Een Published: May 17, 2013 doi: 10.3791/50435

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Zhibing Duan¹, Federico Sesti¹

¹Department of Neuroscience and Cell Biology, Robert Wood Johnson Medical School, University of Medicine and Dentistry of New Jersey

Summary

Beschrijven we methoden om aspecten van amylopathies in de worm te bestuderen

Abstract

Amylopathy is een term die abnormale synthese en accumulatie van amyloïde beta (Aß) in weefsels met de tijd beschrijft. AB is een kenmerk van de ziekte van Alzheimer (AD) en is gevonden in Lewy body dementie, inclusion body myositis en cerebrale amyloïde angiopathie ^1-4. Amylopathies geleidelijk ontwikkelen met de tijd. Daarom eenvoudige organismen met een korte levensduur kan helpen om moleculaire aspecten van deze voorwaarden helderen. Hier beschrijven we de experimentele protocollen aan Aß-gemedieerde neurodegeneratie met de worm Caenorhabditis elegans. Zo bouwen we transgene wormen door het injecteren van DNA dat codeert voor humaan Ap ₄₂ in de syncytieel gonaden van volwassen hermafrodieten. Transformante lijnen worden gestabiliseerd door een mutagenese-geïnduceerde integratie. Nematoden zijn leeftijd gesynchroniseerd door het verzamelen en zaaien hun eieren. De functie van neuronen die _Aß42 worden getest opportuun gedrag assays (chemotaxis assays). Primaire neuronale culturen afkomstig van embryo's worden gebruikt om gedrags-gegevens aan te vullen en aan de neuroprotectieve effecten van anti-apoptotische verbindingen te testen.

Introduction

Amyloid beta (Aß) is een peptide van 36-43 aminozuren dat wordt gevormd na klieving van het amyloïd precursor eiwit (APP) door β en γ secretasen ^1. Het γ secretase verwerkt de C-terminale einde van het Aß peptide en is verantwoordelijk voor de variabele lengte ^5. De meest voorkomende vormen van Aß zijn Aß Aß ₄₀ en _42, welke laatste vaker geassocieerd met pathologische aandoeningen zoals AD ^5. Bij hoge concentraties Aß vorm β-sheets die aggregeren tot amyloid fibrillen vormen ^6. Fibrillen afzettingen zijn de belangrijkste component van seniele plaques omringende neuronen. Zowel plaques en diffundeerbaar, niet-plaque Aß oligomeren, wordt gedacht dat de onderliggende pathogene vormen van Ap vormen.

Laboratoriumonderzoek van neuronale amylopathies wordt gecompliceerd door het feit dat deze voorwaarden vooruitgang tijd. Daarom is important om genetisch handelbaar dier te ontwikkelen modellen-complementair aan muizen-met een korte levensduur. Deze modellen kunnen worden gebruikt om specifieke aspecten van amylopathies-typisch cellulaire en moleculaire-en uit hoofde van hun eenvoud, helpen om de essentie van het probleem vast te leggen toe te lichten. De worm Caenorhabditis elegans falls is deze categorie. Het heeft een korte levensduur, ~ 20 dagen en bovendien fundamentele cellulaire processen zoals regulatie van genexpressie, eiwit mensenhandel, neuronale connectiviteit, synaptogenese, cell signaling, en dood zijn vergelijkbaar met zoogdieren ^7. Unieke eigenschappen van de worm zijn krachtige genetica en het ontbreken van een vatenstelsel, waardoor neuronale beschadiging onafhankelijk van vasculaire schade bestuderen. Anderzijds, het ontbreken van hersenen beperkt het gebruik van C. elegans te bestuderen van vele aspecten van neurodegeneratie. Bovendien kan de reproductie en identificatie van anatomische verdeling van laesies worden uitgevoerd in dit organisme. Andere limietties omvatten de moeilijkheid om zowel verschillen in genexpressie profielen en bijzondere waardevermindering van complex gedrag en geheugenfunctie beoordelen. Hier beschrijven we methoden genereren C. elegans modellen van amylopathies.

Protocol

1. Constructie van Transgene Worms

1. Transformatie.
   1. Bereid injectie pads. Breng een druppel hete, 2% agarose opgelost in water, op een glazen dekglaasje. Plaats snel een tweede dekglaasje op de druppel en zachtjes tikken. Nadat de agarose is gestold, dia dekglaasjes elkaar en bak de dekglaasje-pad in een vacuümoven bij 80 ° CO / N.
   2. Trek pipetten. We maken gebruik van een Sutter P-97 puller naar 1/0.5 mm OD / ID borosilicate capillairen met gloeidraad te trekken. Pipetten zijn gesmeed met gesloten tip die wordt opengebroken in een later stadium.
   3. Bereid injectie mix. Dien de injectie mengsel dat het DNA van belang (20 ng / ul per construct) plus lege plasmide-DNA tot een uiteindelijke concentratie van 150 ng / ul. Centrifugeer de injectie mengsel om eventuele verontreinigingen te verwijderen. Deze stap is cruciaal omdat verontreinigingen te verminderen transformatie-efficiëntie. Breng de bovenste 5 pl (vuil en andere verontreinigingen op de bodem) een nieuwe buis be gebruikt in injectie.
   4. Laad injectie mix door capillariteit. De onderkant van de pipet wordt ondergedompeld in de injectie mix. Typisch 0,5 gl voldoende om 100 wormen injecteren.
   5. Laad injectie pipet. Plaats de pipet op de houder van de micromanipulator en breek hem open door wrijven haar tip tegen de rand van een dekglas aangebracht op een glasplaatje of als alternatief tegen vuil op de agarose pad. Dit is een cruciale stap als te groot tips beschadiging van de worm en de te kleine tips zijn gemakkelijk verstopt. De kwaliteit van de gebroken punt kan worden beoordeeld door de vorm en vooral door de stroomsnelheid. Het debiet kan worden bepaald door de grootte van de luchtbellen die uit de open uiteinde ondergedompeld in een druppel olie halogene 700 in reactie op een injectiedruk.
   6. Overdragen wormen aan injectie pad. Breng een druppel 700 halogene olie op een injectie pad en overdragen meerdere (1 of 2 voor beginners) wormen aan de olie. Gebruik een worm kiezen om de wormen te duwen naar beneden op het pad tot aan dey zich houden aan de agarose. Wormen moet worden afgestemd in rijen met ventrale zijden in dezelfde richting. Vermijd het aanraken van het hoofd worm. Indien na verschillende pogingen de wormen niet te houden aan de pad, te vervangen door een verse pad of verhogen agarose dikte en / of concentratie.
   7. Plaats de pipet in de worm. Door het verplaatsen van het podium, de positie van de worm onder het pipet. Plaats de pipet in de centrale kern van de gonaden omdat het cytoplasma wordt gedeeld door vele kiemcellen kernen. Dit verhoogt de kans op geïnjecteerde DNA leveren vele nakomelingen. De pipet moet bijna parallel aan de worm (~ 15 ° -25 ° hoek) liggen. Duw verticaal de punt van de pipet naar beneden het lichaam van de worm totdat de huid wordt ingedrukt. Dan zachtjes tikken op de manipulator naar tip's inbrengen induceren. Voor het beste resultaat te injecteren beide geslachtsklieren.
   8. Spuit de DNA-oplossing. Oefen druk uit op de pipet totdat de gonaden zwelt. Stop de stroom en trek de worm uit de pipet. Test de naald voor doorstroming en verplaatsnaar de volgende worm en herhaal injectie stappen.
   9. Herstellen van de wormen: Voeg een druppel (~ 10 pi) van herstel buffer op de wormen en incubeer tot de wormen beginnen zwemmen. Voeg een gelijk volume van de M9, wachten tot wormen hervatten zwemmen en meerdere malen te herhalen totdat de oplossing is meestal M9. Individueel wormen overbrengen naar gezaaid platen.
2. Integratie.
   1. Plaats 40 gezonde, weldoorvoede, L4 wormen in een verse plaat
   2. Bestralen met γ-ray met 4000 rad gedurende 40 minuten. Overdragen bestraalde wormen (P0) in verse, OP50 gezaaide platen (4 worms / plaat). Wormen kunnen ook worden bestraald met een dosis van 300 J / m ² UV's.
   3. Overdragen 10-20 F1 transformanten van elke plaat aan individuele platen, het etiket van de platen met de bijbehorende P0 herkomst.
   4. Single uit 2-4 F2 transformanten voor elke F1 om afzonderlijke platen. Controleer de F3 nakomelingen voor 100% transmissie van de transformatie marker. Typisch, 1-3% van de nakomelingen van een bestraald worm WilIk heb een integratie evenement.
   5. Maak voorraden van drie of meer onafhankelijke transformant lijnen.

2. Behavioral Testen

1. Age-synchronisatie.
   1. Groeien wormen in standaard 10 cm NGM platen + OP50 E. coli tot grote populatie van zwangere volwassenen is bereikt (3-5 dagen).
   2. Verzamel de wormen in 50 ml Falcon buizen hangen aan in 1 ml M9 buffer.
   3. Voeg 5 ml M9 buffer en centrifugeer bij 450 xg gedurende 3 minuten. Gooi supernatant. Herhaal dit 3-4x.
   4. Aan het einde van de laatste centrifugatie, verwijder het supernatant en voeg 10 volumes basic hypochloriet oplossing (0,5 M NaOH, 1% hypochloriet vers gemengd) aan de gepelleteerde wormen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ~ 10 minuten. De lysis reactie kan worden gevolgd door een daling van de lysis reactie op een dekglaasje en onderzoek van de wormen onder een microscoop. Bij ongeveer 80% van de wormen zijn gebroken de reactie moet worden gestopt.
   5. Stop de lysis reactie door adding hetzelfde volume van steriele ei buffer.
   6. Verzamel de eieren (en karkassen) door centrifugatie bij 450 xg gedurende 5 minuten.
   7. Was de eieren met steriele ei buffer 2-3x.
   8. Incubeer de eieren O / N in M9 buffer en zaad hen op standaard NGM platen.
2. Chemotaxis assay.
   1. Bereid verschillende stukken van agar ruwweg 0.5x0.5x0.5 cm. Wij storten de agar in een 10-cm plaat en we snijden de agar brokken van daar.
   2. Week de agar blok in een oplossing die het gewenste lokstof (bij verzadigende, bijna verzadigende concentraties) gedurende 2 uur. Typische lokstoffen zijn lysine (0,5 M), biotine (0,2 M).
   3. Borg een agar stuk in een 10 cm testplaat waarbij de locatie van een testpunt en een controlestip zijn gemarkeerd (Figuur 1A). Laat equilibratie en de vorming van een gradiënt O / N (Figuur 1B). Bereid 5 platen voor een enkel experiment.
   4. Vóór de proef voeg 10 ul van 20 mM _NaN3 (anesthetic) naar elke plek.
   5. Plaats 20 leeftijd-gesynchroniseerde wormen in het midden van de plaat. Plaats de plaat in de incubator bij 20 ° C.
   6. Na 1 uur, tel de dieren op de test / controle vlekken en het berekenen van de chemotaxis index (CI) als volgt: waar N, _N-test en N _Cnt., geven het totale aantal dieren, het aantal dieren in de test plek en het aantal dieren in de controle ter plaatse.

3. Primaire embryonale cel Cultuur

1. Lyse wormen zoals beschreven in leeftijd-synchronisatie.
2. Stop de reactie door toevoeging lysis hetzelfde volume steriele ei buffer en centrifugeer bij 450 xg gedurende 5 minuten. Zachtjes gooi supernatant voorzichtig om niet gepelleteerde eieren verliezen. Herhaal 2-3x of totdat supernatans helder is.
3. Resuspendeer pellet eieren (en karkassen) In 2 ml steriele ei buffer en voeg 2 ml steriele 60% sucrose in ei-buffer. Meng deze oplossing tot de eieren volledig geresuspendeerd (zo ze de neiging om samen te klonteren onder centrifugeren) met de hand of vortexen.
4. Centrifugeer bij 450 xg gedurende 15 minuten.
5. Overdragen supernatant (met daarin de eieren) voorzichtig naar een steriele buis. Gooi pellet die karkassen en andere bijproducten van de lysis bevat.
6. Resten sucrose door resuspenderen de eieren in ei buffer en centrifugatie bij 450 xg gedurende 5 minuten. Zachtjes te verzamelen en gooi het supernatant. Herhaal 3x.
7. Onder een laminaire kap resuspendeer pellet eieren in steriele ei buffer met 1 U / ml chitinaseactiviteit bij KT om de eierschalen verteren. Na 30 min beginnen om de reactie (onder een omgekeerde celcultuur microscoop) monitoren. Elke batch chitinase heeft een iets andere activiteit. Typisch digestie wordt in 1 uur voltooid.
8. Bij ongeveer 70-80% eierschalen worden verteerd door chitinase add CM-15 (L-15 celkweek medium bevattende 10% foetaal runderserum, 50 U / ml penicilline en 50 ug / ml streptomycine). Distantiëren cellen met behulp van een injectiespuit met een 27 gauge. Filter de celsuspensie met een 5,0 um filter aan intacte embryo's te verwijderen, massa's van cellen en larven.
9. Pellet de gedissocieerde celsuspensie door centrifugatie bij 450 xg gedurende 15 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in CM-15 celkweekmedium.
10. Plaat gedissocieerde cellen op glas dekglaasjes eerder bekleed met pinda lectine (0,1 mg / ml) opgelost in water. Opmerking: cellen moeten zich houden aan de ondergrond om te differentiëren.
11. Cellen kunnen worden gehandhaafd op kamertemperatuur (16-20 ° C) in lucht gedurende meer dan 2 weken.

Representative Results

Met onze protocollen bestuderen we de effecten van menselijke Aß ₄₂ oligomeer op neuronale functie ^8. Een fragment dat codeert voor humaan Ap ₄₂ en de kunstmatige signaalpeptide coderende sequentie of Fire vector pPD50.52 werd geamplificeerd uit construct PCL12 ⁹ met primers die een Sma 1 restrictie-endonuclease plaats aan de uiteinden ingebracht. Het fragment werd vervolgens in een construct dat een 2481-bp flp-6 promoter sequentie in de Fire vector pPD95.75 tussen de unieke Smal 1 site ^10. Met behulp van de transformatie technieken in protocol 1 beschreven we geconstrueerd een transgene worm uiten Aß ₄₂ in de ASE neuronen (FDX (ses25) stam) ^8. Om positieve transformanten markeren we de P _GCY-5 :: GFP reporter die specifiek drijft GFP expressie in de ASE rechts (ASER) neuron ^11. Wormen vasthouden aan het pad, omdat de droge agarose absorbeert hun water. Daarom is het cruciële dat de dieren op de injectie pad worden geplaatst en geïnjecteerd relatief snel, want anders zullen ze uitdrogen en sterven. Het percentage van de F1 nakomelingen die een overdraagbare extrachromosomal scala draagt ​​kan variëren. Typische waarden zijn in de 3-7% bereik. Het is belangrijk dat de injectie mix (1.1.3) bevat niet-coderende DNA-sequentie homologie delen met de transgene DNA (meestal leeg vector) omdat het DNA ondergaan homologe recombinatie met elkaar. Indien overexpressie van het transgen is een probleem van de injectie mengsel worden aangevuld met 50-100 ng / ul genomisch DNA gedigereerd met Sca 1. ASE neuronen detecteren wateroplosbare lokstoffen zoals biotine en dus hun functie kan worden beoordeeld in gedrags-assays (chemotaxis assay, protocol 2 en figuren 1A en 1B) ^12. In een typisch experiment, testten we zeven dagen oude wormen uiten P _GCY-5 :: GFP alleen (DA1262 stam) of met Aß ₄₂ (FDX (ses25)) voorchemotaxis aan biotine. Bij jonge wormen (3-4 dagen oud) de effecten van AB ₄₂ expressie zijn bescheiden maar al detecteerbaar (~ 10% afname in chemotaxis index, zie ref. ^8). Representatieve resultaten van dit experiment zijn getoond in figuren 1C en 1D. De meeste DA1262 wormen werden gevonden in of in de buurt, de lokstof spot (figuur 1C). Daarentegen slechts een paar wormen uiten Aß ₄₂ kon de lokstof spot (figuur 1D) vinden. We testten 100 dieren / genotype verdeeld in 5 proefplaatjes / genotype verkrijgen van een chemotaxis index voor biotine 0,68 ± 0,09 en 0,12 ± 0,04 voor DA1262 en FDX (ses25), respectievelijk. Actieve wormen werden afzonderlijk opgepakt en overgebracht naar het midden van de testplaat. Het is belangrijk om niet alleen snel, maar ook zacht overdracht de wormen, anders kunnen ze inactief kunnen blijven gedurende enkele minuten en niet de lokstof volgen. Aan het einde van het experiment raden wij beeldscherm wormen eenctivity door naar hun paden. Als slechts een paar nummers zijn zichtbaar we meestal gooi de plaat.

GFP-fluorescentie in de ASER neuronen van FDX (ses25) wormen verdwijnt in de eerste elf dagen van het leven (niet getoond). Dit suggereert dat deze cellen apoptose ondergaan door de aanwezigheid van _Aß42. Daarom hebben we bepaald of een breed-spectrum inhibitor van apoptose zoals caspase inhibitor N-(2-chinolyl) valyl-aspartyl-(2,6-difluorfenoxy) methyl keton (Q-VD-OPh) ¹³ kan dit tot ASER cellen stoppen . Hiervoor gebruikten we gekweekte primaire neuronen ASER uit embryo's ¹⁴ die zijn bereid zoals beschreven in protocol 3. Representatieve beelden van een ASER neuron in een jonge (4 dagen oud) FDX (ses25) worm samen een afbeelding van neuronen in kweek zijn getoond in figuren 2A-C. Gekweekte ASER cellen waren van korte duur (figuur 2D). Zoals verwacht incubatie met 0,3 ug / ml Q-VD-OPh vers dagelijks aangevuld c ompletely gestopt met het verlies van fluorescerende ASER neuronen. Bij het werken met primaire neuronen in kweek is het belangrijk om een ​​geschikt celdichtheid handhaven. Deze parameter hangt voornamelijk af van het aantal wormen gebruikt om de eieren extraheren. We meten celdichtheid met een standaard hemocytometer en zorg er vooral voor celdichtheid constant van celkweek tot celkweek te behouden. Voor farmacologische experimenten zoals die hier beschreven werkten we met ~ 200.000 cellen / cm ^2, die werd verkregen door het oogsten van vier confluente 10 cm platen. Cellen werden uitgeplaat in 12 putjes van een 24-wells plaat. Voor optimale resultaten is het ook belangrijk om de embryonale cellen vóór het zaaien dissociëren als ze de neiging om samen te klonteren. We maken gebruik van een spuit met een 27 gauge naald en adel zuig de suspensie heen en weer een paar keer. Dit is meestal voldoende om de meeste cellen (vooral in het begin raden wij de suspensie onder een microscoop controleren) dissociëren.

t "fo: keep-together.within-page =" altijd ">
Figuur 1. Chemotaxis assay. A. Vertegenwoordiger chemotaxis plaat. Lokstof (biotine) en controle plekken zijn gemarkeerd met een holle en een gevulde cirkel. B. Een chemotaxis bord geladen met een 0,5-cm diameter stukje agar gebruikt om een gradiënt van biotine vestigen. Het stukje agar werd gesneden uit een 10-cm plaat met de bovenzijde van een glas Pasteur pipet. C. Vertegenwoordiger verspreiding van wormen rond de lokstof plek. In dit voorbeeld waren de meeste DA1262 wormen kunnen de bron van lokstof (biotine). D. lokaliseren als in C FDX (ses25) wormen. Deze biotine-ongevoelige wormen vertoonden een verspreid verdeling rond de plaat en slechts weinigen werden gevonden in de buurt van de lokstof plek.

tp_upload/50435/50435fig2.jpg "/>
Figuur 2. Cultuur van C. elegans A. afbeelding Fluorescentie microscopie (foto links) en fel licht (foto rechts) embryonale cellen. genomen uit een FDX (ses25) transgene worm hoofd. B. licht beeld van een cultuur van FDX (ses25) embryonale cellen Heldere deze worm uitdrukking GFP in de ASER neuron gedreven door de GCY-5 promotor.. Schaal bar is 5 micrometer. C. Fluorescentie microscopie beeld van een beschaafde FDX (ses25) ASER neuron. Beelden werden genomen met een Olympus BX61 microscoop uitgerust met een digitale camera. D. Vertegenwoordiger experiment testen van de levensvatbaarheid van gekweekte, leeftijd-gesynchroniseerde, ASER neuronen. Cellen werden verkregen van DA1262 embryo (holle cirkels) of FDX (ses25) embryo gehandhaafd afwezigheid / aanwezigheid van 300 ng / ml Q-VD-Oph (hol en gevulde vierkanten respectievelijk). Het verdwijnen van GFP fluorescentie werd gebruikt als maat voor de levensvatbaarheid van een neuron. De exexperiment gestart met ~ 300 tl ASER neuronen. Levensvatbaarheid werd berekend als 100 * (aantal fluorescerende cellen op dag X gedeeld door het aantal fluorescerende cellen op dag 1). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

Discussion

Hier beschrijven we een gecombineerde aanpak, om cellulaire en moleculaire aspecten van amylopathies behulp C. studeren elegans. De voordelen van deze benadering zijn: 1.) Goedkope C.elegans wordt gehandhaafd normale petrischaal geënt met bacteriën, bij kamertemperatuur. 2) Krachtige genetica. Transgene dieren kunnen worden verkregen maanden en gemak promotorsequenties is om expressie van het gewenste gen in specifieke neuronen rijden. 3) Eenvoudig, goed gekarakteriseerde, zenuwstelsel. C. elegans bezit een opmerkelijk eenvoudige zenuwstelsel (302 neuronen). Deze eenvoud heeft uitgebreide karakterisering van het zenuwstelsel van de worm geboden waaronder cellijn, specifieke functie / rol van elk neuron en de synaptische verbindingen. De beperkingen van C. elegans zijn de kleine grootte van de cellen, die de toepassing van standaard biochemische technieken zoals immunohistochemie en een dikke huid (cuticula) die neu isoleert belemmertgeving vormen de externe omgeving. Daarom kan farmacologische benaderingen van beperkte werkzaamheid in C. elegans. Kweken van primaire cellen vormen een geldige strategie om dit probleem gedeeltelijk verbeteren.

De kritische stappen in deze experimentele protocollen omvatten beginnend met grote hoeveelheden wormen en het toezicht op de voorbereidingen om niet te verliezen eieren, embryo's etc. Het is ook cruciaal om te leren hoe de dieren te behandelen tijdens de injectie. Het houden van wormen in de agarose pad te lang, ponsen ze met een grote pipet of injecteren te veel DNA mix kan ze onherstelbaar beschadigen. Transformatie efficiëntie, reproduceerbaarheid en transgene expressie kan variëren. Efficiency is gerelateerd aan de zuiverheid van de injectie mix en samenstelling (aanwezigheid van niet-coderend DNA). Extrachromosomaal arrays variëren van dier tot dier Daarom is het essentieel om ten minste 2-3, onafhankelijke lijnen per transgen vastgesteld. Aan de andere kant, de toevoeging van gedigereerdegenomisch DNA aan de mix is ​​een geldige strategie ter vermindering transgene overexpressie. Chemotaxis assays zijn relatief probleemloos. Het is echter van cruciaal belang om de consistentie in de concentratiegradiënt behouden om onjuiste resultaten te voorkomen. Gebruik stukjes agar van dezelfde grootte, bijvoorbeeld knip ze met een Pasteur pipet en handhaven evenwichtstijdstip constant. Indien aanwezig, verwijderen overtollige oplossing met een wattenstaafje.

Concluderend geven we hier een voorbeeld van hoe een eenvoudige, genetisch handelbaar organisme worden benut om moleculaire aspecten van amylopathies onderzoeken. Dezelfde experimentele technieken kunnen worden toegepast op de studie van andere neuronale eiwitten en het genereren van nieuwe diermodellen van de ziekte.