wie Bruch der Faden läuft unter der Arterie.
- Schneiden Sie den Faden in der Nähe der Nähnadel.
- Benutzen Sie beide feine Spitze Pinzette, um die beiden entstehenden Faden zu entwirrens so, dass es zwei unabhängige Threads unter MCA aufgereiht, die nicht berührt werden. Idealerweise werden die Threads über 1 mm auseinander sind, wenn sie unter MCA sein.
- Benutzen Sie beide feine Spitze Pinzette, um zwei separate Knoten (zwei Ligaturen) mit den Themen rund um MCA versuchen zu behaupten, dass ~ 1 mm Platz zwischen den Knoten, um Platz für Durchtrennung erlauben binden.
HINWEIS: Wenn eine interne Schein erwünscht ist, bereiten die Okklusion Verlassen der Okklusion Knoten locker, so dass sie nicht einengen MCA überhaupt und sammeln Daten vor dem Anziehen der Knoten und Schneiden des Schiffes. Schneiden Sie den Faden zu verhindern, dass sie ihn über alles vor der Okklusion, aber lassen Sie genügend Faden um die Verschärfung der Knoten später. Auf diese Weise kann jede Grundlinie Bildgebung oder Datenerfassung mit all den gleichen operativen Eingriff als der Okklusion und der Knoten auf der geeigneten Zeitpunkt mit wenig Verzögerung angezogen durchgeführt werden.
- Sobald die Knoten haben seinen straff gezogen, verwenden Sie die Mikro-Schere M1 zwischen den beiden Knoten durchschneiden.
- Im Falle der langfristigen Überleben Studien:
- Naht eingeschnitten Kopfhaut Klappe wieder an ihrem Platz mit sterilen chirurgischen Faden oder sichern Sie die Gewebe mit sterilen Wundklammern.
- Verwalten Antibiotika lokal auf die Wunde Bereich (z. B. Bacitracin Salbe) und systemisch durch prophylaktische Injektion von Ampicillin (150 mg / kg IM).
- Obwohl die vorliegende noch narkotisierten Verwaltung einer ophthalmischen antibiotische Salbe auf die Augen.
- Verwalten ergänzende Atropin (0,05 mg / kg IM) zu den Sekreten während der Narkose zu verringern.
- Spritzen Flunixinmeglumin (1,1 mg / kg) subkutan am Ende der Operation wieder am nächsten Morgen (~ 12 Stunden später) zur Schmerzbehandlung.
- Legen Sie das Tier auf einem trockenen, warmen, abgeschrägte Oberfläche, so dass die Tiere Nase über ihren Schwanz auf der Steigung ist (dies erleichtert die Atmung, bis das Tier wach ist). </ Li>
- Überwachen Sie das Tier, bis es wach und sicheren Transport auf seine eigene ist.
- Sobald das Tier zurück in das Vivarium, das Tier Aktivität sollten Aussehen, Lautäußerungen und Fütterung und Trinkverhalten täglich überwacht werden.
4. Sterbehilfe
- Am Ende jedes Experiments sollten Ratten mit Natrium-Pentobarbital (2-3 ml, intraperitoneal) eingeschläfert werden.
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Representative Results
Erfolgreiche Verschluss eines Gefäßes kann bestätigt werden mittels Laser Speckle-Imaging (LSI) unter anderem die Durchblutung bildgebenden Verfahren werden. Der Blutfluss in der großen kortikalen Zweige MCA sollte ~ 25% des Ausgangswertes oder weniger nach einem Verschluss abhängig von der Höhe des Rauschens in dem Aufzeichnungssystem und Empfindlichkeit der Technik fallen. Abbildung 3 zeigt eine repräsentative LSI Bild von einem Segment eines kortikalen Zweig MCA vor und nach der MCA-Okklusion. Wenn die beschriebene Technik zur Okklusion MCA am Segment M1 angelegt wird, das Blockieren aller kortikalen MCA Äste und sensorische Stimulation für ~ 5 Stunden nach einem Verschluss verhindert, ist das Ergebnis ein kortikalen Infarkt von 28,4 ± 2,4 mm 3 (für einen repräsentativen Kranzscheibe von eine 2,3,5-Triphenyl-Tetrazoliumchlorid [TTC] gebeizt Gehirn mit der beschriebenen Schäden, siehe Abbildung 2; blass ungefärbten Fläche entspricht) 25 Infarkt.
Abbildung 1. Gelbe Pfeile zeigen ungefähre Lage pMCAO im M1-Segment. Dieses Beispiel betrifft Okklusion Okklusion MCA nur distal der lentikulostriatalen Verzweigung, vor aller kortikalen Verzweigung, also das Abschneiden Blutversorgung kortikalen Äste nur. (A) Schematische Darstellung der MCA auf seitlichen kortikalen Oberfläche. (B) Im koronaren Ansicht ungefähre MCA kortikalen und subcortical Zweigstellen. Beachten Sie, dass der MCA Okklusion proximal lentikulostriatalen Verzweigung wird in kortikalen und subkortikalen Infarkt führen, obwohl Zugang zu dieser Region erfordert einen relativ invasives chirurgisches Verfahren. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 2. Einzelne Vertreter Kranzscheibe aus einem Rattenhirn zeigt Infarkt aus pMCAO (mit darauf geachtet werden, Schutzmaßnahmen sensorische Stimulation für 5 Stunden nach einem Verschluss zu minimieren). 2,3,5-Triphenyl-Tetrazolium-chlorid (TTC) Lösung Flecken gesundes Gewebe rötlich und lässt Bereichen Zelltod oder Infarkt (Pfeilrichtung) blass. Beachten Sie, dass aufgrund der Lage der Okklusion (vor allen MCA kortikalen Äste aber distal subkortikalen Verzweigungen) nur kortikalen Infarkt beobachtet wird, und hoch myelinisiert Regionen des Gehirns nehmen nicht die TTC-Lösung und bleibt daher in der Farbe weiß, trotz strukturell intakt.
3. Bild stellt Strömung in einem Abschnitt einer einzelnen kortikalen Zweig MCA vor undfter pMCAO wie abgebildet mit Laser-Speckle-Imaging (LSI). Warmer Farben zeigen stärkere Strömung. Die beschriebene MCA Zweig ist deutlich sichtbar Durchqueren der Grundlinie Bild (links) von der linken unteren zur oberen rechten Ecke und verschwindet nach pMCAO. Hinweis: gelegentlich einige minimal Beweise der Strömung bleibt in einem bestimmten Zweig, aber nach pMCAO Ebenen sollten auf 20% oder weniger der Grundlinie Flow Drop Okklusion Erfolg bestätigen.
. Abbildung 4 Chirurgische Werkzeuge für pMCAO erforderlich (A) Extra Fine Graefe Pinzette -.... 0,5 mm Tipps Slight Curve (B) Ceramic Coated Dumont # 5 Pinzetten (C) Extra Fine Bonn Schere, gerade (D) Round 3/8 (16 mm) Nähnadeln (E). HINWEIS: Nähnadeln sh sein kannortened über Drahtschneider nach Vorliebe des Benutzers. Nach Kürzung mit Drahtschneider sollte Nähnadeln sterilisiert werden. (F) 6-0 geflochtene Seidenfaden. (G) 30-Gauge-Nadel, in der Länge ½.
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Discussion
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Ischämie im Nagetier Kortex induzieren, und zwar mit minimalen Auswirkungen auf die peripheren Versuchspersonen. Die Doppel-Okklusion und Durchtrennung Verfahren ermöglicht die visuelle Bestätigung, dass das Gefäß wurde fest verschlossen und können ohne übermäßiges Eindringen oder Gewebeschäden, und mit einer hohen Überlebensrate durchgeführt werden. Dieses Protokoll kann Okklusion einem kortikalen Behälter, die über Craniotomie zugegriffen werden kann, um Ischämie in einem bestimmten Bereich zu induzieren kortikalen angewendet werden. Weiterhin können solche Verschlüsse durchgeführt werden, während ein Tier in einer stereotaktischen Vorrichtung ermöglicht die gleichzeitige Verwendung von verschiedenen experimentellen Techniken, wie funktioneller Bildgebung oder elektrophysiologische Ableitung werden. Das macht diese Okklusion Technik für ein breites Spektrum von experimentellen Designs, einschließlich intraindividuelle Untersuchung. Zum Beispiel kann bei der Bewertung heraus zu Studienbeginn durchgeführt werden mit Nähten in Ort rund um die Arterieny (aber vor der Sicherung der Nähte und Durchtrennung), während ischämischen Beginn und jederzeit nach der Okklusion Zeitpunkt erforderlich.
Die erfolgreiche Durchführung dieser Okklusion ist abhängig von zwei kritischen Schritte. Zuerst richtige Visualisierung des Zielgefäßes ist für induzierenden Ischämie. Occlusion an einer Stelle proximalen oder distalen an die gewünschte Position (in unserem typischen Fall nur an den primären proximalen anterioren / posterioren kortikalen Bifurkation der MCA) können in einem großen Maß an Infarktvolumen Variabilität führen, so sollte darauf geachtet werden, die bestätigen richtigen Stelle des Verschlusses und Durchtrennung. Zweitens, vorbei an der Nähnadel um die Zielarterie erfordert eine sorgfältige und präzise Technik. Zwangsläufig wird das Nahtmaterial durch die oberflächlichen Schicht der Rinde unmittelbar unterhalb der Arterie passieren. Es sollte darauf geachtet Tauchen zu tief vermeiden innerhalb der kortikalen Oberfläche werden, da dies in Gefäßruptur, Blutungen oder Schädigungen des Gehirns an der o führencclusion Ort. Während viele Arten von Blutgefäßokklusion chirurgische Instrumente zur Verfügung stehen, hat unser Labor den größten Erfolg mit halb Kurve Nähnadeln, verkürzte nach Experimentator bevorzugt hatte. In Verbindung mit ultra-feinen Pinzette, ermöglicht dieses Tool dem Benutzer Faden unterhalb einer Arterie und oberhalb der kortikalen Oberfläche mit nur minimaler Gewebeschädigung passieren.
Nach dem erfolgreichen Abschluss einer Okklusion wird Infarkt zum Kortex allein (Abbildung 2) begrenzt. Im Zusammenhang mit der Verwendung dieser Methode zur Okklusion Modell MCA Schlaganfall, kann dies wichtige Implikation für Forscher, da viele MCA Schlaganfall-Patienten erhalten Infarkt sowohl innerhalb des Kortex und Basalganglien. Allerdings begünstigt unser Labor diesen Okklusion Verfahren zu MCA über Techniken wie intraluminale Naht angesichts der jüngsten Erkenntnisse, dass beeinträchtigte Kauen, Schlucken Funktion und die Beeinträchtigung der motorischen Leistungsfähigkeit auftreten in 47% aller Patienten, die intralumi unterziehen angewendetnal Naht 35; gestörte zerebrale Perfusion und reduziert spontane motorische Aktivität infolge verminderter Futter-und Wasseraufnahme auch zu schlechteren neurologischen Erholung in Ratten nach intraluminale Naht 36-40 beitragen. Trueman et al. 2011 wurde auch abnorme Ernährung, gestörte Trinkverhalten und sensomotorische Behinderung (wie durch den Klebstoff Entfernen Aufgabe quantifiziert) nach diesem Verfahren 11 gemeldet. Entscheidend ist, beobachteten wir die gleichen Verhaltensdefiziten in Schein intraluminale Naht Tiere 11. Als Ergebnis kann intraluminale Naht ernst Störfaktoren zu präklinischen Studie Schlaganfall-von denen viele direkt dem chirurgischen Eingriff und nicht zu zerebralen ischämischen Schlaganfall hinzuzufügen.
Es ist unmöglich, die variable Genese und Pathologie des menschlichen Schlaganfall Model - in der Tat wie ein hoher Grad an Variabilität unerwünscht wäre, in einem experimentellen Modell. Stroke Forschung an Tieren sollten instead auf ein Ergebnis erzeugt mehr analog zu menschlichen Schlaganfall Schäden und Defizite beim Versuch, Modell Ätiologie bestmöglich zu konzentrieren. Wir schlagen vor, dass die minimal-invasive Art, Verschluss der MCA was Ischämie, Infarkt Volumen, das vergleichbar mit menschlichen MCA Ischämie ist, und die Fähigkeit, mehrere Untersuchungs-Techniken neben pMCAO integrieren können machen diese Methode eine attraktive Alternative für einigen präklinischen Schlaganfall Ermittler. Zusätzlich stellt die Okklusionsmethode hier pMCAO modelliert Alternativ minimalinvasive, effektive Mittel zum Verschließen jeder Oberfläche kortikale Gefäß.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu diesem Zeitpunkt offen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der American Heart Association Promotionsstipendium 788808-41910, das NIH-NINDS NS-066001 und NS-055832, und das Zentrum für Hören Forschung NIH Ausbildungsförderung 1T32DC010775-01 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extra Fine Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Slight Curve (1) | Fine Science Tools | 11151-10 | |
| Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Extra Fine Bonn Scissors, straight (1) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Round 3/8 (16 mm) Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| 6-0 Braided Silk Suture | Fine Science Tools | NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461 |
|
| 30 gauge needle, ½" length | Fine Science Tools | NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL |
References
- Caplan, L. R. Caplan's Stroke, A Clinical Approach. , 4th edn, Saunder's & Elsevier. (2009).
- Blumenfeld, H. Neuroanatomy Through Clinical Cases. , Sinauer Associates. (2002).
- Roger, V. L., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2011).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22, 391-397 (1999).
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol. Biochem. Behav. 87, 179-197 (2007).
- Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Busto, R., Watson, B. D. Photochemically induced cortical infarction in the rat. 2. Acute and subacute alterations in local glucose utilization. J. Cereb. Blood Flow Metab. 6, 195-202 (1986).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann. Neurol. 17, 497-504 (1985).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
- Howells, D. W., et al. Different strokes for different folks: the rich diversity of animal models of focal cerebral ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30, 1412-1431 (2010).
- Trueman, R., et al. A Critical Re-Examination of the Intraluminal Filament MCAO Model: Impact of External Carotid Artery Transection. Transl. Stroke Res. 2, (2011).
- Dirnagl, U. Neuromethods. Waiz, W. olfgang , Spring Science & Business Media. New York. (2010).
- Cirstea, M. C., Levin, M. F. Compensatory strategies for reaching in stroke. Brain. 123 (Pt. 5), 940-953 (2000).
- Nakayama, H., Jorgensen, H. S., Raaschou, H. O., Olsen, T. S. The influence of age on stroke outcome. The Copenhagen Stroke Study. Stroke. 25, 808-813 (1994).
- Nudo, R. J., Plautz, E. J., Frost, S. B. Role of adaptive plasticity in recovery of function after damage to motor cortex. Muscle Nerve. 24, 1000-1019 (2001).
- Chiganos, T. C., Jensen, W., Rousche, P. J. Electrophysiological response dynamics during focal cortical infarction. J. Neural Eng. 3, 15-22 (2006).
- Traversa, R., Cicinelli, P., Bassi, A., Rossini, P. M., Bernardi, G. Mapping of motor cortical reorganization after stroke. A brain stimulation study with focal magnetic pulses. Stroke. 28, 110-117 (1997).
- Weber, R., et al. Early prediction of functional recovery after experimental stroke: functional magnetic resonance imaging, electrophysiology, and behavioral testing in rats. J. Neurosci. 28, 1022-1029 (2008).
- Dirnagl, U., Kaplan, B., Jacewicz, M., Pulsinelli, W. Continuous measurement of cerebral cortical blood flow by laser-Doppler flowmetry in a rat stroke model. J. Cereb. Blood Flow Metab. 9, 589-596 (1989).
- Wintermark, M., et al. Comparison of admission perfusion computed tomography and qualitative diffusion- and perfusion-weighted magnetic resonance imaging in acute stroke patients. Stroke. 33, 2025-2031 (2002).
- Crafton, K. R., Mark, A. N., Cramer, S. C. Improved understanding of cortical injury by incorporating measures of functional anatomy. Brain. 126, 1650-1659 (2003).
- Nudo, R. J., Eisner-Janowicz, I. Ch. 12. Reprogramming the Cerebral Cortex. Lomber, S. tephen, Eggermont, J. os , Oxford Scholarship Online. (2006).
- Davis, M. F., Lay, C. C., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Amount but not pattern of protective sensory stimulation alters recovery after permanent middle cerebral artery occlusion. Stroke. 42, 792-798 (2011).
- Lay, C. C., Davis, M. F., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Mild sensory stimulation completely protects the adult rodent cortex from ischemic stroke. PLoS One. 5, e11270 (2010).
- Lay, C. C., Davis, M. F., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Mild sensory stimulation reestablishes cortical function during the acute phase of ischemia. J. Neurosci. 31, 11495-11504 (2011).
- Coyle, P. Middle cerebral artery occlusion in the young rat. Stroke. 13, 855-859 (1982).
- Risedal, A., Zeng, J., Johansson, B. B. Early training may exacerbate brain damage after focal brain ischemia in the rat. J. Cereb. Blood Flow Metab. 19, 997-1003 (1999).
- Lay, C. C., Davis, M. F., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Mild sensory stimulation protects the aged rodent from cortical ischemic stroke following permanent middle cerebral artery occlusion. Journal of the American Heart Association Cardiovascular and Cerebrovascular Disease. , (2012).
- Niiro, M., Simon, R. P., Kadota, K., Asakura, T. Proximal branching patterns of middle cerebral artery (MCA) in rats and their influence on the infarct size produced by MCA occlusion. J. Neurosci Methods. 64, 19-23 (1996).
- Wang-Fischer, Y. Manual of Stroke Models in Rats. , CRC Press. 17-30 (2009).
- Quinn, R. Comparing rat's to human's age: how old is my rat in people years? Nutrition. 21, 775-777 (2005).
- Wei, L., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A.
- Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. J. Cereb. Blood Flow Metab. 8, 474-485 (1988).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
- Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34, 2252-2257 (2003).
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26, 1086-1091 (1995).
- Kuge, Y., Minematsu, K., Yamaguchi, T., Miyake, Y. Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 26, 1655-1657 (1995).
- Laing, R. J., Jakubowski, J., Laing, R. W. Middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Which method works best? Stroke. 24, 294-297 (1993).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke. 29, 2162-2170 (1998).
