Summary
我们描述的方法来研究蠕虫amylopathies方面
Abstract
的Amylopathy是一个术语，描述了异常的β淀粉样蛋白（Aβ）的合成和积累组织中随着时间的推移。 Aβ是阿耳茨海默氏病（AD）的一个标志，并且被发现在路易体痴呆，包涵体肌炎和脑淀粉样血管病1-4。 Amylopathies随着时间的推移逐步发展。出于这个原因，简单的有机体寿命短，可能有助于阐明分子方面的这些条件。在这里，我们描述了实验协议利用线虫研究Aβ介导的神经退行性疾病。因此，我们构建转基因蠕虫通过注射DNA编码人类Aβ42到成年雌雄同体的合胞性腺。转化线是稳定的诱变诱发的整合。线虫是年龄同步收集和播种他们的鸡蛋。测试时机行为分析的功能神经元表达Aβ42（趋化实验S）。从胚胎的原代神经元培养物的使用行为数据的补充和测试抗凋亡的化合物的神经保护作用。
Introduction
β淀粉样蛋白（Aβ）是36-43个氨基酸的肽的顺序裂解后形成的淀粉样前体蛋白（APP），β和γ分泌1。的γ分泌的Aβ肽的C-末端进行处理，并负责可变长度5。 Aβ的最常见的形式是Aβ40和Aβ42，后者更常见的病理条件下，如AD 5相关联。 Aβ形式在高浓度的β-折叠，聚集形成淀粉样纤维6。存款的原纤维周围神经元的老年斑的主要成分。两个斑块和斑块扩散，非Aβ寡聚体，被认为构成了潜在的致病形式的Aβ。
实验室神经元amylopathies研究是复杂的事实，这些条件随时间的进展。因此，它是重要的吨至发展互补基因听话的动物模型小鼠寿命短。这些模型可以用来阐明具体方面amylopathies典型的细胞和分子，凭借其简单，有利于把握问题的实质。 线虫瀑布是这一类。它有一个很短的寿命，〜20天，除了基本的细胞过程，包括调节基因表达，蛋白质贩运，神经元连接，突触，细胞信号传导，和死亡的哺乳动物7类似。蠕虫的独特功能包括强大的遗传学和缺乏的血管系统，使独立研究神经元损伤血管损伤。另一方面，人脑的缺乏限制下使用线虫研究神经退行性疾病的许多方面。此外，病变的解剖分布的再现和识别不能进行这种微生物。其他限制ations包括两个基因表达谱的差异和复杂的行为和记忆功能的减值难以评估。在这里，我们描述的方法来生成C。线虫模型amylopathies。
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Protocol
1。转基因蠕虫建设
- 转型。
- 准备注射垫。热，2％琼脂糖溶解在水中，将下降到玻璃盖玻片上。快速放置第二个下拉盖玻片，轻轻敲击。在琼脂糖固化，滑动盖玻片分开，和烘烤盖玻片垫在真空烘箱中在80℃CO / N。
- 拉移液器。我们使用一个萨特的P-97车夫拉1/0.5毫米OD / ID硼硅毛细血管长丝。移液器都是伪造的，这是打破在稍后阶段开放与闭合尖端。
- 准备注射组合。使注射含有感兴趣的DNA（20毫微克/微升每构造）附加空质粒DNA的终浓度为150纳克/微升。离心注射液混合，以消除任何污染物。这一步是至关重要的，因为污染物降低转化效率。 5微升（碎片和其他污染物在底部收集）转移到一个新的管到bË用于注射。
- 注射混合装入毛细。的移液管的底部被浸入在注射的组合。通常，0.5μL足以注入100蠕虫。
- 装入注射针。吸管插入到显微持有人，并打破它打开安装在玻片上，或者对琼脂糖凝胶垫碎片盖玻片边缘摩擦笔尖。这是一个关键的一步，过大的秘诀损害蠕虫和太小的提示很容易堵塞。破碎小费的质量可以判断的形状和最重要的是由流量。评估的流率可以从打开的前端浸渍在卤化碳700油中的注射压力的下降流动的气泡的大小。
- 蠕虫传输到注射垫。将下降700卤烃油注射垫和几个（1或2，适合初学者）蠕虫转移到油。使用蠕虫挑推蠕虫垫，直到上Ÿ坚持琼脂糖。蠕虫的方向应该与腹侧朝向相同的方向中的行。避免接触蠕虫的头部。如果多次尝试后未能坚持蠕虫垫，更换新鲜垫或增加琼脂糖厚度和/或浓度。
- 将吸管插入该蠕虫。通过移动舞台，蠕虫定位下的吸管。核心性腺吸管的位置，因为它的许多生殖细胞的细胞核细胞质共享。这增加了注射的DNA的许多后代的可能性。移液管应位于几乎平行于蜗杆（约15°-25°的角度）。垂直推冰山的吸管跌蠕虫的身体，直到皮肤被压下。然后轻轻拍打操纵器上，诱使尖端的插入。为了达到最佳效果，同时注入性腺。
- 注入的DNA溶液。施加压力，以吸管，直到性腺肿。停止流和关闭吸管拉蠕虫。测试针流量，然后将到下一个蜗杆和重复注射的步骤。
- 恢复蠕虫：加一滴（约10微升）恢复缓冲蠕虫和孵化，直到蠕虫开始游泳。加入等体积的M9，等到恢复蠕虫游泳和重复几次，直到解决方案主要是M9。个别蠕虫种子板块。
- 集成。
- 到一个新的板块，将40名健康，良好的喂养，L4蠕虫
- 4000拉德γ-射线照射40分钟。照射蠕虫（P0）传送新鲜，OP50种子板（4蠕虫/板）。蠕虫也可以照射剂量为300焦耳/米2的UV。
- 从各板块个别板块转移10-20 F1转化，标示板与相应的P0起源。
- 单出2-4 F2转化为每个F1分开板。检查F3后代100％传输改造标记。通常情况下，后代1-3％一个照射的蠕虫WILl具有整合事件。
- 股票中的三个或更多个独立的转化体线。
2。行为分析
- 年龄同步。
- 在标准的10厘米NGM板+ OP50 E.成长蠕虫妊娠成人一个人口众多的大肠杆菌，直到达到（3-5天）。
- 收集在50毫升猎鹰管蠕虫悬浮于1毫升M9的缓冲区。
- 在450×g离心3分钟，加入5毫升M9缓冲液，离心。弃上清。重复3至4倍。
- 在年底的最后离心，去除上清，加入颗粒蠕虫的基本次氯酸钠溶液（0.5 M氢氧化钠，1％次氯酸钠新鲜混合）10卷。在室温下孵育约10分钟。该裂解反应可以放置在盖玻片上的裂解反应的下降，并在显微镜下检查蠕虫监测。当大约80％的蠕虫被打破了反应，应停止。
- 停止插件裂解反应克蛋无菌缓冲液相同的体积。
- 在450×g离心5分钟，通过离心收集鸡蛋（尸体）。
- 鸡蛋洗净，用无菌鸡蛋缓冲区2-3X。
- M9的缓冲区和种子NGM板标准孵蛋O / N。
- 趋化实验。
- 准备几件琼脂0.5x0.5x0.5厘米左右。我们存入琼脂在10厘米的板，并从那里，我们削减了琼脂块。
- 浸泡琼脂块在溶液中含有所需的引诱剂（在饱和附近的饱和浓度）2小时。典型的引诱是赖氨酸（0.5米），生物素（0.2米）。
- 定金琼脂在10厘米的试验板，其中一个测试点的位置，以及控制点（ 图1A）已经被标记块。允许平衡，形成梯度O / N（ 图1B）。一个单一的实验准备5大板块。
- 之前的实验中加10微升20毫米楠3（ANESThetic）对各点。
- 将20岁的同步蠕虫在板的中心。在孵化器在20℃下将板
- 1小时后，算上动物测试/控制点和趋化指数（CI）计算如下：
其中，N 测试和N Cnt的，表明动物的总数，在测试点的动物的数量，在控制点的动物的数量。
其中，N 测试和N Cnt的，表明动物的总数，在测试点的动物的数量，在控制点的动物的数量。 3。初级胚胎细胞培养
- 裂解蠕虫所描述的年龄同步。
- 停止的裂解反应，在450×g离心5分钟，加入无菌鸡蛋相同体积的缓冲液和离心。轻轻弃上清小心不要失去颗粒鸡蛋。重复2 - 3倍，或直至上清明确。
- 重悬浮颗粒鸡蛋（和尸体）在2毫升无菌蛋缓冲液，并加入2毫升的蛋缓冲液的无菌60％的蔗糖。混合解决方案，直到鸡蛋完全悬浮（离心作用下，他们往往会形成团块）由专人或以涡旋。
- 以450×g离心15分钟。
- 小心转移上清（含鸡蛋）的无菌试管中。丢弃颗粒包含屠体及其他副产品裂解。
- 蛋的蛋缓冲液再悬浮和离心分离，在450×g离心5分钟，以除去残留的蔗糖。轻轻收集，弃上清。重复3倍。
- 重悬沉淀层流罩下无菌鸡蛋缓冲液含1 U / ml的几丁质酶RT消化蛋壳的鸡蛋。 30分钟后开始监测反应（倒细胞培养显微镜下）。每一批次的几丁质酶有一个稍微不同的活动。通常在1小时内消化完毕。
- 大约有70-80％的蛋壳是由几丁质酶添加CM-15（L-15细胞培养MED消化鎓含有10％胎牛血清，50单位/ ml青霉素和50μg/ ml的链霉素）。游离细胞使用注射器用27号。过滤5.0微米的过滤器，取出完整的胚胎细胞和幼虫，一丛丛的细胞悬液。
- 颗粒解离的细胞悬浮液通过离心分离，在450×g离心15分钟。取出上清，悬浮颗粒在CM-15细胞培养基。
- 板分离的细胞上的玻璃盖通知单预先涂有花生凝集素（0.1毫克/毫升）溶解在水：细胞必须坚持到基板中，为了区别。
- 细胞可以在室温下（16-20℃）在空气中保持2周以上。
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Representative Results
我们的协议中，我们研究了人类Aβ42低聚物对神经元功能8。推出了平均1两端的限制性内切酶的引物扩增片段编码人类Aβ42和序列消防载体pPD50.52的人工信号肽编码从结构PCL12 9使用。然后将该片段插入到含有2481 bp的FLP-6启动子序列的一个构造在pPD95.75火焰矢量之间的独特的SMA 1站点10。使用协议1中描述的改造技术，我们构建了转基因蠕虫表达Aβ42 ASE神经元（FDX（ses25）株）8。为了纪念积极转化，我们使用的P GCY-5 :: GFP记者专门驱动GFP表达的ASE权（ASER），的神经元11。蠕虫坚持干琼脂糖吸收垫，因为他们的水。因此，它是クリュCIAL被放置到动物注射垫，注入比较快，否则会因为干和死亡。 F1代的百分比，携带有传染性的染色体外的阵列可能会有所不同。的典型值是在3-7％的范围内。注射组合（1.1.3）重要的是，包含非编码DNA共享，因为该DNA序列的转基因DNA的同源性（通常是空载体）进行同源重组彼此。但是，如果转基因的过量表达是一个问题，注射组合应补充有50〜100毫微克/微升基因组DNA消化的SCA 1。 ASE神经元检测水溶性诱如生物素，因此，它们的功能可以评估在行为分析（趋化实验，方案2和图1A和1B）12。在一个典型的实验中，我们测试了7天的老蠕虫表达P GCY-5 :: GFP单独（DA1262株）或Aβ42（FDX（ses25），）趋化素。年轻蠕虫（3-4日龄）42Aβ表达的影响是温和的，但已经检测（〜10％的跌幅趋化指数，见文献8）。在此实验中的有代表性的结果示于图1C和1D。大多数DA1262蠕虫被发现，或在附近，引诱点（ 图1C）。相比之下，只有少数蠕虫能找到表达Aβ42诱食点（ 图1D）。 DA1262 FDX（ses25），分别测试了100只/基因型分布在5个试验板/基因型取得的一个趋化指数为生物素0.68±0.09和0.12±0.04。生产中的蠕虫个别拾取，并转移到试验板的中心。重要的是要不仅能快速，而且还轻轻蠕虫传输，否则他们可能保持非活动状态几分钟，无法掌握其诱食。在实验结束时，我们建议显示器蠕虫ctivity看着自己的路径。如果只有几个曲目是可见的，通常我们丢弃的板块。
ASER FDX（ses25）蠕虫的神经元中的GFP荧光消失（图中未示出）内的第一个11天的生活。这表明，这些细胞进行细胞凋亡的存在下，由于Aβ42。因此，我们确定是否如细胞凋亡抑制剂的广谱Caspase抑制剂N-（2 -喹啉基）缬氨酰-天冬氨酰- （2,6 -二氟苯氧基）甲基酮（Q-VD-OPH）13的的ASER细胞损失停止。为此，我们采用原代培养的的ASER神经细胞从胚胎14，而编制中所描述的协议3。示于图2A-C ASER神经元的一个年轻（4日龄）FDX（ses25）蠕虫以及在培养的神经元的图像的代表图像。体外培养的ASER细胞是短命（ 图2D）。正如预期的那样孵育0.3微克/毫升新鲜Q-VD-OPH每天补充，C ompletely停止荧光ASER神经元的损失。文化工作的初级神经元时，重要的是要保持一个有利的细胞密度。此参数主要取决于用于提取蛋的蠕虫的数量。我们衡量标准血球细胞密度，并采取特别护理，以保持恒定的细胞培养，细胞培养的细胞密度。如这里所描述的药理实验，我们的工作〜200,000细胞/厘米2，得到的收获四个汇合10厘米的板。细胞接种在12孔的24孔板中。为了达到最佳效果，这也是很重要游离在播种前，胚胎干细胞，因为它们往往会形成团块。我们使用注射器，27号针头和士绅吸暂停回来，来回几次。游离细胞（尤其是在开始的时候我们建议在显微镜下检查悬架），这通常是足够的。
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图1。趋化实验。：A.代表趋化板。诱食剂（生物素）和控制点都标有一个空心的，实心圆。B.甲趋化板装有0.5厘米直径的琼脂块，用于建立的生物素的梯度。琼脂块被切成10厘米板采用顶侧玻璃巴斯德吸管C.代表蠕虫周围的诱食点分布。在这个例子中的DA1262蠕虫的大部分是能够本地化引诱剂（生物素）的来源。D. FDX ses25蠕虫在C。这些生物素不敏感的蠕虫各地中厚板呈现分布零散，只有少数诱食点附近被发现。
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图2。 C.文化线虫的胚胎干细胞。A.荧光显微镜图像（左图）和亮光（右图）从FDX（ses25）转基因蠕虫头。这个蠕虫GCY-5启动子驱动的ASER神经元表达绿色荧光蛋白在明亮的光线。FDX（ses25）胚胎干细胞的文化形象。比例尺为5微米。C.荧光显微镜图像的培养FDX（ses25）ASER神经元。配备数码相机奥林巴斯BX61显微镜图像。D.代表实验测试的生存能力的培养，年龄同步，ASER神经元。细胞是取自DA1262胚胎（空心圆圈）FDX（ses25）的胚胎保持在300毫微克/毫升的Q-VD-蛇夫座（中空填充的正方形，分别）的不存在/存在下。 GFP荧光的消失，作为一个神经元的生存力的量度。前期开始periment〜300荧光ASER神经元。存活率计算为100 *（X日在第1天）的荧光细胞数除以荧光细胞的数量。 点击这里查看大图 。
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Discussion
在这里，我们描述相结合的办法，来研究细胞和分子方面，用C amylopathies 线虫 。这种方法的优点包括：1）成本低。 线虫保持在正常与细菌接种的陪替氏培养皿中，在室温下。 2）强大的遗传学。转基因动物在几个月内，可以得到各种各样的启动子序列可用来驱动在特定神经元的所需基因的表达。 3）操作简单，良好的特点，神经系统。C.线虫拥有一个非常简单的神经系统（302个神经元）。这种简单蠕虫的神经系统已经得到了广泛的特征，包括细胞系，特定的功能/每个神经元及其突触连接的作用。 C.的局限性线虫阻碍标准生化免疫组化等技术的应用和厚皮肤（角质层），隔离神经细胞，包括小尺寸组建而成形成的外部环境。因此，药理学方法可能效果有限C.的原代细胞培养代表一个有效的策略，以部分地改善这一问题。
这些实验的协议中的关键步骤包括大量的蠕虫和监测的准备工作，为了不失去卵子，胚胎等动物遗传。这也是学习如何处理动物在注射过程中的关键。蠕虫在琼脂糖凝胶垫保持太久，打孔他们用大吸管或注入太多的DNA混合，不可逆的损坏。转化效率，重现性和转基因的表达可能会有所不同。效率与注射组合的纯度和其组合物（非编码DNA的存在下）。不同的染色体外阵列从动物到动物，因此它是至关重要的建立至少2-3个，独立的线路，每转基因。另一方面，增加了消化基因组DNA的组合代表一个有效的策略，以减少转基因的过度表达。趋化实验是比较麻烦的。然而，它是至关重要的维持中的浓度梯度，以避免错误的结果的一致性。使用琼脂件相同的大小，例如，用巴氏吸管切断和保持平衡时间常数。如果有的话，用棉签去除多余的溶液。
总之，我们在这里提供一个简单的基因听话的有机体如何可以被利用来研究分子方面amylopathies的一个例子。在相同的实验技术可以应用到其他神经元蛋白的研究，并产生新的疾病的动物模型。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争经济利益。
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. NGM | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 3 g |
| Bacteriological agar | AMRESCO | J637 | 17 g |
| Bacto-peptone | AMRESCO | J636 | 2.5 g |
| Distilled Water | Bring to 975 ml | ||
| Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well | |||
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 1 ml of 1 M stock |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C3045 | 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol) |
| Potassium phosphate buffer | 25 ml of 1M stock | ||
| 2. Potassium phosphate buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 108.3 g |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | 35.6 g |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 3. M9 buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 3 g |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | 6 g |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 5 g |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm) | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 118 mM |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | 48 mM |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 2 mM |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | 2 mM |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | 25 mM |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 5. CM-15 | |||
| L-15 culture medium | Gibco | 11415 | 450 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | 50 ml |
| Penicillin | Gibco | 15140 | 50 units/ml |
| Streptomycin | Gibco | 15140 | 50 g/ml |
| Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C | |||
| 6. Other Reagents | |||
| Halocarbon 700 oil | Halocarbon Products | 9002-83-9 | |
| 5 μm Acrodisc Syringe Filter | PALL Co. | 4199 | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-5UN | |
| Lectin (peanut) | Sigma-Aldrich | L0881-10MG | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S320 | |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
References
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