Summary
Vi beskriver en meget reproducerbar metode til permanent okklusion af en gnaver større cerebral blodkar. Denne teknik kan udføres med meget lille perifer skade minimal blodtab, en høj grad af langsigtede overlevelse, og konsekvent infarktvolumen svarer til den humane kliniske befolkning.
Abstract
Slagtilfælde er en førende årsag til død, invaliditet og samfundsøkonomisk tab på verdensplan. Hovedparten af alle slagtilfælde skyldes en afbrydelse i blodgennemstrømning (iskæmi) 1.. Midterste cerebral arterie (MCA) giver et stort flertal af blod til den laterale overflade af cortex 2, er den mest almindelige sted for humant slagtilfælde 3, og iskæmi inden for dens område kan resultere i omfattende dysfunktion eller død 1,4,5. Overlevende fra iskæmisk slagtilfælde ofte lider tab eller afbrydelse af motordrevne evner, sensoriske underskud, og infarkt. I et forsøg på at fange disse vigtige egenskaber for slagtilfælde, og derved udvikle en effektiv behandling, er en stor vægt lagt på dyremodeller af iskæmi i MCA.
Her præsenterer vi en metode til permanent okklusion en cortical overflade blodkar. Vi vil præsentere denne metode ved hjælp af et eksempel på en relevant tillukning af blodkar, der modellerer den mest almindelige type, placering og OutCome af menneskets slagtilfælde, permanent midterste cerebral arterieokklusion (pMCAO). I denne model, kirurgisk udsætter vi MCA i den voksne rotte og efterfølgende okkludere via dobbelt ligatur og overskæring af karret. Dette pMCAO blokerer proximale kortikale gren af MCA, forårsager iskæmi i alle MCA kortikale område, en stor del af cortex. Denne metode til okklusion kan også anvendes til at okkludere mere distale dele af corticale fartøjer for at opnå mere fokal iskæmi rettet mod et mindre område af cortex. De primære ulemper ved pMCAO er at den kirurgiske procedure er lidt invasiv som en lille kraniotomi for at få adgang MCA, selvom dette resulterer i minimal vævsskade. De primære fordele ved denne model er imidlertid: stedet for okklusion er veldefineret, graden af reduktion af blodgennemstrømningen er konsistent, funktionel og neurologisk svækkelse sker hurtigt, infarktstørrelse er konsistent, og den høje overlevelse muliggør lang Udtrykket kronisk vurdering.
Introduction
For at fremkalde iskæmiske tilstande som effektivt efterligner human iskæmisk slagtilfælde, er flere dyr takts modeller almindeligt anvendt, med varierende mængder af infarkt resulterende. I photothrombotic modellen hjernen bestråles gennem den intakte kraniet ved laserbelysning efter intravenøs injektion af et lysfølsomt stof (såsom rose-bengal), hvilket resulterer i fotokemisk koagulation, blokering af de bestrålede fartøjer og iskæmi i det omgivende væv 6, 7.. Photothrombosis kan resultere i meget små, isolerede områder af infarkt og anvendes typisk som et middel til modellering "mini-slagtilfælde", eller "mikro-slagtilfælde".
Jo mere udbredt teknik til at inducere iskæmisk slagtilfælde, især i midterste cerebrale arterie (MCA), er det intraluminale monofilament model 8, hvor et filament er kirurgisk indført i den ydre carotidarterie og fremføres indtil spidsen aflukker bunden af MCA. A primary udfordring intraluminale glødetråd okklusion er den høje dødelighed (70%, når MCA okkluderes i 3 timer, et relevant tidspunkt for slagtilfælde forskning) 9.. Andre problemer med den metode, omfattede mulige subaraknoidalblødning, ufuldstændige okklusion, og variable infarktvolumen 10,11. Denne model resulterer i en udstrakt grad af infarkt i både cortex og subcortically 12 og modeller en massiv menneskelig slagtilfælde.
Selv om både mikro-og massive takts modeller er vigtige, menneskelige slagtilfælde er typisk et sted i mellem. I store kliniske studier, slagtilfælde infarkt spænder i størrelse fra 28 til 80 cm 3, hvilket svarer til 4,5 til 14% af den ipsi-ishemic halvkugle 9.. Til sammenligning. Vores rotte pMCAO infarktstørrelse spænder fra ca 9-35 mm 3, der udgør 3 til 12% af den ipsi-ishemic halvkugle Vores pMCAO model derfor ligner menneskelige iskæmisk slagtilfælde infarktvolumener i procent af hjernensvolumen.
Ud over at modellere strukturelle skader af slagtilfælde, pMCAO resultater i funktionelle og adfærdsmæssige underskud svarende til den menneskelige tilstand. Som minimum en effektiv model for slagtilfælde resultater i bevægelse underskud kontralaterale til slagtilfælde skader 13-15, tab eller forstyrrelser af motorisk og sensorisk funktion 16,17, tab eller afbrydelse af fremkaldte neuronal aktivitet 16,18, reduktioner i cerebral blodgennemstrømning 19 20, og infarkt 21,22. Derfor vores pMCAO modeller en alvorlig okklusion af MCA resulterer i fysisk handicap, tab af funktion i den sensoriske cortex (og tilstødende cortex), forstyrrelse af neuronal aktivitet, en alvorlig reduktion i MCA blodgennemstrømning, og infarkt-kendetegnende attributter iskæmisk slagtilfælde 23 -25, derfor tjener som en effektiv model for menneskelig slagtilfælde.
Proceduremæssigt, pMCAO indebærer en lille kraniotomi, hvor vi forsigtigt fjerne kraniet og dura fraen 2 x 2 mm "kirurgisk vindue" over det første (M1) segment af MCA, lige før den primære tvedeling af MCA ind i de forreste og bageste kortikale grene (figur 1A og 1B). Vi passerer en halv kurve reverse skære sutur nål og tråd (6-0 silke) gennem pial lag i hjernehinden, under MCA og over kortikale overflade (se tabel af specifikke reagenser og udstyr til de kirurgiske forsyninger, der er nødvendige for at udføre pMCAO ). Vi derefter binde en dobbelt ligatur, spænd de to knob omkring MCA, og transektere skibet mellem de to knob. Den dobbelte ligatur og overskæring gennem M1 sker lige distalt for lenticulostriate forgrening, således at kun de cortikale grene af MCA er påvirket-således kun kortikale infarkt (ingen subkortikale skade) forekommer 26,27 (fig. 2). Selvom menneskelig slagtilfælde involverer ofte subkortikale infarkt, modellering dette i gnavere kræver øget invasivitet (okklusion cerebrale fartøjer inden kortikale Branching kræver adgang arterier via halspulsåren i nakken og nødvendiggør yderligere tillukning) i teknik og øget variabilitet i infarktstørrelse. Modellen er beskrevet her kan ikke udføres mere proksimalt som adgang til tidligere grene af MCA ikke er mulig via en simpel kraniotomi. Mens det kan være kirurgisk muligt at fremkalde en subkortikale infarkt via pMCAO ville okklusion medføre en særdeles invasiv procedure og er derfor ikke ideel.
Effektiviteten af okklusion kan bekræftes via laser Doppler, eller laser speckle billedbehandling 12,24,25 (fig. 3), eller histologisk post mortem (figur 2). Det skal bemærkes, at tidligere forskning har vist, at sensorisk stimulation kan spille en vigtig rolle i udviklingen og resultatet af infarkt, giver beskyttelse mod skader, når det administreres inden 2 timer i pMCAO og forårsager en stigning i slagtilfælde skader, når det administreres ved 3 timer efter pMCAO 24,25,28. Vi har bekræftet, at ved 5 timer efter pMCAO, stimulation ikke længere har en effekt på resultat (upublicerede data). Derfor bør sensorisk stimulation af emner minimeres i 5 timer efter pMCAO at opnå infarktvolumener med minimal variation. Tilsvarende har vores gruppe kører "ubehandlede kontroller" af denne type ved at holde rotter bedøvet i 5 timer efter pMCAO, i mørke, med minimal sensorisk stimulation, og udtrykkeligt ingen whisker stimulation.
Det skal endvidere bemærkes, at lejlighedsvis variation i MCA struktur, herunder overdreven forgrening, flere primære segmenter, eller fravær af kommunikerende arterier kan forekomme ved en frekvens på 10 til 30% i mandlige voksne Sprague Dawley rotter 29,30. Hvis abnormiteter i MCA overholdes, er det tilrådeligt ikke at bruge det pågældende emne som at tilføje dyr med sådanne vaskulære abnormiteter vil øge infarkt variabilitet.
Derudover er der flere praktiske aspekter af our procedure, der gør dette okklusion metode fordelagtigt for slagtilfælde undersøgelse. Først kan suturer placeres rundt om arterien, men ikke strammet for at indsamle en baseline vurdering, efterfulgt af post-iskæmisk vurdering efter ligatur og transection. På denne måde, er kirurgisk forberedelse nødvendig for okklusionen kontrolleres effektivt til, inden emner. Fordi fag kan forblive stationære eller inden for en stereotaktisk ramme hele okklusion, er det muligt at foretage eksperimentel vurdering af hvert emne før, under og efter okklusion uden at flytte motivet eller forstyrre nogen eksperimentelle udstyr i brug 25,28. Desuden er denne procedure resulterer i en meget lav dødelighed, selv inden alderen gnaver fag 21-24 måneder (svarende til en ældre menneske) 31, og kan derfor anvendes til at vurdere slagtilfælde behandlinger i rotter, nærmere modellere mest almindelige aldersgruppe af slagtilfælde syge 25,28. Vessel transection også tjener flere praktiske formål. Fraværet af blødning efter transection bekræfter, at skibet var helt tilstoppet ved begge ligaturer sites. Derudover overskæring sikrer en permanent afbrydelse af blodgennemstrømningen. Endelig overskæring sikrer, at enhver blodgennemstrømningen påvist i de distale dele af den okkluderede fartøj skal komme fra en alternativ kilde.
Endelig, selv om vi specifikt beskrive denne okklusion teknik til MCA i dette manuskript og video, kan den samme dobbelte ligatur transection teknik anvendes på enhver cerebral fartøj, der kan tilgås via craniotomy. Vores laboratorium, for eksempel, udnyttes pMCAO i samarbejde med flere andre permanente tillukning af distale MCA afdelinger for at blokere både primær og sikkerhedsstillelse blodgennemstrømningen 24 på en måde, der svarer til metoder, der skal selektivt fremkalde iskæmi inden for den primære somatosensoriske cortex 32..
Sammenfattende thans metode til permanent okklusion, som anvendes til MCA tæt modeller tre primære facetter af menneskelig iskæmisk slagtilfælde: den mest almindelige placering (MCA), type (iskæmi), og graden af skader (infarkt) i forbindelse med den humane kliniske litteratur for slagtilfælde. Desuden kan denne metode til okklusion anvendes på en enkelt eller flere okklusion steder i hele hjernen, og kan udføres i alderen individer med en høj overlevelsesprocent. I betragtning af den dynamiske, permanent og relativt invasiv karakter af denne okklusion, udgør denne teknik et supplerende værktøj for prækliniske forskere evaluere nye metoder til beskyttelse mod og behandling af slagtilfælde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Kom godt i gang: Nødvendige kirurgiske instrumenter
Se figur 4.
- Tandlægebor (Kavo Dental Equipment, Model: UMXL-TM), 2-bit bore, og 3-bit bore
- To ~ 30 gauge kanyler
- Savtakket pincet, buet spids valgfri (kan være nyttigt, men ikke afgørende)
- To fine spids pincet
- bidetang
- Suturtråd
- Micro saks
2.. Oprettelse af Kirurgisk Window
- Anæstesi: Procedurer er i overensstemmelse med NIH retningslinjer, og er blevet godkendt af UC Irvine Animal Care og brug Udvalg. Eksperimentelle emner er 295-400 g Sprague Dawley rotter (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) og følgende anæstesi bør anvendes:
- Injicere rotte intraperitonealt med en natriumpentobarbital bolus (55 mg / kg legemsvægt) efterfulgt af en intramuskulær injektion af atropin (0,05 mg / kg, legemsvægt) i hIND ben, og administreret 3,0 cc 5% dextrose i vand subkutant.
- Supplement natriumpentobarbital (27,5 mg / kg, legemsvægt) injektioner efter behov. Administrere en ophthalmisk antibiotisk salve til øjnene for at beskytte hornhinder i de følgende procedurer. Anvend 5% dextrose (3 ml) og atropin (0,05 mg / kg, legemsvægt) hver sjette time falde respiratoriske sekreter under anæstesi. Foranstaltning kropstemperatur via en rektal sonde, og opretholde kroppens temperatur ved 37 ° C ved en selvregulerende termisk tæppe.
- Find MCA ved enten:
- Udtynding en 2 x 2 mm billedbehandling / visualisering vindue over somatosensoriske cortex ved hjælp af en størrelse HP 3 boret indtil kraniet er næsten gennemsigtig, og derefter udtynding til fuld gennemsigtighed ved hjælp af en størrelse HK 2 boret. MCA placering kan derefter ses gennem dette vindue, og dens proximale bane anvendes til at tilnærme placeringen af den oprindelige segment. MCA vil generelt køre diagonalt på tværs af dettevindue i en rostral til caudal / ventral til dorsal retning (for eksempel venstre til højre / bund til top, når du ser venstre hjernehalvdel fra kirurgens synspunkt). Den kirurgiske vindue kan laves så ovenfor, hvor iagttageren anslår M1 segment (proksimalt til cortical forgrening) skal placeres på grundlag af de distale grene synlige gennem det første vindue. For at minimere mængden af kraniet, der fjernes for at få adgang til MCA, bør imaging / visualisere vindue blive placeret tæt på, men adskilt fra den kirurgiske vinduet.
Eller - Et lille kirurgisk vindue skal placeres omtrent 3 mm forreste og 1 mm lateralt for foramen ovale eller mandibular nerve, tæt til buen talerstolen 30,33,34. For effektivt adgang stilken af MCA (også kendt som M1 segment) er temporalis musklen midlertidigt reflekteres væk fra kraniet overflade. (Bemærk: I tilfælde af langsigtede overlevelse operationer, har vores lab erfaring været that ved at tillade temporalis musklen til at forblive fæstnet ved sin anker, vil musklen re-anneale til kraniet overflade, der giver mulighed for sund spiseadfærd og effektiv vedligeholdelse af legemsvægt.
- Udtynding en 2 x 2 mm billedbehandling / visualisering vindue over somatosensoriske cortex ved hjælp af en størrelse HP 3 boret indtil kraniet er næsten gennemsigtig, og derefter udtynding til fuld gennemsigtighed ved hjælp af en størrelse HK 2 boret. MCA placering kan derefter ses gennem dette vindue, og dens proximale bane anvendes til at tilnærme placeringen af den oprindelige segment. MCA vil generelt køre diagonalt på tværs af dettevindue i en rostral til caudal / ventral til dorsal retning (for eksempel venstre til højre / bund til top, når du ser venstre hjernehalvdel fra kirurgens synspunkt). Den kirurgiske vindue kan laves så ovenfor, hvor iagttageren anslår M1 segment (proksimalt til cortical forgrening) skal placeres på grundlag af de distale grene synlige gennem det første vindue. For at minimere mængden af kraniet, der fjernes for at få adgang til MCA, bør imaging / visualisere vindue blive placeret tæt på, men adskilt fra den kirurgiske vinduet.
- Følg MCA til rostralt, ventrale hjørne af scanningsvindue (hvis bruger dette som reference) for at estimere, hvor den oprindelige kortikale filial ligger.
- Opret en ny tynd skalleparti (vi henviser til dette som den kirurgiske vindue) lidt rostral og ventral til scanningsvindue (hvis du bruger dette som en reference), hvor M1 segment (pre-cortical forgrening) i MCA skal være. VIGTIGT: Lad ca en 2 mm mellem scanningsvindue (hvis du bruger dette som en reference), og det kirurgiske vinduet.
- Find stilken af MCA (også kendt som M1 segment) lige før kortikale forgrening af arterien som vist i figur 1A og 1B.
- Ved hjælp af en størrelse HP-3 boret, tynde kraniet over den beregnede M1 segment placering. Nårkraniet bliver noget gennemsigtigt, skifte til mere delikat størrelse HP-2 boret og tynde kraniet, indtil det er helt gennemsigtig. Bekræft visuelt som kirurgisk vindue område bliver tynd nok til at se vaskulatur, og vurdere placeringen af M1 i dette punkt og færdiggøre vinduet, således at der er 2-3 mm på hver side af længden af M1 segment (dette giver plads til indsætning og afgangen af Suturnåle på hver side af MCA).
VIGTIGT: Stop udtynding når tykkelsen af kraniet svarer til plastfolie. Fartøjet vil briste, hvis boret bryder igennem kraniet og dura. Hvis kraniet ikke er tyndt nok på den anden side vil fjerne det for okklusion være vanskeligt og kan resultere i beskadigelse af cortex eller arterie.
- Tag en 30 gauge (30 G) kanyle og bøj spidsen af nålen, med savtakket pincet.
- Bruge 30 G nål til at punktere kraniet plejefuldt ud i et område, der ikke direkte over en arterie. Brug denne punktering hul at tillade en pincet til at gribe kranie og fjern forsigtigt tyndet område af kirurgiske vinduet.
- Tag en ny 30 G behov, bøje spidsen som i trin 6, og fjern forsigtigt dura.
BEMÆRK: Skæring dura vil få det til skrælle og MCA bliver mere fremtrædende, som et resultat af reduceret tryk.
3.. Okkludere MCA
- Brug bidetang til at trimme en halv kurve omvendt skære Suturnåle (runde 3/8, 16 mm Suturnåle) ned til omkring 3-5 mm.
- Før det trimmede sutur nålen som vist på billedet i figur 4E. VIGTIGT: Det er vigtigt, at nålen trådes så begge ender af suturtråd er af tilsvarende længde. Dette muliggør træk af både trådenderne under M1 på samme tid, kan nålen derefter skåret fri forlader to længder af tråd til at binde de to knuder ved MCA.
- Brug den savtakkede pincetten glide Suturnåle under M1. Indsæt med omkring 0,5-1 mm afstand fra MCA, holde sig så overfladisk som muligt, for at minimere skader på cortex, men undgå for meget pres på MCA så godt.
- Når Suturnåle kommer ud på den anden side sådan, at det er under MCA bruge en fin spids pincet (som vist nedenfor) for at trække spidsen af suturen kanylen fra den modsatte side, samtidig med at fodre eller skubbe den anden ende af suturen nål med den savtakkede spids pincet.
- Når suturen kanylen fuldstændigt føres under MCA og er blevet trukket ud, fortsat at trække på suturen nål eller tråd indtil længden af tråden er ens på begge sider af MCA. Trykke ned på tråden som det føres igennem for at minimere belastningen på MCA kan være nyttigt til at forhindre brud som tråden passerer under arterien.
- Klip tråden tæt på suturnål.
- Brug begge fin spids pincet til at udrede de to resulterende suturtråds, så der er to uafhængige tråde trukket under MCA, der ikke rører hinanden. Ideelt trådene vil være omkring 1 mm fra hinanden, når de passerer under MCA.
- Brug begge fin spids pincet til at binde to separate knob (to ligaturer) med gevindet omkring MCA forsøger at fastholde, at ~ 1 mm plads mellem knuderne for at give plads til transection.
BEMÆRK: Hvis en intern fingeret kontrol ønskes, forberede okklusion forlader okklusionssymbolet knob løs, så at de ikke snøre MCA overhovedet og indsamle data før stramning knuderne og opskæring fartøjet. Trim tråden for at forhindre det fange på noget før okklusion, men efterlade nok tråd til at tillade stramning af knuder senere. På denne måde kan enhver baseline billeddannelse eller dataindsamling udføres med alle de samme kirurgiske invasion som okklusionen og knuderne strammes på et passende tidspunkt med lille forsinkelse.
- Når knob har væreda strammes, skal du bruge mikro saks til transektere M1 mellem de to knob.
- I tilfælde af langvarige, overlevelse undersøgelser:
- Sutur indridset hovedbund flap på plads igen med sterilt kirurgisk tråd eller sikre vævet med sterile sårklemmer.
- Administrere antibiotika lokalt til sårområdet (såsom bacitracin salve) og systemisk ved profylaktisk injektion af ampicillin (150 mg / kg IM).
- Mens emnet er stadig bedøvet administrere et ophthalmisk antibiotisk salve for øjnene.
- Indgiv supplerende atropin (0,05 mg / kg IM) for at mindske luftvejssekret under anæstesi.
- Inject Flunixinmeglumin (1,1 mg / kg) subkutant ved afslutningen af operationen og igen den følgende morgen (~ 12 timer senere) for smerter kontrol.
- Placer dyret på en tør, varm, skrå overflade, således at dyrene næse er over halen på den skrå (det letter vejrtrækning, indtil dyret er vågen). </ Li>
- Overvåg dyret indtil det er vågen og bevæger sig sikkert på egen hånd.
- Når dyret er tilbage i terrariet, dyrets aktivitet bør udseende, vokalisering, og fodring og drikke adfærd overvåges dagligt.
4.. Eutanasi
- Ved afslutningen af hvert forsøg, bør rotter aflives med natrium pentobarbital (2-3 ml, intraperitonealt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket okklusion af et fartøj kan bekræftes ved hjælp af laser speckle imaging (LSI) blandt andet blodstrømningshastigheder billeddannende teknikker. Blodgennemstrømningen i de store kortikale grene af MCA skulle falde til ~ 25% af baseline eller mindre efter okklusion afhængigt af støjniveauet i registreringssystemet og følsomhed af teknikken. Se figur 3 for en repræsentativ LSI billede af et segment af en cortical gren af MCA før og efter MCA tilstopning. Når den beskrevne okklusion teknik anvendes til MCA på M1-segmentet, blokerer alle kortikale MCA grene, og sensorisk stimulation forhindret i ~ 5 timer efter okklusion, er resultatet en kortikal infarkt på 28,4 ± 2,4 mm 3 (for et repræsentativt koronale udsnit af en 2,3,5-Triphenyl-tetrazoliumchlorid [TTC] farves hjerne med den beskrevne skade se figur 2, bleg uplettet område svarer til infarktet) 25.
Figur 1.. Gule pile angiver omtrentlige placering af pMCAO på M1 segment. Denne okklusion eksempel indebærer okkludering MCA lige distalt for lenticulostriate forgrening, før alle kortikale forgrening dermed afskære blodforsyningen til kortikale grene alene. (A) Diagram over MCA om lateral kortikale overflade. (B) Koronale udsigt omtrentlige MCA cortical og subkortikale filial steder. Bemærk, at okklusion af MCA nærmest lenticulostriate forgrening vil resultere i kortikal og subkortikale infarkt, selvom adgangen til denne region kræver en relativt invasiv kirurgisk procedure. Klik her for at se større figur .
Figur 2. Enkelt repræsentant koronale skive fra en rottehjerne viser infarkt som følge af pMCAO (med omhu for at minimere beskyttende sensorisk stimulation i 5 timer efter okklusion). 2,3,5-triphenyl-tetrazoliumchlorid (TTC) opløsning pletter sundt væv rødlig og efterlader områder for celledød eller infarkt (angivet ved pilen) bleg. Bemærk, at på grund af placeringen af okklusion (før alle MCA kortikale grene, men distalt for subkortikale filialer) kun kortikal infarkt overholdes, og meget myelinerede regioner af hjernen ikke tager TTC opløsning og vil derfor forblive hvide i farve, trods være strukturelt intakt.
Figur 3.. Billede afbilder flow i en del af en enkelt kortikal gren af MCA før og enfter pMCAO som filmede med laser speckle imaging (LSI). Varmere farver indikerer stærkere flow. Den beskrevne MCA filialen er klart synlig gennemkører baseline billede (til venstre) fra nederste venstre til øverste højre hjørne og forsvinder efter pMCAO. Bemærk: nogle gange nogle minimale tegn på flow forbliver i en given branche, men efter pMCAO niveauer bør falde til 20% eller mindre af baseline flow for at bekræfte okklusion succes.
. Figur 4. Kirurgiske Nødvendigt værktøj for pMCAO (A) Ekstra fin Graefe pincet -.... 0,5 mm Tips Slight Curve (B) Keramiske Coated Dumont # 5 pincet (C) Ekstra Fin Bonn Saks, lige (D) Round 3/8 (16 mm) suturnåle (E) BEMÆRK:. suturnåle kan være shortened via bidetang henhold til brugerens præferencer. Efter afkortning med bidetang, bør suturnåle blive steriliseret. (F) 6-0 Flettet silkesutur. (G) 30 gauge nål, ½ i længden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol blev udviklet med henblik på at fremkalde iskæmi i gnaver cortex, og at gøre det med minimal perifer betydning for eksperimentelle fag. Den dobbelte okklusion og transection metode giver mulighed for visuel bekræftelse af, at fartøjet er blevet permanent tillukket og kan udføres uden overdreven invasion eller vævsskade, og med en høj overlevelsesrate. Denne okklusion protokol kan anvendes på enhver kortikale fartøj, der kan tilgås via kraniotomi for at fremkalde iskæmi inden for et specifikt cortical domæne. Desuden kan disse okklusioner udføres, mens et dyr er i en stereotaktisk apparat tillade samtidig brug af forskellige testpræparater teknikker, såsom funktionel billeddannelse eller elektrofysiologiske optagelse. Dette gør denne okklusion teknik gælder for en bred vifte af eksperimentelle designs, bl.a. inden for individet undersøgelse. For eksempel kan vurderingen foretages ved baseline med suturer på plads omkring speciesy (men før sikring af suturer og transecting) under iskæmisk debut, og på ethvert post-okklusion tidspunkt kræves.
Vellykket gennemførelse af denne okklusion er betinget to kritiske trin. Først, korrekt visualisering af målet fartøjet er afgørende for at inducere iskæmi. Okklusion på et sted proximalt til eller distalt til den ønskede placering (i vores typiske tilfælde, umiddelbart proksimalt for den primære anteriore / posteriore kortikale tvedeling af MCA) kan resultere i en høj grad af infarktvolumen variabilitet, så bør udvises forsigtighed for at bekræfte ordentlig site af okklusion og overskæring. For det andet, passerer Suturnåle omkring målet arterie kræver omhyggelig og præcis teknik. Af nødvendighed vil suturen passerer gennem det mest overfladiske lag af cortex umiddelbart under arterien. Der bør udvises omhu for at undgå dykning også dybt inde i kortikale overflade, da dette kan resultere i fartøjets brud, blødning eller skader på hjernen på occlusion site. Mens mange typer af blodkar okklusion kirurgiske værktøjer er tilgængelige, har vores lab haft mest succes med halv kurve suturnåle, trunkerede efter eksperimentator præference. Anvendes i forbindelse med ultra-fine tænger, dette værktøj tillader brugeren at passere suturtråd under en arterie og over den kortikale overflade med kun minimal vævsskade.
Efter en vellykket afslutning af en okklusion er infarkt begrænset til cortex alene (figur 2). I forbindelse med at bruge denne okklusion metode til at model MCA slagtilfælde, kan det have afgørende implikation for forskere, som får at mange MCA apopleksipatienter opretholde infarkt inden for såvel cortex og basalganglierne. Men vores laboratorium favoriserer denne okklusion metode, som anvendes til MCA løbet teknikker såsom intraluminal sutur betragtning af de seneste resultater, at nedsat tygning, synke-funktion og nedsat motorisk præstation forekommer i 47% af alle fag, der gennemgår intraluminal sutur 35, nedsat cerebral perfusion og reducerede spontan motorisk aktivitet som følge af reduceret mad og vandoptagelse også bidrage til dårligere neurologiske opsving i rotter efter intraluminal sutur 36-40. Trueman et al. 2011 har også rapporteret unormal spise, nedsat drikke adfærd og sensomotoriske handicap (som opgjort af klæbestof udsendelse opgave) efter denne procedure 11.. Kritisk, observerede vi de samme adfærdsmæssige underskud i fingeret intraluminale sutur dyr 11.. Som et resultat, kan intraluminal sutur tilføje alvorlige forstyrrende faktorer til præklinisk slagtilfælde studierelevante hvoraf mange er direkte kan henføres til den kirurgiske procedure og ikke cerebral iskæmisk slagtilfælde.
Det er umuligt at modellere variable ætiologi og patologi human iskæmisk slagtilfælde - faktisk sådan en høj grad af variabilitet ville være uønsket i en eksperimentel model. Stroke forskning med dyr, bør instead fokusere på at producere et resultat mere analog til human slagtilfælde skader og underskud, mens du forsøger at modellere ætiologi bedst muligt. Vi foreslår, at den minimalt invasive karakter, okklusion af MCA resulterer i iskæmi, infarkt volumen, som er sammenlignelig med humant MCA iskæmi og evne til at inkorporere flere testpræparater teknikker sammen pMCAO kan gøre denne metode et attraktivt alternativ for nogle prækliniske slagtilfælde undersøgere. Derudover okklusion metode modelleres her ved pMCAO giver et alternativ, minimalt invasiv, effektive midler til okkluderer enhver overflade kortikal fartøj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre på dette tidspunkt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af American Heart Association Predoctoral Fellowship 788.808-41.910, NIH-NINDS NS-066001 og NS-055.832, og Center for Hearing Research NIH Training Grant 1T32DC010775-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extra Fine Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Slight Curve (1) | Fine Science Tools | 11151-10 | |
| Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Extra Fine Bonn Scissors, straight (1) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Round 3/8 (16 mm) Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| 6-0 Braided Silk Suture | Fine Science Tools | NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461 |
|
| 30 gauge needle, ½" length | Fine Science Tools | NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL |
References
- Caplan, L. R. Caplan's Stroke, A Clinical Approach. , 4th edn, Saunder's & Elsevier. (2009).
- Blumenfeld, H. Neuroanatomy Through Clinical Cases. , Sinauer Associates. (2002).
- Roger, V. L., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2011).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22, 391-397 (1999).
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol. Biochem. Behav. 87, 179-197 (2007).
- Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Busto, R., Watson, B. D. Photochemically induced cortical infarction in the rat. 2. Acute and subacute alterations in local glucose utilization. J. Cereb. Blood Flow Metab. 6, 195-202 (1986).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann. Neurol. 17, 497-504 (1985).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
- Howells, D. W., et al. Different strokes for different folks: the rich diversity of animal models of focal cerebral ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30, 1412-1431 (2010).
- Trueman, R., et al. A Critical Re-Examination of the Intraluminal Filament MCAO Model: Impact of External Carotid Artery Transection. Transl. Stroke Res. 2, (2011).
- Dirnagl, U. Neuromethods. Waiz, W. olfgang , Spring Science & Business Media. New York. (2010).
- Cirstea, M. C., Levin, M. F. Compensatory strategies for reaching in stroke. Brain. 123 (Pt. 5), 940-953 (2000).
- Nakayama, H., Jorgensen, H. S., Raaschou, H. O., Olsen, T. S. The influence of age on stroke outcome. The Copenhagen Stroke Study. Stroke. 25, 808-813 (1994).
- Nudo, R. J., Plautz, E. J., Frost, S. B. Role of adaptive plasticity in recovery of function after damage to motor cortex. Muscle Nerve. 24, 1000-1019 (2001).
- Chiganos, T. C., Jensen, W., Rousche, P. J. Electrophysiological response dynamics during focal cortical infarction. J. Neural Eng. 3, 15-22 (2006).
- Traversa, R., Cicinelli, P., Bassi, A., Rossini, P. M., Bernardi, G. Mapping of motor cortical reorganization after stroke. A brain stimulation study with focal magnetic pulses. Stroke. 28, 110-117 (1997).
- Weber, R., et al. Early prediction of functional recovery after experimental stroke: functional magnetic resonance imaging, electrophysiology, and behavioral testing in rats. J. Neurosci. 28, 1022-1029 (2008).
- Dirnagl, U., Kaplan, B., Jacewicz, M., Pulsinelli, W. Continuous measurement of cerebral cortical blood flow by laser-Doppler flowmetry in a rat stroke model. J. Cereb. Blood Flow Metab. 9, 589-596 (1989).
- Wintermark, M., et al. Comparison of admission perfusion computed tomography and qualitative diffusion- and perfusion-weighted magnetic resonance imaging in acute stroke patients. Stroke. 33, 2025-2031 (2002).
- Crafton, K. R., Mark, A. N., Cramer, S. C. Improved understanding of cortical injury by incorporating measures of functional anatomy. Brain. 126, 1650-1659 (2003).
- Nudo, R. J., Eisner-Janowicz, I. Ch. 12. Reprogramming the Cerebral Cortex. Lomber, S. tephen, Eggermont, J. os , Oxford Scholarship Online. (2006).
- Davis, M. F., Lay, C. C., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Amount but not pattern of protective sensory stimulation alters recovery after permanent middle cerebral artery occlusion. Stroke. 42, 792-798 (2011).
- Lay, C. C., Davis, M. F., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Mild sensory stimulation completely protects the adult rodent cortex from ischemic stroke. PLoS One. 5, e11270 (2010).
- Lay, C. C., Davis, M. F., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Mild sensory stimulation reestablishes cortical function during the acute phase of ischemia. J. Neurosci. 31, 11495-11504 (2011).
- Coyle, P. Middle cerebral artery occlusion in the young rat. Stroke. 13, 855-859 (1982).
- Risedal, A., Zeng, J., Johansson, B. B. Early training may exacerbate brain damage after focal brain ischemia in the rat. J. Cereb. Blood Flow Metab. 19, 997-1003 (1999).
- Lay, C. C., Davis, M. F., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Mild sensory stimulation protects the aged rodent from cortical ischemic stroke following permanent middle cerebral artery occlusion. Journal of the American Heart Association Cardiovascular and Cerebrovascular Disease. , (2012).
- Niiro, M., Simon, R. P., Kadota, K., Asakura, T. Proximal branching patterns of middle cerebral artery (MCA) in rats and their influence on the infarct size produced by MCA occlusion. J. Neurosci Methods. 64, 19-23 (1996).
- Wang-Fischer, Y. Manual of Stroke Models in Rats. , CRC Press. 17-30 (2009).
- Quinn, R. Comparing rat's to human's age: how old is my rat in people years? Nutrition. 21, 775-777 (2005).
- Wei, L., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A.
- Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. J. Cereb. Blood Flow Metab. 8, 474-485 (1988).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
- Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34, 2252-2257 (2003).
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26, 1086-1091 (1995).
- Kuge, Y., Minematsu, K., Yamaguchi, T., Miyake, Y. Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 26, 1655-1657 (1995).
- Laing, R. J., Jakubowski, J., Laing, R. W. Middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Which method works best? Stroke. 24, 294-297 (1993).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke. 29, 2162-2170 (1998).
