Summary
Nous décrivons des méthodes pour étudier les aspects de amylopathies dans le ver
Abstract
Amylopathy est un terme qui décrit la synthèse anormale et l'accumulation de bêta-amyloïde (Aß) dans les tissus avec le temps. Aß est une caractéristique de la maladie d'Alzheimer (MA) et se trouve dans la démence à corps de Lewy, la myosite à inclusions et l'angiopathie amyloïde cérébrale 1-4. Amylopathies développer progressivement avec le temps. Pour cette raison, les organismes simples avec une durée de vie courte peuvent aider à élucider les aspects moléculaires de ces conditions. Ici, nous décrivons les protocoles expérimentaux pour étudier la neurodégénérescence Aß induite par l'utilisation des Caenorhabditis elegans du ver. Ainsi, nous construisons vers transgéniques par injection d'ADN codant pour Aß humain 42 dans les gonades syncytial des hermaphrodites adultes. Des lignées transformantes sont stabilisés par une intégration mutagenèse induite. nématodes âge synchronisée par la collecte et l'ensemencement de leurs oeufs. La fonction de neurones exprimant Aß 42 est testé dans des essais comportementaux opportuns (essai de chimiotaxies). Cultures primaires de neurones obtenus à partir d'embryons sont utilisés pour compléter les données comportementales et de tester les effets neuroprotecteurs de composés anti-apoptotiques.
Introduction
bêta-amyloïde (Aß) est un peptide de 36 à 43 acides aminés qui est formé après clivage séquentiel de la protéine précurseur de l'amyloïde (APP) par β et γ d'une secrétases. La γ-sécrétase traite l'extrémité C-terminale du peptide Aß et est responsable de ses longueurs variables 5. Les formes les plus courantes de Aß sont Aß 40 et Aß 42, ce dernier étant le plus souvent associée à des états pathologiques tels que AD 5. A des concentrations élevées Aß forme β-feuilles qui s'agrègent pour former des fibrilles amyloïdes 6. Fibrilles dépôts sont la principale composante des plaques séniles autour des neurones. Les deux plaques et diffusables, les oligomères de Aß non-plaque, sont pensés pour constituer le sous-jacent pathogènes de Aß.
Etude en laboratoire des amylopathies neuronales est compliquée par le fait que ces conditions progrès avec le temps. Par conséquent, il est important de développer animaux génétiquement traitable modèles-complémentaire à des souris-avec durée de vie courte. Ces modèles peuvent être utilisés pour élucider les aspects spécifiques de amylopathies-général cellulaire et moléculaire et en raison de leur simplicité, de les aider à capturer l'essence du problème. Le ver Caenorhabditis elegans chutes est cette catégorie. Il a une durée de vie courte, ~ 20 jours et dans les processus cellulaires de base supplémentaires, y compris la régulation de l'expression génique, le trafic des protéines, de la connectivité neuronale, synaptogenèse, la signalisation cellulaire et la mort sont similaires à des mammifères 7. Les caractéristiques uniques du ver comprennent la génétique puissants et l'absence d'un système de navire, qui permet d'étudier les lésions neuronales indépendamment des dommages vasculaires. D'autre part, l'absence d'un cerveau limite l'utilisation de C. elegans pour étudier de nombreux aspects de la neurodégénérescence. En outre, la reproduction et l'identification des distributions anatomiques des lésions ne peuvent être exécutées dans cet organisme. Autre limitetions comprennent la difficulté d'évaluer les différences dans les profils d'expression des gènes et des troubles du comportement complexe et fonction de mémoire. Nous décrivons ici les méthodes pour générer C. elegans modèles de amylopathies.
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Protocol
1. Construction des vers transgéniques
- Transformation.
- Préparer plaquettes d'injection. Déposer une goutte d'eau chaude, 2% d'agarose dissous dans l'eau, sur une lamelle de verre. Placer rapidement d'une seconde lamelle sur la goutte et tapoter sur elle. Après l'agarose est solidifié, des lamelles de diapositives à part, et cuire la lamelle-pad dans un four sous vide à 80 ° CO / N.
- Tirez pipettes. Nous utilisons une Sutter P-97 Extracteur de tirer 1/0.5 mm OD / ID borosilicate capillaires avec filament. Les pipettes sont forgés à pointe fermée qui est cassé ouvert à un stade ultérieur.
- Préparer le mélange d'injection. Faire le mélange d'injection contenant l'ADN d'intérêt (20 ng / l par construction) plus vide ADN plasmidique à une concentration finale de 150 ng / ul. Centrifuger le mélange d'injection pour éliminer tout contaminant. Cette étape est cruciale car les contaminants réduisent l'efficacité de la transformation. Transférer le top 5 pl (débris et autres contaminants s'accumulent dans le fond) dans un nouveau tube à be utilisé dans l'injection.
- Chargez mélange d'injection par capillarité. La partie inférieure de la pipette est immergée dans le mélange d'injection. Typiquement 0,5 pi sont suffisantes pour injecter 100 vers.
- Chargez pipette d'injection. Insérez la pipette sur le support du micromanipulateur et casser ouvert en frottant sa pointe contre le bord d'une lamelle montée sur une lame de verre ou encore contre les débris sur le pavé agarose. Il s'agit d'une étape cruciale que des conseils trop grand dommage que le ver et trop petits conseils sont facilement bouché. La qualité de la pointe cassée peut être jugée par la forme et surtout par le débit. Le débit peut être évaluée par la taille des bulles qui coule de l'extrémité ouverte immergé dans une goutte d'huile de 700 des halocarbures en réponse à une pression d'injection.
- Transfert vers de tampon d'injection. Déposer une goutte de 700 huile hydrocarbure, un tampon d'injection et de transférer plusieurs (1 ou 2 pour les débutants) vers à l'huile. Utilisez un ver choisir de pousser les vers le bas sur la touche jusqu'à ce que leY adhérer à l'agarose. Worms doivent être orientés en rangées avec des côtés ventrales dans la même direction. Évitez de toucher la tête de vis. Si après plusieurs tentatives les vers parviennent pas à adhérer à la garniture, le remplacer par un tampon frais ou augmenter agarose épaisseur et / ou la concentration.
- Insérer la pipette dans le ver. En déplaçant la scène, positionnez le ver sous la pipette. Positionner la pipette dans le noyau central de la gonade, car son cytoplasme est partagé par de nombreux noyaux des cellules germinales. Cela augmente la probabilité de livrer ADN injecté à de nombreux descendants. La pipette doit se trouver pratiquement parallèle à la vis sans fin (~ 15 ° -25 ° d'angle). Pousser verticalement la pointe de la pipette vers le bas du corps de la vis sans fin jusqu'à ce que la peau est enfoncée. Puis appuyez doucement sur le manipulateur pour induire l'insertion de pointe. Pour de meilleurs résultats injecter deux gonades.
- Injecter la solution d'ADN. Appliquer une pression à la pipette jusqu'à ce que la houle gonades. Arrêter l'écoulement et tirer le ver au large de la pipette. Testez l'aiguille pour le flux, puis déplacezà l'autre vis sans fin et les étapes d'injection de répétition.
- Récupérer les vers: Ajouter une goutte (~ 10 pi) de tampon de récupération sur les vers et incuber jusqu'à ce que les vers commencent la natation. Ajouter un volume égal de M9, attendre jusque vers reprendre la natation et répéter plusieurs fois jusqu'à ce que la solution est surtout M9. Transférer individuellement vers de plaques ensemencées.
- Intégration.
- Placez 40 en bonne santé, bien nourris, L4 vers dans une assiette fraîche
- Irradier avec γ-ray avec 4000 rads pour 40 min. Transfert vers irradiés (P0), en OP50 plaques ensemencées frais (4 worms / plaque). Les vers peuvent également être irradiés avec une dose de 300 J / m 2 UVs.
- Transfert 10-20 transformants F1 à partir de chaque plaque d'assiettes individuelles, étiqueter les plaques avec le P0 origine correspondant.
- Simple à 2-4 transformants F2 pour chaque F1 à plaques séparées. Vérifier la descendance F3 de transmission de 100% du marqueur de la transformation. Typiquement, 1-3% de la descendance d'une wil ver irradiéJe dois un événement d'intégration.
- Faire stocks de trois ou plusieurs lignes de transformants indépendants.
2. Tests comportementaux
- Age-synchronisation.
- Croître vers de la norme 10 cm plaques NGM + OP50 E. coli jusqu'à une grande population d'adultes gravides est atteint (3-5 jours).
- Recueillir les vers dans des tubes de 50 ml Falcon en les suspendant dans un tampon M9 1 ml.
- Ajouter 5 ml tampon M9 et centrifuger à 450 g pendant 3 min. Rejeter le surnageant. Répétez 3-4x.
- A la fin de la dernière centrifugation, éliminer le surnageant et ajouter 10 volumes de solution d'hypochlorite de base (0,5 M NaOH, 1% d'hypochlorite fraîchement mélangé) pour les vers granulés. Incuber à température ambiante pendant ~ 10 min. La réaction de lyse peut être contrôlée en plaçant une goutte de la réaction de lyse sur une lamelle couvre-objet et en examinant les vers au microscope. Lorsque environ 80% des vers sont cassé la réaction doit être arrêté.
- Arrêter la réaction de lyse par Adding le même volume de tampon d'oeufs stériles.
- Ramassez les oeufs (et des carcasses) par centrifugation à 450 g pendant 5 min.
- Lavez les œufs avec le tampon d'œuf stérile 2-3x.
- L'incubation O / N dans un tampon M9 et les graines sur des plaques NGM standard.
- Essai de chimiotaxie.
- Préparer plusieurs morceaux de gélose environ 0.5x0.5x0.5 cm. Nous déposons l'agar-agar dans une plaque de 10 cm et on coupe les morceaux de gélose à partir de là.
- Faire tremper le morceau de gélose dans une solution contenant l'attractif souhaité (à saturation, les concentrations quasi-saturation) pendant 2 heures. Attractifs typiques sont lysine (0,5 M), biotine (0,2 M).
- Déposez un morceau de gélose dans une plaque d'essai de 10 cm dans lequel l'emplacement d'un point de test et une tache de contrôle ont été marquées (figure 1A). Permettre l'équilibrage et la formation d'un gradient O / N (figure 1B). Préparer 5 plaques pour une expérience unique.
- Avant l'expérience, ajouter 10 ul de 20 mM NaN3 (anesthetic) à chaque endroit.
- Placez 20 vers l'âge synchronisées dans le centre de la plaque. Placer la plaque dans l'incubateur à 20 ° C.
- Après 1 heure, compter les animaux sur les points de test / contrôle et de calculer l'indice de chimiotactisme (CI) comme suit:
où N, N essai et N Cnt., indiquent le nombre total d'animaux, le nombre d'animaux dans les lieux d'essai et le nombre d'animaux à l'endroit de contrôle.
où N, N essai et N Cnt., indiquent le nombre total d'animaux, le nombre d'animaux dans les lieux d'essai et le nombre d'animaux à l'endroit de contrôle. 3. Primaire embryonnaire Culture cellulaire
- Lyse vers tel que décrit dans l'âge de la synchronisation.
- Arrêter la réaction de lyse en ajoutant le même volume de tampon d'œufs stériles et centrifuger à 450 g pendant 5 min. Jetez doucement surnageant en prenant soin de ne pas perdre oeufs granulés. Répétez 2 à 3 fois ou jusqu'à ce que le surnageant soit clair.
- Reprendre oeufs granulés (et des carcasses) Dans un tampon d'oeuf stérile 2 ml et ajouter 2 ml de solution stérile de 60% de saccharose dans un tampon d'oeuf. Mélanger cette solution jusqu'à ce que les œufs sont complètement remises en suspension (comme ils ont tendance à former des amas sous centrifugation) à la main ou au vortex.
- Centrifuger à 450 g pendant 15 min.
- Soigneusement transférer surnageant (contenant les oeufs) dans un tube stérile. Jeter culot qui contient les carcasses et autres sous-produits de lyse.
- Retirez le saccharose résiduel en remettant en suspension les oeufs dans un tampon d'oeuf et la centrifugation à 450 g pendant 5 min. Recueillir délicatement et jeter le surnageant. Répétez 3x.
- Sous une hotte laminaire remettre en suspension les œufs culot dans un tampon d'œuf stérile contenant 1 U / ml chitinase à température ambiante pour digérer les œufs. Après 30 min de commencer à surveiller la réaction (sous un microscope de culture cellulaire inversée). Chaque lot de chitinase a une activité un peu différente. Typiquement, la digestion est terminée en 1 heure.
- Quand environ 70-80% des œufs sont digérés par chitinase ajouter CM-15 (L-15 de culture cellulaire medium contenant 10% de sérum de veau foetal, 50 U / ml de pénicilline et 50 pg / ml de streptomycine). Dissocier les cellules à l'aide d'une seringue avec une jauge 27. Filtrer la suspension cellulaire avec un 5,0 um filtre pour éliminer les embryons intacts, des amas de cellules et de larves.
- Pellet de la suspension cellulaire dissociée par centrifugation à 450 g pendant 15 min. Retirer le surnageant et remettre le culot dans un milieu de culture cellulaire CM-15.
- cellules dissociées de plaque sur des lamelles de verre préalablement enduit avec de la lectine d'arachide (0,1 mg / ml) dissous dans l'eau. Remarque: les cellules doivent adhérer au substrat afin de se différencier.
- Les cellules peuvent être conservés à température ambiante (16-20 ° C) dans l'air pendant plus de 2 semaines.
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Representative Results
Avec nos protocoles, nous étudions les effets de l'homme Aß 42 oligomères sur la fonction neuronale 8. Un fragment codant Aß humain 42 et le signal de séquence codant pour un peptide artificiel de vecteur d'incendie pPD50.52 été amplifié à partir d'assemblage PCL12 9 en utilisant des amorces qui introduisent un site d'une endonucléase de restriction Sma aux extrémités. Le fragment a été ensuite inséré dans une construction contenant une séquence promotrice 2.481 pb FLP-6 dans le vecteur pPD95.75 feu entre le 1 unique site de Sma 10. En utilisant les techniques de transformation décrites dans le protocole 1, nous avons construit un ver transgénique exprimant Aß 42 dans les neurones de l'ASE (FDX (SES25) souche) 8. Pour marquer transformants positifs, nous avons utilisé le P gcy-5 :: GFP journaliste qui entraîne spécifiquement l'expression de la GFP dans le droit de l'ASE (ASER) neurone 11. Worms collent au tapis parce que la gélose sèche absorbe leur eau. Par conséquent, il est crucial que les animaux sont placés sur le bloc d'injection et injecter assez rapidement, parce que sinon ils vont se dessécher et mourir. Le pourcentage de la progéniture F1 qui transporte une gamme extra transmissible peut varier. Les valeurs typiques sont de l'ordre de 3-7%. Il est important que le mélange d'injection (1.1.3) contient de l'ADN non-codant partage une homologie de séquence avec l'ADN transgénique (habituellement vecteur vide) parce que les ADN subissent la recombinaison homologue avec l'autre. Toutefois, si la surexpression du transgène est un problème que le mélange d'injection doit être complété avec 50-100 ng / pl d'ADN génomique digéré par Sca 1. neurones de l'ASE détecter attractifs solubles dans l'eau tels que la biotine et donc leur fonction peuvent être évalués dans des essais comportementaux (essai de chimiotaxie, protocole 2 et les figures 1A et 1B) 12. Dans une expérience typique, nous avons testé sept jours anciens vers exprimant P gcy-5 :: GFP seule (souche DA1262) ou avec Aß 42 (FDX (SES25)) pourchimiotaxie à la biotine. Chez les jeunes vers (vieux 3-4 jours) les effets de 42 expression Aß sont modestes, mais déjà détectable (~ baisse de 10% de l'indice chimiotactisme, voir réf. 8). Les résultats représentatifs de cette expérience sont présentés sur les figures 1C et 1D. La plupart des DA1262 vers ont été trouvés dans, ou à proximité, l'endroit attractif (figure 1C). En revanche seuls quelques vers exprimant Aß 42 pourraient trouver l'endroit attractif (figure 1D). Nous avons testé 100 animaux / génotype répartis en 5 plaques d'essai / génotype obtenir un indice de chimiotactisme pour la biotine 0,68 ± 0,09 et 0,12 ± 0,04 pour DA1262 et FDX (SES25), respectivement. Vers actives ont été prélevées individuellement et transférées au centre de la plaque de test. Il est important de non seulement rapidement, mais aussi transférer doucement des vers parce que sinon ils peuvent rester inactif pendant plusieurs minutes et ne parviennent pas à suivre l'attractif. A la fin de l'expérience, nous vous suggérons moniteur vers unctivité en regardant leurs chemins. Si seules quelques pistes sont visibles on écarte généralement la plaque.
Fluorescence de la GFP dans les neurones de l'ASER (FDX SES25) vers disparaît dans les onze premiers jours de la vie (non représenté). Cela suggère que ces cellules entrent en apoptose dû à la présence de Aß 42. C'est pourquoi nous avons déterminé si un inhibiteur à large spectre de l'apoptose comme inhibiteur de caspase N-(2-quinolyl) méthyl valyl-aspartyl-(2,6-difluorophénoxy) (Q-VD-OPH) 13 pourrait arrêter la perte de cellules ASER . À cette fin, nous avons utilisé des cultures de neurones primaires ASER à partir d'embryons 14, qui ont été préparés comme décrit dans le protocole 3. Des images représentatives d'un neurone ASER à un jeune (âgé 4 jours) FDX (SES25) ver avec des images de neurones en culture sont présentés dans les figures 2A-C. Cellules ASER cultivées ont été de courte durée (figure 2D). Comme prévu incubation avec 0,3 pg / ml Q-VD-OPH fraîchement complétée jour, c ompletely arrêt de la perte de neurones ASER fluorescents. Lorsque vous travaillez avec des neurones primaires en culture, il est important de maintenir une densité cellulaire opportun. Ce paramètre dépend principalement du nombre de vers utilisés pour en extraire les oeufs. Nous mesurons la densité des cellules avec un hémocytomètre standard et prenons un soin particulier à maintenir la densité constante de cellule à partir de la culture cellulaire pour la culture cellulaire. Pour les expériences pharmacologiques tels que ceux décrits ici, nous avons travaillé avec ~ 200.000 cellules / cm 2 qui a été obtenu par la récolte de quatre plaques confluentes de 10 cm. Les cellules ont été étalées dans 12 puits d'une plaque de 24 puits. Pour des résultats optimaux, il est également important de dissocier les cellules embryonnaires avant le semis car ils ont tendance à former des amas. Nous utilisons une seringue avec une aiguille de calibre 27 et de la gentry aspirer la suspension avant en arrière plusieurs fois. Ceci est généralement suffisante pour dissocier la plupart des cellules (surtout au début, nous vous suggérons de vérifier la suspension sous un microscope).
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Figure 1. Essai de chimiotaxie. A. plaque chemotaxis représentant. Appât (biotine) et le contrôle des taches sont marqués d'un creux et d'un cercle plein. B. Une plaque chimiotaxie chargé avec une pièce d'un diamètre de 0,5 cm de l'agar utilisé pour établir un gradient de la biotine. Le morceau de gélose a été découpé dans une plaque de 10 cm en utilisant la face supérieure d'une pipette Pasteur en verre C. distribution. Représentatif de Pandore autour de l'endroit attractif. Dans cet exemple, la majorité des DA1262 vers ont été en mesure de localiser la source de l'attraction (biotine). D. Comme dans C pendant FDX (SES25) vers. Ces vers biotine insensibles présentaient une répartition dispersée autour de la plaque, et seulement quelques-uns ont été trouvés près de l'endroit attractif.
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Figure 2. Culture de C. A. Image en microscopie à fluorescence (photo de gauche) et de la lumière (photo de droite) des cellules embryonnaires elegans. proviennent d'un (SES25) tête de ver transgénique FDX. Ce ver B. image lumière vive d'une culture de FDX (SES25) cellules embryonnaires exprimant la GFP dans le neurone ASER dirigé par le promoteur gcy-5.. Barre d'échelle est de 5 um. C. Image en microscopie de fluorescence d'une FDX culture (SES25) ASER neurone. Les images ont été prises avec un Olympus BX61 microscope équipé d'un appareil photo numérique. D. expérience représentative de tester la viabilité de la culture, l'âge, les neurones synchronisés ASER. Les cellules ont été obtenues à partir d'embryons DA1262 (cercles vides) ou FDX (SES25) embryons conservés en l'absence / présence de 300 ng / ml Q-VD-Oph (carrés vides et pleins, respectivement). La disparition de la fluorescence de la GFP a été utilisé comme mesure de la viabilité d'un neurone. L'exrience a commencé avec environ 300 neurones ASER fluorescentes. La viabilité a été calculé comme 100 * (nombre de cellules fluorescentes à jour X divisé par le nombre de cellules fluorescentes à jour 1). Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
Nous décrivons ici une approche combinée, pour étudier les aspects cellulaires et moléculaires de l'aide amylopathies C. elegans. Les avantages de cette approche sont les suivants: 1.) Faible coût C. elegans est maintenu dans un plat normale Petri ensemencées avec des bactéries, à la température ambiante. 2) génétique puissants. Les animaux transgéniques peuvent être obtenus en quelques mois et un large éventail de séquences promotrices est disponible pour conduire l'expression du gène désiré dans les neurones spécifiques. 3), le système nerveux simple, bien caractérisé. C. elegans possède un système nerveux remarquablement simple (302 neurones). Cette simplicité a accordé une caractérisation du système nerveux du ver y compris lignée cellulaire, fonction / rôle spécifique de chaque neurone et ses connexions synaptiques. Les limites de C. elegans notamment de la petite taille des cellules, ce qui entrave l'application des techniques biochimiques standards tels que l'immunohistochimie et une peau épaisse (cuticule) qui isole neurons forment l'environnement extérieur. Par conséquent, les approches pharmacologiques peuvent être d'efficacité limitée dans C. elegans. cultures de cellules primaires représentent une stratégie valable pour atténuer en partie ce problème.
Les étapes essentielles de ces protocoles expérimentaux comprennent en commençant par de grandes quantités de vers et de suivi des préparatifs afin de ne pas perdre les oeufs, embryons, etc. Il est également essentiel d'apprendre à manipuler les animaux pendant l'injection. Garder vers dans le pad agarose trop longtemps, les coups de poing avec une grande pipette ou l'injection de mélange d'ADN trop peut irrémédiablement endommager. expression efficacité de la transformation, de la reproductibilité et de transgène peut varier. L'efficacité est lié à la pureté de la composition de l'injection et de sa composition (présence d'ADN non codant). Tableaux extrachromosomiques varient d'un animal à l'autre par conséquent, il est essentiel d'établir au moins 2-3 lignes indépendantes par transgène. D'autre part, l'ajout d'digéréADN génomique à la combinaison représente une stratégie valable pour réduire la sur-expression transgénique. Dosages de chimiotaxie sont relativement sans problème. Toutefois, il est crucial de maintenir la cohérence dans le gradient de concentration afin d'éviter les faux résultats. Utilisation des morceaux de gélose de même dimension, par exemple les couper avec une pipette Pasteur et maintenir le temps d'équilibre constante. Le cas échéant, retirer l'excédent de solution avec un coton-tige.
En conclusion, nous proposons ici un exemple de la façon dont un organisme simple, génétiquement traitable peut être exploitée pour étudier les aspects moléculaires de amylopathies. Les mêmes techniques expérimentales pourraient être appliquées à l'étude d'autres protéines neuronales et à la génération de nouveaux modèles animaux de la maladie.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. NGM | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 3 g |
| Bacteriological agar | AMRESCO | J637 | 17 g |
| Bacto-peptone | AMRESCO | J636 | 2.5 g |
| Distilled Water | Bring to 975 ml | ||
| Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well | |||
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 1 ml of 1 M stock |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C3045 | 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol) |
| Potassium phosphate buffer | 25 ml of 1M stock | ||
| 2. Potassium phosphate buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 108.3 g |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | 35.6 g |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 3. M9 buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 3 g |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | 6 g |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 5 g |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm) | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 118 mM |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | 48 mM |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 2 mM |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | 2 mM |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | 25 mM |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 5. CM-15 | |||
| L-15 culture medium | Gibco | 11415 | 450 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | 50 ml |
| Penicillin | Gibco | 15140 | 50 units/ml |
| Streptomycin | Gibco | 15140 | 50 g/ml |
| Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C | |||
| 6. Other Reagents | |||
| Halocarbon 700 oil | Halocarbon Products | 9002-83-9 | |
| 5 μm Acrodisc Syringe Filter | PALL Co. | 4199 | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-5UN | |
| Lectin (peanut) | Sigma-Aldrich | L0881-10MG | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S320 | |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
References
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