Summary
Descriviamo i metodi per studiare aspetti della amylopathies nel verme
Abstract
Amylopathy è un termine che descrive la sintesi e l'accumulo anomalo di beta amiloide (Ap) nei tessuti con tempo. Ap è un segno distintivo della malattia di Alzheimer (AD) e si trova nella demenza a corpi di Lewy, miosite da corpi inclusi e angiopatia amiloide cerebrale 1-4. Amylopathies progressivamente si sviluppano con il tempo. Per questo motivo gli organismi semplici con brevi durate di vita possono aiutare a chiarire gli aspetti molecolari di queste condizioni. Qui, descriviamo protocolli sperimentali per lo studio neurodegenerazione Ap-mediata utilizzando verme Caenorhabditis elegans. Così, costruiamo vermi transgenici iniettando il DNA codificante Ap umano 42 nelle gonadi sinciziale di ermafroditi adulti. Linee trasformanti sono stabilizzate da una integrazione mutagenesi indotta. Nematodi sono sincronizzati età raccogliendo e seminando loro uova. La funzione dei neuroni che esprimono Ap 42 viene testato in saggi comportamentali opportune (chemiotassi assays). Colture primarie neuronali ottenute da embrioni vengono utilizzati per integrare i dati comportamentali e per testare gli effetti neuroprotettivi di composti anti-apoptotici.
Introduction
Beta amiloide (Ap) è un peptide di 36-43 aminoacidi che si forma a seguito della scissione sequenziale della proteina precursore dell'amiloide (APP) per β e γ secretasi 1. Il γ secretasi elabora l'estremità C-terminale del peptide Ap ed è responsabile per le sue lunghezze variabili 5. Le forme più comuni di Ap sono Ap 40 Ap e 42, quest'ultimo essendo più comunemente associato a condizioni patologiche come 5 AD. Ad alte concentrazioni Ap forma β-sheets che aggregano a formare fibrille amiloidi 6. Depositi di fibrille sono il componente principale delle placche senili che circondano i neuroni. Entrambe le targhe e diffusibili, oligomeri Ap non placca, si pensa di costituire le forme patogene sottostanti Ap.
Studio di laboratorio di amylopathies neuronali è complicata dal fatto che queste condizioni progresso con il tempo. Pertanto, è important di sviluppare modelli animali geneticamente trattabili-complementari a topi-con vita breve. Questi modelli possono essere utilizzati per spiegare aspetti specifici di amylopathies-tipicamente cellulare e molecolare e in virtù della loro semplicità, aiutare a catturare l'essenza del problema. Il verme Caenorhabditis elegans cascate è questa categoria. Ha una durata di vita breve, ~ 20 giorni e in aggiunta i processi cellulari di base tra cui regolazione dell'espressione genica, traffico di proteine, connettività neuronale, sinaptogenesi, segnalazione cellulare e la morte sono simili ai mammiferi 7. Le caratteristiche uniche del worm includono la genetica potenti e la mancanza di un sistema di vasi, che permette di studiare i danni neuronali indipendentemente da danno vascolare. D'altra parte, la mancanza di un cervello limita l'uso di C. elegans per studiare molti aspetti della neurodegenerazione. Inoltre, la riproduzione e identificazione di distribuzioni anatomiche delle lesioni non possono essere eseguite in questo organismo. Altro limitezioni comprendono la difficoltà di valutare sia le differenze nei profili di espressione genica e di valore di un comportamento complesso e funzione di memoria. Qui si descrivono i metodi per generare C. elegans modelli di amylopathies.
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Protocol
1. Costruzione di Worms transgenici
- Trasformazione.
- Preparare pad iniezione. Mettere una goccia di caldo, 2% agarosio sciolto in acqua, su un vetrino di vetro. Introdurre rapidamente un secondo vetrino sulla goccia e toccare leggermente lo. Dopo l'agarosio si è solidificato, vetrini di diapositive a parte, e cuocere il coprioggetto-pad in un forno sotto vuoto a 80 ° CO / N.
- Tirare pipette. Usiamo un Sutter P-97 estrattore di tirare 1/0.5 mm OD / ID borosilicato capillari con filamento. Pipettes sono forgiati con punta chiusa che è rotto aperto in una fase successiva.
- Preparare mix di iniezione. Rendere la miscela iniettabile contenente il DNA di interesse (20 ng / pl per costrutto) più DNA plasmide vuoto ad una concentrazione finale di 150 ng / ml. Centrifugare la miscela di iniezione per rimuovere qualsiasi contaminante. Questo passaggio è fondamentale perché contaminanti riducono l'efficienza di trasformazione. Trasferire la top 5 microlitri (sporco e altri residui raccolgono sul fondo) in una nuova provetta per be usato in iniezione.
- Caricare mix iniezione per capillarità. La parte inferiore della pipetta è immerso nella miscela di iniezione. Tipicamente 0,5 ml sono sufficienti per iniettare 100 vermi.
- Caricare pipetta di iniezione. Inserire la pipetta sul supporto del micromanipolatore e romperlo aperto sfregando la punta contro il bordo di un vetrino montato su un vetrino o alternativamente contro detriti sul pad agarosio. Questo è un passo fondamentale in quanto troppo grande danno consigli del worm e troppo piccoli suggerimenti sono facilmente ostruiti. La qualità della punta rotta può essere giudicata dalla forma e soprattutto per la portata. La portata può essere valutato dalla dimensione delle bolle che scorre dalla punta aperta immersi in una goccia di olio 700 halocarbon in risposta ad una pressione di iniezione.
- Trasferire i vermi a pad iniezione. Mettere una goccia di olio di 700 halocarbon su un tappetino di iniezione e trasferire più (1 o 2 per i principianti) vermi per l'olio. Utilizzare un verme scegliere di spingere i vermi giù sul pad fino a quando ily aderire alla agarosio. Vermi devono essere orientati in righe con lati ventrali rivolte nella stessa direzione. Evitare di toccare la testa del verme. Se dopo vari tentativi i vermi non riescono ad aderire al pad, sostituire con un tampone fresco o aumentare agarosio spessore e / o la concentrazione.
- Inserire la pipetta nel verme. Spostando la fase, posizionare il verme sotto la pipetta. Posizionare la pipetta nel nucleo centrale della gonade perché il suo citoplasma è condivisa da molti nuclei delle cellule germinali. Questo aumenta la probabilità di consegnare DNA iniettato a molti progenie. La pipetta deve trovarsi quasi parallela alla vite senza fine (~ 15 ° -25 °). Spingere verticalmente la punta della pipetta lungo il corpo del verme finché la pelle è premuto. Quindi toccare delicatamente sul manipolatore di indurre l'inserimento della punta. Per ottenere i migliori risultati di iniettare due gonadi.
- Iniettare la soluzione di DNA. Applicare una pressione per la pipetta fino a quando le si gonfia gonade. Arrestare il flusso e tirare il verme al largo della pipetta. Testare l'ago per il flusso e quindi spostareal prossimo verme e gradini iniezioni ripetute.
- Recuperare i vermi: Aggiungere una goccia (~ 10 ml) di tampone di recupero sui vermi e incubare fino a quando i vermi cominciano nuoto. Aggiungere un uguale volume di M9, attendere vermi riprendere il nuoto e ripetere più volte fino a quando la soluzione è per lo più M9. Individualmente trasferire i vermi a piastre seminate.
- Integrazione.
- Mettere 40 sano, ben nutrito, L4 vermi in un piatto fresco
- Irradiate con γ-ray con 4.000 rad per 40 min. Trasferire vermi irradiati (P0) in OP50 piatti freschi, testa di serie (4 vermi / piastra). I worm possono in alternativa essere irradiati con una dose di 300 J / m 2 UV.
- Trasferire 10-20 trasformanti F1 da ciascun piatto per piatti individuali, etichettare le piastre con il corrispondente P0 origine.
- Singolo fuori 2-4 trasformanti F2 per ogni F1 per piatti separati. Controllare la progenie F3 per la trasmissione 100% del marcatore trasformazione. Tipicamente, 1-3% di progenie da un worm wil irradiatoDevo un evento di integrazione.
- Fare scorte di tre o più linee trasformanti indipendenti.
2. Saggi comportamentali
- Age-sincronizzazione.
- Crescere vermi nello standard 10 centimetri piastre NGM + OP50 E. coli fino ad una vasta popolazione di adulti gravide viene raggiunto (3-5 giorni).
- Raccogliere i vermi in 50 ml provette Falcon da loro sospensione in 1 ml di tampone M9.
- Aggiungere 5 ml di tampone M9 e centrifugare a 450 xg per 3 min. Scartare il surnatante. Ripetere 3-4x.
- Alla fine dell'ultima centrifugazione, rimuovere il surnatante e aggiungere 10 volumi di soluzione di ipoclorito di base (0,5 M NaOH, 1% ipoclorito appena miscelato) per i vermi pellet. Incubare a temperatura ambiente per circa 10 minuti. La reazione può essere monitorato lisi mettendo una goccia della reazione lisi su un vetrino ed esaminando i vermi sotto un microscopio. Quando circa il 80% dei vermi sono rotti la reazione deve essere interrotto.
- Arrestare la reazione di lisi da adding lo stesso volume di tampone sterile uovo.
- Raccogliere le uova (e carcasse) per centrifugazione a 450 xg per 5 min.
- Lavare le uova con tampone sterile uovo 2-3x.
- Incubare le uova di O / N in tampone M9 e loro su piastre NGM standard di seme.
- Saggio di chemiotassi.
- Preparare diversi pezzi di agar circa 0.5x0.5x0.5 cm. Abbiamo depositare l'agar-agar in un piatto da 10 cm e abbiamo tagliato i pezzi di agar da lì.
- Mettere a bagno il pezzo agar in una soluzione contenente l'attrattivo desiderata (a saturazione, le concentrazioni di quasi saturazione) per 2 ore. Attrattivi tipici sono lisina (0,5 M), biotina (0,2 M).
- Depositare un chunk agar in una piastra di prova 10 cm, in cui la posizione di un luogo di prova e un punto di controllo sono stati contrassegnati (Figura 1A). Raggiungere l'equilibrio e la formazione di un gradiente di O / N (Figura 1B). Preparare 5 piastre per un singolo esperimento.
- Prima dell'esperimento aggiungere 10 ml di 20 mM NaN 3 (Anesthetic) per ogni spot.
- Collocare 20 vermi età sincronizzate nel centro della piastra. Porre la piastra in incubatore a 20 ° C.
- Dopo 1 ora, contare gli animali sui punti di prova / controllo e di calcolare l'indice di chemiotassi, (CI) come segue:
dove N, N e N Cnt prova., indicano il numero totale di animali, il numero di animali nel punto di prova e il numero di animali nel punto di controllo.
dove N, N e N Cnt prova., indicano il numero totale di animali, il numero di animali nel punto di prova e il numero di animali nel punto di controllo. 3. Primaria Embryonic Cell Culture
- Lyse vermi come descritto in età-sincronizzazione.
- Arrestare la reazione di lisi aggiungendo lo stesso volume di tampone sterile uovo e centrifugare a 450 xg per 5 min. Scartare il surnatante delicatamente facendo attenzione a non perdere le uova pellet. Ripeti 2-3x o fino a quando il surnatante è chiaro.
- Risospendere pellet (uova e carcasse) In 2 ml di tampone sterile uovo e aggiungere 2 ml di soluzione sterile di 60% di saccarosio in tampone uovo. Mescolare questa soluzione fino a quando le uova sono completamente risospese (in quanto tendono a formare grumi sotto la centrifugazione) a mano o con il vortex.
- Centrifugare a 450 xg per 15 min.
- Trasferire accuratamente surnatante (contenente le uova) in una provetta sterile. Scartare pellet che contiene le carcasse e di altri sottoprodotti di lisi.
- Rimuovere saccarosio residuo risospendendo le uova in tampone uovo e centrifugazione a 450 xg per 5 min. Raccogliere delicatamente e scartare il surnatante. Ripetere 3 volte.
- Sotto una cappa laminare sospendere di nuovo le uova pellet in tampone uovo sterile contenente 1 U / ml chitinasi a RT per digerire i gusci d'uovo. Dopo 30 min iniziare a monitorare la reazione (sotto un microscopio coltura cellulare invertito). Ogni serie di chitinasi ha un'attività leggermente diversa. Tipicamente digestione è completato in 1 ora.
- Quando circa 70-80% gusci d'uovo vengono digeriti da chitinasi add CM-15 (L-15 di coltura cellulare medium contenente 10% siero fetale bovino, 50 U / ml di penicillina, e 50 ug / ml streptomicina). Dissociare le cellule usando una siringa con una calibro 27. Filtrare la sospensione cellulare con un 5,0 micron filtro per eliminare gli embrioni intatti, grumi di cellule e larve.
- Pellet la sospensione cellulare dissociato mediante centrifugazione a 450 xg per 15 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in CM-15 terreno di coltura cellulare.
- Piastra cellule dissociate sul coperchio di vetro scivola precedentemente rivestiti con arachidi lectina (0,1 mg / ml) disciolto in acqua. Nota: le cellule devono aderire al substrato al fine di differenziare.
- Cellule possono essere mantenute a TA (16-20 ° C) in aria per più di 2 settimane.
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Representative Results
Con i nostri protocolli si studiano gli effetti di Ap umano 42 oligomero sulla funzione neuronale 8. Un frammento codificante Ap umano 42 e il peptide segnale codificante sequenza artificiale di fuoco vettore pPD50.52 è stato amplificato dal costrutto PCL12 9 utilizzando primer che hanno introdotto un sito di endonucleasi di restrizione 1 Sma alle estremità. Il frammento è stato poi inserito in un costrutto contenente un FLP-6 sequenza promotrice 2.481 bp nel fuoco vettoriale pPD95.75 tra il 1 unico sito Sma 10. Usando le tecniche di trasformazione di cui al protocollo 1, abbiamo costruito un verme transgenici che esprimono Ap 42 nei neuroni ASE (FDX (SES25) ceppo) 8. Per contrassegnare trasformanti positivi che abbiamo usato la P GCY-5 :: GFP giornalista che guida specificamente espressione GFP nel giusto ASE (ASER) neurone 11. Worms attaccano al pad perché l'agarosio secca assorbe l'acqua. Pertanto è cruciale che gli animali sono posti sul blocco di iniezione e iniettati in tempi relativamente brevi, perché altrimenti si essiccare e morire. La percentuale di progenie F1 che porta una matrice extrachromosomal trasmissibile può variare. Valori tipici sono nel range 3-7%. E 'importante che la miscela di iniezione (1.1.3) contiene non-codificante di DNA sharing omologia di sequenza con il DNA transgenico (solitamente vettore vuoto) perchè i DNA subiscono ricombinazione omologa con l'altro. Tuttavia, se la sovraespressione del transgene è un problema del mix di iniezione deve essere completato con 50-100 ng / ml di DNA genomico digerito con Sca 1. Neuroni ASE rilevare l'acqua attrattivi solubili come biotina e quindi la loro funzione possono essere valutati in saggi comportamentali (test chemiotassi, protocollo 2 e Figure 1A e 1B) 12. In un tipico esperimento, abbiamo testato sette giorni vecchi worm che esprimono P GCY-5 :: sola GFP (DA1262 ceppo) o con Ap 42 (FDX (SES25)) perchemiotassi alla biotina. Nei giovani vermi (3-4 giorni di età) gli effetti di Ap espressione 42 sono modeste, ma già rilevabile (~ 10% di diminuzione dell'indice di chemiotassi, vedi rif. 8). Risultati rappresentativi di questo esperimento sono illustrati nelle figure 1C e 1D. La maggior parte dei DA1262 vermi sono stati trovati in, o nelle vicinanze, il punto attrattivo (Figura 1C). Al contrario solo pochi vermi che esprimono Ap 42 potevano trovare il punto attrattivo (Figura 1D). Abbiamo testato 100 animali / genotipo distribuite in 5 piastre di prova / genotipo ottenendo un indice di chemiotassi per biotina 0,68 ± 0,09 e 0,12 ± 0,04 per DA1262 e FDX (SES25), rispettivamente. Vermi attivi furono prelevati singolarmente e trasferiti al centro della piastra di prova. E 'importante non solo in fretta, ma anche trasferire delicatamente i vermi, perché altrimenti possono rimanere inattivi per diversi minuti e non riescono a seguire il attrattivo. Alla fine dell'esperimento si consiglia di monitor vermi unctivity, cercando in loro percorsi. Se solo poche tracce visibili di solito scartiamo la piastra.
Fluorescenza GFP nei neuroni ASER di FDX (SES25) vermi scompare entro i primi undici giorni di vita (non mostrato). Ciò suggerisce che queste cellule subiscono apoptosi dovuta alla presenza di Ap 42. Perciò abbiamo determinato se un inibitore ampio spettro di apoptosi come inibitore della caspasi N-(2-chinolil) valilico-aspartil-(2,6-difluorophenoxy) metil chetone (Q-VD-Oph) 13 potrebbe fermare la perdita di cellule Aser . A tal fine abbiamo utilizzato colture di neuroni primari Aser da embrioni 14, che sono stati preparati come descritto nel protocollo 3. Immagini rappresentative di un neurone ASER in un giovane (4 giorni di età) FDX (SES25) verme con le immagini di neuroni in coltura sono riportati nelle figure 2A-C. Cellule in coltura Aser erano di breve durata (Figura 2D). Come incubazione previsto con 0,3 mcg / ml Q-VD-OPH appena completato quotidiana, c ompletely fermato la perdita di neuroni fluorescenti Aser. Quando si lavora con neuroni primari in coltura, è importante mantenere una densità cellulare opportuna. Questo parametro dipende principalmente dal numero di vermi utilizzati per estrarre le uova. Misuriamo densità cellulare con un emocitometro normale e porre particolare attenzione a mantenere la densità costante di cella da coltura cellulare di coltura cellulare. Perché qui gli esperimenti farmacologici come quelli descritti abbiamo lavorato con ~ 200.000 cellule / cm 2, che è stata ottenuta raccogliendo quattro lastre cm confluenti 10. Le cellule sono state piastrate in 12 pozzetti di una piastra da 24 pozzetti. Per ottenere risultati ottimali, è importante anche per dissociare le cellule embrionali prima di seminare in quanto tendono a formare grumi. Noi usiamo una siringa con un ago da 27 gauge e nobiltà aspirare la sospensione avanti e indietro un paio di volte. Questo è generalmente sufficiente a dissociare la maggior parte delle cellule (soprattutto all'inizio si consiglia di verificare la sospensione al microscopio).
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Figura 1. Saggio di chemiotassi. A. Rappresentante piastra chemiotassi. Attrattivi (biotina) e di controllo posti sono contrassegnati con un cavo e un cerchio pieno. B. Un piatto chemiotassi caricato con un pezzo del diametro di 0,5 cm di agar utilizzato per stabilire un gradiente di biotina. Il pezzo di agar è stato tagliato da una piastra 10-cm usando il lato superiore di un vetro pipetta Pasteur. C. distribuzione rappresentativa di vermi intorno al punto attrattivo. In questo esempio la maggior parte dei DA1262 vermi erano in grado di localizzare la sorgente di attrattivi (biotina). D. Come in C. per FDX (SES25) vermi. Questi vermi biotina-insensitive mostrato una distribuzione sparsi per la piastra e solo pochi sono stati trovati vicino al luogo attrattivo.
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Figura 2. Cultura di C. A. immagini di microscopia a fluorescenza (foto a sinistra) e la luce (foto a destra) elegans cellule embrionali. presi da un FDX (SES25) transgenico testa verme. B. immagine luce luminosa di una cultura di FDX (SES25) cellule embrionali Questo worm esprime GFP nel neurone ASER guidato dal GCY-5 promoter.. Barra di scala è di 5 micron. C. immagine microscopia a fluorescenza di un FDX colta (SES25) ASER neurone. Le immagini sono state scattate con una Olympus BX61 microscopio equipaggiato con una fotocamera digitale. D. esperimento Rappresentante testare la fattibilità della coltura, età-sincronizzati, Aser neuroni. Le cellule sono state ottenute da embrioni DA1262 (cerchi vuoti) o FDX (SES25) embrioni mantenuto in assenza / presenza di 300 ng / ml Q-VD-Oph (quadrati vuoti e pieni, rispettivamente). La scomparsa di fluorescenza GFP è stata utilizzata come misura della redditività di un neurone. L'exesperimento è iniziato con ~ 300 fluorescenti i neuroni Aser. La vitalità è stata calcolata come 100 * (numero di cellule fluorescenti al giorno X e il numero di cellule fluorescenti al giorno 1). Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Qui si descrive un approccio combinato, per studiare gli aspetti cellulari e molecolari delle amylopathies utilizzando C. elegans. I vantaggi di questo approccio includono:. 1) basso costo C.elegans è mantenuta in normali Petri seminato con batteri, a temperatura ambiente. 2) genetica potente. Animali transgenici possono essere ottenuti in pochi mesi e alla vasta gamma di sequenze promotore è disponibile per guidare l'espressione del gene desiderato in neuroni specifici. 3), ben caratterizzato, sistema nervoso semplice. C. elegans possiede un sistema nervoso molto semplice (302 neuroni). Questa semplicità ha offerto ampia caratterizzazione del sistema nervoso del verme tra cui linea cellulare, specifica funzione / ruolo di ogni neurone e delle sue connessioni sinaptiche. Le limitazioni di C. elegans includono la piccola dimensione delle celle, che ostacola l'applicazione di tecniche biochimiche standard come l'immunoistochimica e una pelle spessa (cuticola) che isola neurons formano l'ambiente esterno. Pertanto, approcci farmacologici possono essere di limitata efficacia in C. elegans. colture di cellule primarie rappresentano una valida strategia per migliorare parzialmente questo problema.
I passaggi critici in questi protocolli sperimentali includono partire con grandi quantità di vermi e monitorare i preparativi in modo da non perdere le uova, embrioni, ecc. E 'anche fondamentale per imparare a gestire gli animali durante l'iniezione. Mantenere vermi nel pad agarosio troppo tempo, li pugni con una grande pipetta o iniettando mix di DNA troppo può danneggiare irreversibilmente loro. Espressione efficienza di trasformazione, riproducibilità e transgene può variare. Efficienza è legato alla purezza della miscela di iniezione e la sua composizione (presenza di DNA non codificante). Array extracromosomici variano da animale ad animale, pertanto è fondamentale per stabilire almeno 2-3, linee indipendenti per transgene. Per contro, l'aggiunta di digeritoDNA genomico al mix rappresenta una strategia valida per ridurre transgenici sovra-espressione. Saggi di chemiotassi sono relativamente senza problemi. Tuttavia è essenziale mantenere la coerenza nel gradiente di concentrazione per evitare falsi risultati. Utilizzare pezzi di agar della stessa dimensione-per esempio tagliare con una pipetta Pasteur e mantenere costante il tempo di equilibrazione. Se del caso, rimuovere la soluzione in eccesso con un batuffolo di cotone.
In conclusione, qui forniamo un esempio di come un semplice organismo, geneticamente trattabili può essere sfruttata per studiare gli aspetti molecolari di amylopathies. Le stesse tecniche sperimentali potrebbero essere applicati allo studio di altre proteine neuronali e alla generazione di nuovi modelli animali della malattia.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. NGM | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 3 g |
| Bacteriological agar | AMRESCO | J637 | 17 g |
| Bacto-peptone | AMRESCO | J636 | 2.5 g |
| Distilled Water | Bring to 975 ml | ||
| Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well | |||
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 1 ml of 1 M stock |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C3045 | 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol) |
| Potassium phosphate buffer | 25 ml of 1M stock | ||
| 2. Potassium phosphate buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 108.3 g |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | 35.6 g |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 3. M9 buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 3 g |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | 6 g |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 5 g |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm) | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 118 mM |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | 48 mM |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 2 mM |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | 2 mM |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | 25 mM |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 5. CM-15 | |||
| L-15 culture medium | Gibco | 11415 | 450 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | 50 ml |
| Penicillin | Gibco | 15140 | 50 units/ml |
| Streptomycin | Gibco | 15140 | 50 g/ml |
| Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C | |||
| 6. Other Reagents | |||
| Halocarbon 700 oil | Halocarbon Products | 9002-83-9 | |
| 5 μm Acrodisc Syringe Filter | PALL Co. | 4199 | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-5UN | |
| Lectin (peanut) | Sigma-Aldrich | L0881-10MG | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S320 | |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
References
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