Summary
Nós descrevemos um método altamente reprodutível para a oclusão permanente de um roedor grande vaso sanguíneo cerebral. Esta técnica pode ser realizado com muito pouco dano periférica, a perda de sangue mínima, uma elevada taxa de sobrevivência a longo prazo, e o volume de enfarte consistente comensurável com a população de clínica humana.
Abstract
O AVC é a principal causa de morte, invalidez e perda socioeconômicas em todo o mundo. A maioria de todos os acidentes vasculares cerebrais resultam de uma interrupção do fluxo sanguíneo (isquemia) 1. Artéria cerebral média (MCA) fornece uma grande maioria de sangue para a superfície lateral do córtex 2, é o local mais comum de acidente vascular cerebral humano 3, e isquemia no seu território pode resultar em disfunção extensa ou morte 1,4,5. Sobreviventes de acidente vascular cerebral isquêmico, muitas vezes sofrem perda ou rompimento das capacidades motoras, deficiências sensoriais e infarto. Em um esforço para capturar estas características fundamentais de acidente vascular cerebral e, assim, desenvolver um tratamento eficaz, uma grande ênfase é colocada em modelos animais de isquemia em MCA.
Aqui apresentamos um método de oclusão permanentemente uma cortical dos vasos sanguíneos da superfície. Vamos apresentar este método usando um exemplo de uma oclusão do vaso relevante que modela o tipo mais comum, localização e outcome de acidente vascular cerebral humano, oclusão da artéria cerebral média permanente (pMCAO). Neste modelo, expomos cirurgicamente MCA no rato adulto e, subsequentemente, através de ocluir ligadura dupla e transecção da embarcação. Isto bloqueia o ramo pMCAO cortical proximal do MCA, causando isquemia em todos MCA território cortical, uma grande porção do córtex. Este método de oclusão pode também ser utilizado para ocluir porções mais distais dos vasos corticais, a fim de alcançar mais de isquemia focal como alvo uma região menor do córtex. As principais desvantagens da pMCAO são que o procedimento cirúrgico é pouco invasivo como uma pequena craniotomia é necessário para aceder MCM, no entanto, isso resulta em dano mínimo do tecido. As principais vantagens deste modelo, no entanto, são os seguintes: o local de oclusão está bem definida, o grau de redução do fluxo sanguíneo é consistente, funcional e disfunção neurológica ocorre rapidamente, o tamanho do enfarte é consistente, e a elevada taxa de sobrevivência a longo permite avaliação crônica prazo.
Introduction
A fim de induzir eficazmente condições isquémicas que imitam AVC isquémico humano, existem vários modelos animais tempos são amplamente empregados, com diversos volumes de enfarte resultantes. No modelo photothrombotic, o cérebro é irradiada através do crânio intactos utilizando iluminação do laser após a injecção intravenosa de uma substância fotossensível (como cor-de-bengala), resultando em coagulação fotoquímica, obstrução dos vasos irradiados, e isquemia no tecido circundante 6, 7. Indocianina pode resultar em regiões muito pequenas, isolados de enfarte e é tipicamente utilizado como um meio de modelação "mini-derrames", ou "micro-enfartes".
A técnica mais frequentemente adoptada para a indução de acidente vascular cerebral isquémico, particularmente na artéria cerebral média (MCA), é o modelo de monofilamentos intraluminal 8, na qual um filamento é introduzido cirurgicamente para dentro da artéria carótida externa e avançou até a ponta oclui a base da MCA. A primary desafio de oclusão filamento intraluminal é a alta taxa de mortalidade (70% quando a MCA está obstruído por 3 horas, um ponto de tempo relevantes para a investigação AVC) 9. Outros problemas com o método incluído possível hemorragia subaracnóide, oclusão incompleta, e volume de infarto variável 10,11. Este modelo resulta num grande grau de enfarte, tanto no córtex e subcorticalmente 12 e os modelos de um acidente vascular cerebral humano. Maciça
Embora ambos micro e acidente vascular cerebral maciço modelos são importantes, traços humanos são normalmente algures no meio. Em grandes estudos clínicos, acidente vascular cerebral infarto varia em tamanho 28-80 cm 3, o que se traduz em 4,5-14% do hemisfério ipsi-ishemic 9. Em comparação, os ratos pMCAO enfarte tamanho varia de cerca de 9-35 mm 3, a qual é constituída por 3 a 12% do hemisfério ipsi ishemic. Nosso modelo pMCAO, portanto, se assemelha volumes infarto AVC isquêmico humanos pela porcentagem de cérebrovolume.
Além de modelar o dano estrutural do curso, resultados pMCAO nos défices funcionais e comportamentais semelhantes à condição humana. No mínimo, um modelo eficaz de resultados do curso em déficits de movimento contralateral à lesão AVC 13-15, perda ou interrupção da função motora e sensorial 16,17, perda ou interrupção de atividade neuronal evocada 16,18, a redução no fluxo sanguíneo cerebral 19, 20, e do infarto 21,22. Dessa forma, os modelos pMCAO uma oclusão grave de MCA, resultando em incapacidade física, perda da função dentro do córtex sensorial (e córtices vizinhos), a interrupção da atividade neuronal, uma severa redução no fluxo sanguíneo MCA e atributos infarto característicos da AVC isquêmico 23 -25, portanto, servir como um modelo eficaz de acidente vascular cerebral humano.
Processualmente, pMCAO envolve uma pequena craniotomia em que remova cuidadosamente o crânio e dura deum mm x "janela cirúrgica" 2 2 sobre o segmento inicial (M1) de MCA, imediatamente antes da bifurcação primária de MCA em ramos corticais anterior e posterior (Figuras 1A e 1B). Passamos um reverso agulha de sutura de corte semi-curva e linha (6-0 seda) através da camada pial das meninges, MCA abaixo e acima da superfície cortical (ver Tabela de reagentes e equipamentos específicos para os suprimentos cirúrgicos necessários para realizar pMCAO ). Em seguida, dê um duplo ligadura, aperte os dois nós em torno de MCA, e transecto o navio entre os dois nós. A ligadura dupla e transecção através M1 ocorre apenas distal à ramificação lentículo, de tal modo que apenas os ramos corticais de MCA-são afectados, assim, apenas enfarte cortical (nenhum dano subcortical) ocorre 26,27 (Figura 2). Apesar de AVC humano muitas vezes envolve enfarte subcortical, modelando isso em roedores requer aumento da capacidade de invasão (oclusão de vasos cerebrais antes cortical Branching requer acesso artérias através da artéria carótida no pescoço e necessita de oclusões adicionais) na técnica e aumento da variabilidade no tamanho do infarto. O modelo descrito aqui não pode ser realizada mais proximal como o acesso aos ramos anteriores do MCA não é possível através de uma craniotomia simples. Embora possa ser possível para induzir cirurgicamente um enfarte sub-cortical através pMCAO, oclusão implicaria um procedimento extremamente invasivo e, por conseguinte, não é o ideal.
Eficácia de oclusão pode ser confirmada através de Doppler a laser, ou laser salpico imagiologia 12,24,25 (Figura 3), ou histologicamente post mortem (Figura 2). Deve notar-se que a pesquisa anterior tem mostrado que a estimulação sensorial pode desempenhar um papel importante na evolução e resultado de enfarte; conferir protecção contra danos quando administrados dentro de 2 horas de pMCAO e causando um aumento no dano do curso, quando administrado a 3 horas após pMCAO 24,25,28. Confirmámos que a 5 horas após a pMCAO, a estimulação já não tem um efeito sobre os resultados (dados não publicados). Assim, a estimulação sensorial de sujeitos deverá ser minimizada durante 5 horas seguindo pMCAO obter volumes de enfarte com uma variabilidade mínima. Assim, o nosso grupo vai "controles não tratados" deste tipo, mantendo os ratos anestesiados por 5 horas pós-pMCAO, no escuro, com a estimulação sensorial mínima, e expressamente nenhum estímulo triz.
Deve-se ainda notar que a variação ocasional na estrutura MCA, incluindo a excessiva ramificação, vários segmentos primários, ou a ausência de artérias comunicantes pode ocorrer em uma freqüência de 10 a 30% no sexo masculino adulto Sprague Dawley 29,30. Se anormalidades na MCA são observados, é aconselhável não usar esse assunto em particular como a adição de animais com tais anomalias vasculares vão aumentar a variabilidade do infarto.
Além disso, há vários aspectos práticos de oprocedimento ur que tornam este método de oclusão vantajoso para a investigação derrame. Em primeiro lugar, as suturas podem ser colocados ao redor da artéria, mas não apertou a fim de recolher a avaliação inicial, seguido de avaliação pós-isquêmica após ligadura e transecção. Nesta forma, a preparação cirúrgica necessária para a oclusão é efectivamente controlada por, entre os indivíduos. Como os indivíduos podem permanecer estacionária ou dentro de um quadro estereotáxico durante a oclusão, é possível realizar uma avaliação experimental de cada sujeito, antes, durante, e após a oclusão, sem mover o objecto ou perturbar qualquer equipamento em uso experimental 25,28. Além disso, este procedimento resulta em uma taxa de mortalidade muito baixa, mesmo dentro de assuntos roedores idade 21-24 meses de idade (o equivalente a um humano idoso) 31, e pode, portanto, ser usados para avaliar tratamentos acidente vascular cerebral em ratos que mais de perto o modelo mais comum faixa etária dos portadores de acidente vascular cerebral 25,28. Vessel transection também serve a vários propósitos práticos. A falta de sangramento depois da transecção confirma que o recipiente foi completamente ocluído em ambos os locais de ligadura. Além disso, transection garante uma interrupção permanente do fluxo de sangue. Finalmente, a transecção assegura que qualquer fluxo de sangue detectado nas porções distais do vaso ocluído deve vir de uma fonte alternativa.
Finalmente, embora especificamente descrever a técnica de oclusão para MCA neste manuscrito e vídeo, a mesma técnica transection ligadura dupla pode ser aplicado a qualquer vaso cerebral que pode ser acessado via craniotomia. O nosso laboratório, por exemplo, utilizado em conjunto com pMCAO várias oclusões adicionais permanentes MCA distais dos ramos, a fim de bloquear tanto primário, e do fluxo de sangue colateral 24 de uma maneira semelhante à das técnicas destinadas a induzir selectivamente isquemia no córtex somatossensorial primário 32.
Em conclusão, to seu método de oclusão permanente, tal como aplicado a MCA modela estreitamente três facetas primárias de acidente vascular cerebral humano: a localização mais comum (MCA), tipo (isquemia), e grau de dano (enfarte), associada com a literatura clínica humana de acidente vascular cerebral. Além disso, este método de oclusão pode ser aplicada aos locais de oclusão simples ou múltiplo ao longo do cérebro, e pode ser realizado em doentes idosos com uma elevada taxa de sobrevivência. Dada a natureza dinâmica, permanente e relativamente não-invasivo desta oclusão, esta técnica representa uma ferramenta adicional para os pesquisadores pré-clínicos avaliando novas abordagens para a protecção e tratamento de acidente vascular cerebral.
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Protocol
1. Introdução: Instrumentos cirúrgicos requeridos
Veja a Figura 4
- Broca de dentista (Kavo Equipamentos Odontológicos, Modelo: UMXL-TM), 2-broca e furadeira de 3 bits
- Agulhas hipodérmicas dois ~ calibre 30
- Serrilhada pinça, curvo ponta opcional (pode ser útil, mas não essencial)
- Dois pinça de ponta fina
- cortadores de fio
- Fio de sutura
- Micro tesoura
2. Criando a janela Surgical
- Anestesia: procedimentos estão em conformidade com as diretrizes do NIH e foram aprovados pela UC Irvine Animal Care e do Comitê Use. São sujeitos experimentais 295-400 g machos Sprague Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, EUA) e o seguinte procedimento de anestesia deve ser utilizado:
- Injectar rato intraperitonealmente com um bolus de pentobarbital sódico (55 mg / kg de peso corporal) seguida por uma injecção intramuscular de atropina (0,05 mg / kg de peso corporal), no hind perna, e administrados 3,0 cc de 5% de dextrose em água, por via subcutânea.
- Suplemento de pentobarbital de sódio (27,5 mg / kg de peso corporal) como injecções necessárias. Administrar uma pomada antibiótica oftálmica para os olhos para proteger as córneas durante os procedimentos seguintes. Administrar dextrose a 5% (3 mL) e atropina (0,05 mg / kg de peso corporal) a cada seis horas diminuir as secreções respiratórias durante a anestesia. Medir a temperatura do corpo por meio de uma sonda rectal, e manter a temperatura corporal a 37 ° C por uma manta térmica de auto-regulação.
- Localize a MCA por meio de:
- Desbaste a 2 x 2 mm de imagens / janela de visualização sobre o córtex somatossensorial usando um tamanho de HP 3 broca até que o crânio é quase transparente e, em seguida, diluindo a total transparência usando um tamanho de HP 2 broca. A localização do MCA pode ser visto através desta janela e a sua trajectória proximal usada para aproximar a localização do segmento inicial. MCA geralmente executado em diagonal estajanela em uma rostral para caudal / ventral à direção dorsal (por exemplo, esquerda para a direita / para cima ao ver hemisfério esquerdo do ponto de vista do cirurgião). A janela cirúrgica pode então ser criada acima, onde o observador estima o segmento M1 (proximal cortical ramificação) a ser localizado com base nas ramificações distais visíveis através da primeira janela. A fim de minimizar a quantidade de crânio que é removido a fim de obter acesso a MCA / janela de visualização da imagem deve ser posicionado próximo a, mas separada da janela cirúrgica.
Ou - Uma pequena janela cirúrgica deve ser posicionado aproximadamente 3 mm anterior e de 1 mm lateral ao forame oval ou o nervo mandibular, perto da tribuna arco 30,33,34. Para aceder efectivamente a haste do MCA (também conhecida como o segmento M1), o músculo temporal é reflectida temporariamente afastado da superfície do crânio. (Nota: No caso de cirurgias de sobrevivência a longo prazo, a experiência de nosso laboratório foi that, permitindo que o músculo temporal permanecer ligado na sua âncora, o músculo irá re-de recozimento para a superfície do crânio, permitindo comportamento alimentar saudável e eficaz manutenção do peso corporal.
- Desbaste a 2 x 2 mm de imagens / janela de visualização sobre o córtex somatossensorial usando um tamanho de HP 3 broca até que o crânio é quase transparente e, em seguida, diluindo a total transparência usando um tamanho de HP 2 broca. A localização do MCA pode ser visto através desta janela e a sua trajectória proximal usada para aproximar a localização do segmento inicial. MCA geralmente executado em diagonal estajanela em uma rostral para caudal / ventral à direção dorsal (por exemplo, esquerda para a direita / para cima ao ver hemisfério esquerdo do ponto de vista do cirurgião). A janela cirúrgica pode então ser criada acima, onde o observador estima o segmento M1 (proximal cortical ramificação) a ser localizado com base nas ramificações distais visíveis através da primeira janela. A fim de minimizar a quantidade de crânio que é removido a fim de obter acesso a MCA / janela de visualização da imagem deve ser posicionado próximo a, mas separada da janela cirúrgica.
- Siga MCA ao canto do rostral ventral da janela de imagem (se estiver a utilizar como referência), a fim de estimar a sua ramificação cortical onde inicial reside.
- Criar uma nova região thin-crânio (nos referimos a isso como a janela cirúrgica) levemente rostral e ventral para a janela de imagem (se estiver usando isso como uma referência), onde o segmento M1 (pré-cortical ramificação) do MCA deve ser. IMPORTANTE: Deixe aproximadamente um intervalo de 2 mm entre a janela de imagem (se estiver usando isso como uma referência) ea janela cirúrgica.
- Localizar a haste do MCA (também conhecida como o segmento M1) pouco antes cortical ramificação da artéria, como mostrado nas Figuras 1A e 1B.
- Usando um tamanho HP-3 broca, fino o crânio acima da localização estimada segmento M1. Quando ocrânio torna-se um pouco transparente, mude para o tamanho mais delicada pouco HP-2 broca e fina do crânio até que seja completamente transparente. Confirmar visualmente como uma área cirúrgica janela torna-se fina o suficiente para exibir a vasculatura, e avaliar a localização do M1 neste ponto e completar a janela de tal modo que não é de 2-3 mm de cada lado do comprimento do segmento de M1 (isto permite espaço para a inserção e de saída da agulha de sutura de cada lado da MCA).
NOTA IMPORTANTE: Pare desbaste quando a espessura do crânio é semelhante à da película de plástico. O navio se romperá se a broca rompe através do crânio e dura. Se o crânio não é suficientemente fina, por outro lado, removendo-o para a oclusão será difícil e pode resultar em danos para o córtex ou artéria.
- Tomar uma agulha hipodérmica de calibre 30 (30 L) e dobrar a ponta da agulha, utilizando pinças serrilhada.
- Use a agulha de 30 G para perfurar o crânio cuidadototalmente em uma área não diretamente acima de uma artéria. Utilize este buraco punção para permitir uma pinça para agarrar crânio e retire cuidadosamente a área de desbaste da janela cirúrgica.
- Dê um novo 30 G necessidade, dobre sua ponta como no Passo 6, e remova cuidadosamente a dura.
NOTA: Cortando a dura fará com que ele descascar e MCA vai se tornar mais proeminente, como resultado da pressão reduzida.
3. Oclusão da MCA
- Use o alicate para cortar um reverse meia curva corte agulha de sutura (round 3/8, agulha de sutura 16 mm) até cerca de 3-5 mm.
- Passe a agulha de sutura recortada, como mostrado na figura na Figura 4E. NOTA IMPORTANTE: É importante que a agulha é enroscada para ambas as extremidades do fio de sutura são de tamanho equivalente. Isto permite que o puxar do fio termina tanto sob M1, ao mesmo tempo, a agulha pode ser então cortado deixando livre a dois comprimentos de fio para amarrar os dois nós em torno de MCA.
- Use o serrilhado a pinça escorregar a agulha de sutura sob M1. Inserir com cerca de 0,5-1 mm de distância da MCA, ficando tão superficial quanto possível de modo a minimizar os danos ao córtex, mas evitando demasiada pressão sobre o MCA bem.
- Quando a agulha de sutura sai do outro lado de tal forma que ela está sob a MCA, utilizar uma pinça de ponta fina (como mostrado abaixo) para puxar a ponta da agulha de sutura a partir do lado oposto ao continuar a alimentar ou que empurra a outra extremidade do fio de sutura agulha com a ponta serrilhada pinças.
- Uma vez que a agulha de sutura é passado completamente sob a MCA e foi puxado para fora, de continuar a puxar o fio de sutura e agulha até que o comprimento do fio é igual em ambos os lados da MCA. Ao pressionar para baixo sobre a linha medida que é alimentado através de minimizar a tensão sobre o MCA pode ser útil para impedir a ruptura como o fio passa por baixo da artéria.
- Cortar o fio perto da agulha de sutura.
- Use as duas pinças de ponta fina para desembaraçar os dois fios de sutura resultantes de modo que existem dois segmentos independentes enfiadas sob a MCA que não se tocam. Idealmente, os tópicos serão de cerca de 1 mm de distância, onde eles passam sob MCA.
- Use as duas pinças de ponta fina para amarrar dois nós separados (duas ligaduras), com os fios em torno MCA tentando manter esse ~ 1 mm de espaço entre os nós para permitir espaço para transecção.
NOTA: Se um controlo interno sham for desejado, preparar a oclusão deixando os nós de oclusão solto de modo a que eles não se contraem MCA em tudo e recolher os dados antes de apertar os nós e corte do recipiente. Corte a linha para evitar que pegar em qualquer coisa antes da oclusão, mas deixar fio suficiente para permitir o aperto dos nós mais tarde. Desta forma, qualquer imagem de linha de base ou de recolha de dados pode ser executada com todos da mesma invasão cirúrgica como a oclusão e os nós apertados no ponto de tempo apropriado, com pouco atraso.
- Uma vez que os nós já estaren bem apertada, use o micro tesoura para cortar através de M1, entre os dois nós.
- No caso de estudos de sobrevivência a longo prazo:
- Sutura de incisão aba couro cabeludo de volta no lugar com fio cirúrgico estéril ou proteger o tecido usando clipes ferida estéreis.
- Administrar antibióticos localmente à área da ferida (tal como bacitracina pomada) e sistemicamente por injecção profilático de ampicilina (150 mg / kg, IM).
- Enquanto o sujeito é ainda anestesiados administra uma pomada antibiótica oftálmica para os olhos.
- Administrar suplementar de atropina (0,05 mg / kg IM) para diminuir as secreções respiratórias durante a anestesia.
- Injectar flunixin meglumine (1,1 mg / kg) por via subcutânea, na conclusão da cirurgia e novamente na manhã seguinte (~ 12 horas depois) para controle da dor.
- Colocar o animal em uma superfície seca, quente, inclinada de tal forma que o nariz animais está acima de sua cauda na inclinação (isso facilita a respiração até que o animal está acordado). </ Li>
- Monitorar o animal até que ele está acordado e mover com segurança por conta própria.
- Uma vez que o animal está de volta no viveiro, a atividade do animal, aparência, vocalização e comportamento alimentar e beber deve ser monitorada diariamente.
4. Eutanásia
- No final de cada experiência, os ratos devem ser sacrificados com pentobarbital de sódio (2-3 ml, por via intraperitoneal).
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Representative Results
Oclusão de sucesso de um navio pode ser confirmado usando laser de salpico de imagem (LSI), entre outras técnicas de imagem do fluxo sanguíneo. O fluxo de sangue nos principais ramos corticais da MCA deve cair para ~ 25% da linha de base ou menos após oclusão, dependendo do nível de ruído no sistema de gravação e a sensibilidade da técnica. Ver Figura 3 para uma imagem representativa de um LSI segmento de um ramo cortical da MCA, antes e após a oclusão MCA. Quando a técnica da oclusão descrito é aplicado a MCA no segmento M1, o bloqueio de todos os ramos da MCA corticais e estimulação sensorial impedido durante ~ 5 horas a seguir a oclusão, o resultado é um enfarte cortical de 28,4 ± 2,4 mm 3 (para uma fatia representativa coronal uma solução de cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazólio [TTC] cérebro coradas com os danos descritos, ver Figura 2; pálido área não corada corresponde a enfarte) 25.
Figura 1. Setas amarelas indicam a localização aproximada de pMCAO no segmento M1. Este exemplo oclusão envolve oclusão MCA apenas distal à ramificação lentículo, antes de tudo ramificação cortical, reduzindo, assim, o fornecimento de sangue a apenas ramos corticais. (A) Diagrama de MCA na superfície cortical lateral. (B) vista coronal aproximado MCA cortical e filiais subcorticais. Note-se que a oclusão da MCA proximal para lentículo ramificação irá resultar em infarto cortical e subcortical, embora o acesso a esta região necessita de um procedimento cirúrgico relativamente invasivo. Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 2. Única fatia representativa coronal do cérebro de rato a exibir um enfarte resultante da pMCAO (com o cuidado de minimizar a estimulação sensorial protectora durante 5 horas a seguir a oclusão). Cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazólio (TTC) de solução manchas avermelhadas tecido saudável e deixa zonas de morte celular ou do enfarte (indicada pela seta), pálido. Note-se que, devido ao local da oclusão (antes de todos os ramos corticais MCA mas distais aos ramos subcortical) de enfarte cortical é observada, e regiões altamente mielinizados do cérebro não ocupam a solução de TTC e, por conseguinte, continuará a ser de cor branca, apesar sendo estruturalmente intacta.
Figura 3. Imagem descreve o fluxo numa porção de uma única ramificação cortical da MCA antes e umepois pMCAO como fotografada usando laser de salpico de imagem (LSI). Cores mais quentes indicam fluxo mais forte. O ramo MCA descrito é claramente visível que atravessa a imagem da linha de base (à esquerda) do canto inferior esquerdo para canto superior direito e depois desaparece pMCAO. Nota: ocasionalmente algumas evidências mínimas de fluxo permanece num determinado ramo, mas seguintes níveis pMCAO deve cair para 20% ou menos do fluxo basal para confirmar o sucesso da oclusão.
. Figura 4 instrumentos cirúrgicos Necessário para pMCAO (A) extra fórceps Graefe Belas -.... 0,5 milímetros Dicas ligeira curva (B) com revestimento cerâmico Dumont # 5 fórceps (C) Extra Fino Scissors Bona, direto (D) Rodada 3/8 (16 mm) agulhas de sutura (E) NOTA:. agulhas de sutura podem ser shortened via cortadores de fio de acordo com a preferência do usuário. Após o encurtamento com cortadores de fio, agulhas de sutura devem ser esterilizados. (F) 6-0 trançado fio de seda. (G) 30 agulha de calibre, ½ de comprimento.
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Discussion
Este protocolo foi desenvolvido a fim de induzir isquemia dentro do córtex roedor, e a fazê-lo com o mínimo de impacto periférica sujeitos experimentais. A dupla oclusão e método transecção permite a confirmação visual de que o recipiente foi permanentemente obstruída, e pode ser realizado sem invasão excessiva ou danos no tecido, e com uma elevada taxa de sobrevivência. Este protocolo de oclusão pode ser aplicada a qualquer recipiente cortical que podem ser acedidas através craniotomia para induzir isquemia cortical dentro de um domínio específico. Além disso, essas obstruções podem ser realizadas ao mesmo tempo é um animal num aparelho estereotáxico permitindo a utilização simultânea de várias técnicas experimentais, tais como a imagiologia funcional ou gravação electrofisiológico. Isso faz com que esta técnica de oclusão aplicável a uma vasta gama de modelos experimentais, incluindo a investigação intra-sujeito. Por exemplo, a avaliação pode ser efectuada na linha de base com suturas no lugar em torno do artery (mas antes de assegurar as suturas e atravessa em), durante o início isquêmico, e em nenhum momento pós-oclusão necessário.
Execução bem sucedida dessa oclusão está subordinada a dois passos críticos. Em primeiro lugar, a visualização apropriada do vaso alvo é crítica para induzir isquemia. Oclusão num local proximal ou distal para a localização desejada (no nosso caso típico, imediatamente proximal ao primário anterior / posterior bifurcação cortical da MCA) pode resultar em um grande grau de variabilidade volume de enfarte, assim deve ser tomado cuidado para confirmar a local adequado de oclusão e transecção. Em segundo lugar, passando a agulha de sutura em torno da artéria alvo requer técnica cuidadosa e precisa. Por necessidade, a sutura vai passar através da camada mais superficial do córtex imediatamente abaixo da artéria. Deve ser tomado cuidado para evitar a mergulhar demasiado profundamente na superfície cortical, porque isto pode resultar na ruptura do vaso, hemorragia, ou danos no cérebro no occlusion local. Embora muitos tipos de instrumentos cirúrgicos de oclusão dos vasos sanguíneos estão disponíveis, o nosso laboratório tem tido o maior sucesso usando meia agulhas de sutura de curva truncada, de acordo com a preferência experimentador. Usado em conjunto com uma pinça ultra-finas, este instrumento permite que o utilizador passe abaixo do fio de sutura e uma artéria acima da superfície cortical com apenas um mínimo de danos nos tecidos.
Após a conclusão bem sucedida de uma oclusão, enfarte é limitado ao córtex sozinho (Figura 2). No contexto da utilização deste método para a oclusão MCA modelo curso, isto pode ter implicações importantes para investigadores, dado que muitos pacientes com AVC MCA sustentar enfarte tanto no córtex e gânglios basais. No entanto, nosso laboratório favorece este método de oclusão aplicada à MCA mais técnicas, como a sutura intraluminal, dadas as recentes descobertas que o comprometimento da mastigação, deglutição e performance motora ocorrem em 47% de todos os indivíduos que se submetem a intralumisutura nal 35; perfusão cerebral diminuída e diminuição da atividade motora espontânea resultante da redução de alimentos e absorção de água também contribuem para a recuperação neurológica mais pobre em ratos após a sutura intraluminal 36-40. Trueman et al. 2.011 também relataram alimentares anormais, o comportamento de beber prejudicada e sensório-motora deficiência (quantificada pela tarefa de remoção de adesivo) após este procedimento 11. Criticamente, observamos os mesmos déficits comportamentais em animais sham fio intraluminal 11. Como resultado, a sutura intraluminal pode adicionar graves fatores de confusão para pré AVC estudo, muitos dos que são diretamente atribuíveis ao procedimento cirúrgico e não para acidente vascular cerebral isquêmico cerebral.
É impossível para modelar a etiologia e patologia variável de AVC isquémico humano - na verdade, um tal grau elevado de variabilidade seria indesejável em um modelo experimental. Pesquisa AVC em animais devem instead concentrar na produção de um resultado mais análogo ao dano do curso humana e déficits durante a tentativa de modelo etiologia da melhor forma possível. Sugerimos que a natureza minimamente invasiva, a oclusão de MCA, resultando em isquemia, o volume de enfarte que é comparável à isquemia MCM humana e capacidade de incorporar várias técnicas experimentais juntamente pMCAO pode tornar este método uma alternativa atractiva para alguns investigadores do curso pré-clínicos. Além disso, o método de oclusão modelado aqui por pMCAO fornece meios alternativos, minimamente invasivas, eficazes para ocluir qualquer navio de superfície cortical.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar neste momento.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association Predoctoral Fellowship 788808-41910, o NIH-NINDS NS-NS-066001 e 055832, e O Centro de Investigação Fonoaudiológica NIH Training Grant 1T32DC010775-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extra Fine Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Slight Curve (1) | Fine Science Tools | 11151-10 | |
| Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Extra Fine Bonn Scissors, straight (1) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Round 3/8 (16 mm) Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| 6-0 Braided Silk Suture | Fine Science Tools | NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461 |
|
| 30 gauge needle, ½" length | Fine Science Tools | NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL |
References
- Caplan, L. R. Caplan's Stroke, A Clinical Approach. , 4th edn, Saunder's & Elsevier. (2009).
- Blumenfeld, H. Neuroanatomy Through Clinical Cases. , Sinauer Associates. (2002).
- Roger, V. L., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2011).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22, 391-397 (1999).
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol. Biochem. Behav. 87, 179-197 (2007).
- Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Busto, R., Watson, B. D. Photochemically induced cortical infarction in the rat. 2. Acute and subacute alterations in local glucose utilization. J. Cereb. Blood Flow Metab. 6, 195-202 (1986).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann. Neurol. 17, 497-504 (1985).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
- Howells, D. W., et al. Different strokes for different folks: the rich diversity of animal models of focal cerebral ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30, 1412-1431 (2010).
- Trueman, R., et al. A Critical Re-Examination of the Intraluminal Filament MCAO Model: Impact of External Carotid Artery Transection. Transl. Stroke Res. 2, (2011).
- Dirnagl, U. Neuromethods. Waiz, W. olfgang , Spring Science & Business Media. New York. (2010).
- Cirstea, M. C., Levin, M. F. Compensatory strategies for reaching in stroke. Brain. 123 (Pt. 5), 940-953 (2000).
- Nakayama, H., Jorgensen, H. S., Raaschou, H. O., Olsen, T. S. The influence of age on stroke outcome. The Copenhagen Stroke Study. Stroke. 25, 808-813 (1994).
- Nudo, R. J., Plautz, E. J., Frost, S. B. Role of adaptive plasticity in recovery of function after damage to motor cortex. Muscle Nerve. 24, 1000-1019 (2001).
- Chiganos, T. C., Jensen, W., Rousche, P. J. Electrophysiological response dynamics during focal cortical infarction. J. Neural Eng. 3, 15-22 (2006).
- Traversa, R., Cicinelli, P., Bassi, A., Rossini, P. M., Bernardi, G. Mapping of motor cortical reorganization after stroke. A brain stimulation study with focal magnetic pulses. Stroke. 28, 110-117 (1997).
- Weber, R., et al. Early prediction of functional recovery after experimental stroke: functional magnetic resonance imaging, electrophysiology, and behavioral testing in rats. J. Neurosci. 28, 1022-1029 (2008).
- Dirnagl, U., Kaplan, B., Jacewicz, M., Pulsinelli, W. Continuous measurement of cerebral cortical blood flow by laser-Doppler flowmetry in a rat stroke model. J. Cereb. Blood Flow Metab. 9, 589-596 (1989).
- Wintermark, M., et al. Comparison of admission perfusion computed tomography and qualitative diffusion- and perfusion-weighted magnetic resonance imaging in acute stroke patients. Stroke. 33, 2025-2031 (2002).
- Crafton, K. R., Mark, A. N., Cramer, S. C. Improved understanding of cortical injury by incorporating measures of functional anatomy. Brain. 126, 1650-1659 (2003).
- Nudo, R. J., Eisner-Janowicz, I. Ch. 12. Reprogramming the Cerebral Cortex. Lomber, S. tephen, Eggermont, J. os , Oxford Scholarship Online. (2006).
- Davis, M. F., Lay, C. C., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Amount but not pattern of protective sensory stimulation alters recovery after permanent middle cerebral artery occlusion. Stroke. 42, 792-798 (2011).
- Lay, C. C., Davis, M. F., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Mild sensory stimulation completely protects the adult rodent cortex from ischemic stroke. PLoS One. 5, e11270 (2010).
- Lay, C. C., Davis, M. F., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Mild sensory stimulation reestablishes cortical function during the acute phase of ischemia. J. Neurosci. 31, 11495-11504 (2011).
- Coyle, P. Middle cerebral artery occlusion in the young rat. Stroke. 13, 855-859 (1982).
- Risedal, A., Zeng, J., Johansson, B. B. Early training may exacerbate brain damage after focal brain ischemia in the rat. J. Cereb. Blood Flow Metab. 19, 997-1003 (1999).
- Lay, C. C., Davis, M. F., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Mild sensory stimulation protects the aged rodent from cortical ischemic stroke following permanent middle cerebral artery occlusion. Journal of the American Heart Association Cardiovascular and Cerebrovascular Disease. , (2012).
- Niiro, M., Simon, R. P., Kadota, K., Asakura, T. Proximal branching patterns of middle cerebral artery (MCA) in rats and their influence on the infarct size produced by MCA occlusion. J. Neurosci Methods. 64, 19-23 (1996).
- Wang-Fischer, Y. Manual of Stroke Models in Rats. , CRC Press. 17-30 (2009).
- Quinn, R. Comparing rat's to human's age: how old is my rat in people years? Nutrition. 21, 775-777 (2005).
- Wei, L., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A.
- Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. J. Cereb. Blood Flow Metab. 8, 474-485 (1988).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
- Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34, 2252-2257 (2003).
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26, 1086-1091 (1995).
- Kuge, Y., Minematsu, K., Yamaguchi, T., Miyake, Y. Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 26, 1655-1657 (1995).
- Laing, R. J., Jakubowski, J., Laing, R. W. Middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Which method works best? Stroke. 24, 294-297 (1993).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke. 29, 2162-2170 (1998).
