Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En Published: May 17, 2013 doi: 10.3791/50435
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Robert Wood Johnson Medical School, University of Medicine and Dentistry of New Jersey

Summary

Vi beskriver metoder for å studere aspekter av amylopathies i ormen

Abstract

Amylopathy er et begrep som beskriver unormal syntese og akkumulering av amyloid beta (Aβ) i vev med tiden. Aβ er et kjennetegn på Alzheimers sykdom (AD) og finnes i Lewy legeme demens, inkludering kropp myositt og cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies gradvis utvikle seg med tiden. Av denne grunn enkle organismer med korte livsløp kan bidra til å belyse molekylære aspekter av disse forholdene. Her beskriver vi eksperimentelle protokoller for å studere Aβ-mediert neurodegeneration hjelp ormen Caenorhabditis elegans. Dermed konstruerer vi transgene ormer ved å injisere DNA koder for human Aβ 42 inn i syncytial gonader av voksne hermafroditter. Transformant linjer er stabilisert av en mutagenese-indusert integrering. Nematoder er alder synkronisert ved å samle og såing sine egg. Funksjonen av nevroner uttrykker Aβ 42 er testet i beleilige atferds-analyser (kjemotaksis analysene). Primære nevrale kulturer hentet fra embryoer blir brukt til å utfylle atferdsmessige data og for å teste de nervecellene effekter av anti-apoptotiske forbindelser.

Introduction

Amyloid beta (Aβ) er et peptid med 36-43 aminosyrer som er dannet etter sekvensiell spalting av amyloid forløper protein (APP) med β og γ secretases en. Den γ sekretaselignende behandler den C-terminale ende av peptidet Aβ og er ansvarlig for dets variable lengder 5. De vanligste formene for Aβ er Aβ 40 og Aβ 42, sistnevnte blir oftere assosiert til patologiske tilstander som AD fem. Ved høye konsentrasjoner Aβ danner β-ark som samlet for å danne amyloid fibriller seks. Fibriller innskudd er den viktigste komponenten i senile plakk rundt nerveceller. Begge plaketter og diffusible, ikke-plakk Aβ oligomers, antas å utgjøre de underliggende sykdomsfremkallende former for Aβ.

Laboratory studie av neuronal amylopathies er komplisert ved det faktum at disse forholdene fremgang med tiden. Derfor er det important å utvikle genetisk medgjørlig dyremodeller-komplementær til mus-med kort levetid. Disse modellene kan brukes til å belyse spesifikke aspekter ved amylopathies-typisk cellulært og molekylært-og i kraft av sin enkelhet, bidra til å fange essensen av problemet. Ormen Caenorhabditis elegans fall er denne kategorien. Den har en kort levetid, ~ 20 dager og i tillegg grunnleggende cellulære prosesser, inkludert regulering av genekspresjon, protein trafficking, neuronal tilkobling, synaptogenesis, celle signalisering og død er lik pattedyr 7. Unike trekk ved orm omfatter kraftige genetikk og mangel på et fartøy system, som gjør det mulig å studere neuronal skade uavhengig av vaskulær skade. På den annen side begrenser mangelen på et hjerne bruk av C. elegans til å studere mange sider av neurodegeneration. I tillegg kan den reproduksjon og identifisering av anatomiske fordelinger av lesjonene ikke utføres i denne organisme. Andre rettningslinjersjoner inkluderer problemer med å vurdere både forskjeller i genekspresjonsprofiler og nedskrivning av kompleks atferd og minnefunksjon. Her beskriver vi metoder for å generere C. elegans modeller av amylopathies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Bygging av transgene Worms

  1. Transformasjon.
    1. Forbered injeksjon pads. Plasser en dråpe varm, 2% agarose oppløst i vann, på en glass dekkglass. Raskt plassere en andre dekkglass på slipp og lett trykk på det. Etter at agarosen er størknet, slide dekkglass fra hverandre, og bake dekkglass-matte i en vakuumovn ved 80 ° CO / N.
    2. Trekk pipetter. Vi bruker en Sutter P-97 avtrekker for å trekke 1/0.5 mm OD / ID borosilikat kapillærer med glødetråd. Pipetter er smidd med lukket tips som er brutt åpen på et senere tidspunkt.
    3. Forbered injeksjon mix. Sett injeksjonen blanding inneholdende DNA av interesse (20 ng / mL per konstruktet) pluss tomme plasmid-DNA til en endelig konsentrasjon på 150 ng / mL. Sentrifuger injeksjon blandingen for å fjerne eventuell forurensning. Dette trinnet er viktig fordi forurensninger redusere transformasjon effektivitet. Overfør topp 5 pl (rusk og annen forurensning legger seg på bunnen) til et nytt rør til be brukes i injeksjon.
    4. Laste injeksjon blanding av kapillaritet. Bunnen av pipetten er nedsenket i injeksjon mix. Typisk 0,5 mL er tilstrekkelig til å injisere 100 ormer.
    5. Laste injeksjon pipette. Sett pipetten på innehaveren av micromanipulator og bryte den åpen ved å gni tuppen mot kanten av et dekkglass montert på et glass lysbilde eller alternativt mot rusk på agarose pad. Dette er et viktig skritt som for stor tips skade ormen og altfor små tips er lett tilstoppet. Kvaliteten på den ødelagte spissen kan bli dømt av formen og viktigst av flow rate. Strømningshastigheten kan vurderes ved størrelsen av boblene som strømmer fra den åpne spiss neddykket i en dråpe av halogenkarbon 700 olje som reaksjon på et injeksjonstrykk.
    6. Overføre ormer til injeksjon pad. Plasser en dråpe 700 halogenkarbon olje på en injeksjon puten og overføre flere (1 eller 2 for nybegynnere) ormer til oljen. Bruk en orm plukke å presse ormer ned på puten føry holder seg til agarose. Worms bør være orientert i rader med ventral sidene mot samme retning. Unngå å ta ormen hode. Hvis du etter flere forsøk ormene ikke klarer å forholde seg til puten, erstatte med en ny pute eller øke agarose tykkelse og / eller konsentrasjon.
    7. Sett pipetten inn i ormen. Ved å flytte scenen, plasserer ormen under pipette. Plasser pipetten i den sentrale kjernen av gonade fordi cytoplasma deles av mange bakterie cellekjerner. Dette øker sannsynligheten for å levere injiserte DNA til mange avkom. Pipetten bør ligge nesten parallelt med ormen (~ 15 ° -25 ° vinkel). Skyv vertikalt pipettetuppen ned ormen legeme til huden er trykket ned. Deretter banke forsiktig på manipulator å indusere tips er innsetting. For best resultat injisere begge gonader.
    8. Injisere DNA løsning. Press mot pipetten inntil gonade svulmer. Stoppe flyten og trekk ormen av pipette. Test nålen for flyt og deretter flyttetil neste orm og gjenta injeksjon trinn.
    9. Gjenopprette ormer: Tilsett en dråpe (~ 10 mL) for utvinning buffer på ormer og ruge til ormene begynner svømming. Legg et likt volum av M9, vente til ormer gjenoppta svømming og gjentas flere ganger inntil oppløsningen er for det meste M9. Individuelt overføre ormer til seeded plater.
  2. Integrering.
    1. Plasser 40 friske, velfødde, L4 ormer i en fersk plate
    2. Strålebehandling med γ-ray med 4000 rads for 40 min. Overfør bestrålte ormer (P0) i friske, OP50 seeded plater (4 ormer / plate). Ormer kan alternativt være bestrålt med en dose på 300 J / m 2 UVs.
    3. Overfør 10-20 F1 transformants fra hver plate til individuelle plater, merke platene med tilsvarende P0 opprinnelse.
    4. Single ut 2-4 F2 transformants for hver F1 til separate plater. Kontroller F3 avkom for 100% overføring av transformasjonen markør. Vanligvis 1-3% av avkom fra en bestrålt orm wilJeg har en integrasjon hendelse.
    5. Gjør bestander av tre eller flere uavhengige transformant linjer.

2. Behavioral Analyser

  1. Age-synkronisering.
    1. Vokse ormer i standard 10 cm NGM plater + OP50 E. coli inntil en stor bestand av drektige voksne er nådd (3-5 dager).
    2. Samle ormene i 50 ml Falcon-rør ved å suspendere dem i 1 ml M9 buffer.
    3. Tilsett 5 ml M9 buffer og sentrifuger ved 450 x g i 3 min. Kast supernatanten. Gjenta 3-4x.
    4. På slutten av den siste sentrifugeringen, fjern supernatanten og tilsett 10 volumer grunnleggende hypokloritt-oppløsning (0,5 M NaOH, 1% hypokloritt ferskt blandet) til de pelleterte ormer. Inkuber ved RT i ~ 10 min. Den lysis Reaksjonen kan overvåkes ved å plassere en dråpe av lysis reaksjon på et dekkglass og undersøkt ormer under et mikroskop. Når omtrent 80% av ormene brytes reaksjonen skal stoppes.
    5. Stopp lysis reaksjon etter adding det samme volum sterilt egg-buffer.
    6. Samle egg (and skrottene) ved sentrifugering ved 450 xg i 5 min.
    7. Vask eggene med sterilt egg buffer 2-3x.
    8. Ruge eggene O / N i M9 buffer og frø dem på standard NGM plater.
  2. Kjemotaksis analysen.
    1. Forbered flere biter av agar omtrent 0.5x0.5x0.5 cm. Vi deponere agar i en 10-cm plate og vi kutte agar biter derfra.
    2. Bløt agar blings i en løsning inneholdende den ønskede lokkemiddel (ved mette, nær-mette konsentrasjoner) i 2 timer. Typiske tiltrekningsmidler er lysin (0,5 M), biotin (0,2 M).
    3. Deponere et agar klump i et 10 cm Testplaten hvor plasseringen av en test flekk og en kontroll flekk er markert (figur 1A). Tillat ekvilibrering og dannelse av en gradient O / N (figur 1B). Forbered fem plater for et enkelt eksperiment.
    4. Før eksperimentet tilsettes 10 pl av 20 mM NaN 3 (Anesthetic) til hver spot.
    5. Plasser 20 age-synkronisert ormer i midten av platen. Sett platen i inkubatoren ved 20 ° C.
    6. Etter en time, telle dyrene på test / kontroll flekker og beregne kjemotaksis indeksen, (CI) som følger: Ligning 1 hvor N, N test og N Cnt., indikerer det totale antall dyr, antall dyr i testområdet og antall dyr i kontroll-sted.

3. Primær embryonale celler Kultur

  1. Lyse ormer som beskrevet i alder-synkronisering.
  2. Stopp av lysis reaksjonen ved å tilsette det samme volumet av egg steril buffer og sentrifuger ved 450 xg i 5 min. Forsiktig kast supernatanten være nøye med å ikke miste pelleted egg. Gjenta 2-3x eller inntil supernatanten er klart.
  3. Gjensuspender pelleted egg (og skrotter) I 2 ml sterilt egg buffer og tilsett 2 ml steril 60% sukrose i egg-buffer. Bland denne oppløsningen inntil eggene er fullstendig resuspendert (da de har en tendens til å danne klumper i henhold sentrifugering) for hånd eller ved omrøring.
  4. Sentrifuger ved 450 xg i 15 min.
  5. Nøye overføre supernatanten (som inneholder egg) til et sterilt rør. Forkaste pellet som inneholder skrotter og andre biprodukter av lysis.
  6. Fjern gjenværende sukrose ved å oppslemme de egg i egg-buffer og sentrifugering ved 450 x g i 5 min. Forsiktig samle inn og kast supernatanten. Gjenta 3x.
  7. Under en laminær hette resuspender pellets egg i sterile egg buffer som inneholder en U / ml chitinase ved RT å fordøye eggeskall. Etter 30 minutter begynner å overvåke reaksjonen (under et invertert mikroskop cellekultur). Hver batch av chitinase har en litt annen aktivitet. Vanligvis fordøyelsen er ferdig i en time.
  8. Når omtrent 70-80% eggeskall blir fordøyd av chitinase add CM-15 (L-15 cellekultur medium inneholdende 10% føtalt bovint serum, 50 U / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin). Distansere celler ved hjelp av en sprøyte med en 27 gauge. Filtrering av cellesuspensjonen med en 5,0 um filter for å fjerne intakte embryoer, klumper av celler og larver.
  9. Pellet den dissosierte cellesuspensjon ved sentrifugering ved 450 xg i 15 min. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i CM-15 cellekulturmedium.
  10. Plate dissosiert celler på glass dekkglass tidligere belagt med peanut lektin (0,1 mg / ml) oppløst i vann. Merk: celler må forholde seg til underlaget for å differensiere.
  11. Celler kan opprettholdes ved RT (16-20 ° C) i luft i mer enn 2 uker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med våre protokoller studerer vi effekter av menneskelig Aβ 42 oligomeren på nervecellefunksjon åtte. Et fragment koding menneskelig Aβ 42 og den kunstige signal peptid kodende sekvens av Brann vektor pPD50.52 ble forsterket fra konstruksjon PCL12 ni bruke primere som introduserte en Sma en restriksjonsendonuklease nettsted på endene. Fragmentet ble deretter satt inn i en konstruksjon som inneholder et 2481-bp FLP-6 promotersekvens i pPD95.75 Brann vektoren mellom det unike Sma 1 stedet 10.. Bruke transformasjon teknikker beskrevet i protokollen en vi bygget en transgen orm uttrykke Aβ 42 i ASE nevroner (FDX (ses25) stamme) 8. For å markere positive transformants vi brukte P gcy-5 :: GFP reporter som spesifikt driver GFP uttrykk i ASE høyre (ASER) nervecellen 11. Worms holde seg til puten fordi den tørre agarose absorberer vannet deres. Derfor er det crusielle at dyrene blir plassert på puten, og injeksjon injisert forholdsvis raskt, fordi ellers vil de desiccate og dø. Prosentandelen av F1 avkom som bærer en overførbar ekstrakromosomalt matrise kan variere. Typiske verdier er i området 3-7%. Det er viktig at injeksjon blanding (1.1.3), inneholder ikke-kodende DNA-sekvens som deler homologi med det transgene DNA (vanligvis tomme vektor) fordi de DNA'er gjennomgå homolog rekombinasjon med hverandre. Men hvis overekspresjon av transgenet er et problem injeksjonen blanding bør suppleres med 50-100 ng / mL av genom-DNA digerert med SCA 1.. ASE nevroner oppdage vannløselige attractants som biotin og dermed deres funksjon kan vurderes i atferdsmessige analyser (kjemotaksis analysen, 2 protokoll og figur 1A og 1B) 12. I et typisk eksperiment, testet vi syv dager gamle ormer uttrykker P gcy-5 :: GFP alene (DA1262 stamme) eller med Aβ 42 (FDX (ses25)) forkjemotaksis til biotin. Hos unge ormer (3-4 dager gammel) effekter av Aβ 42 uttrykk er beskjeden, men allerede påvisbar (~ 10% reduksjon i kjemotaksis indeks, se ref.. 8). Representative resultater av dette forsøk er vist i figurene 1C og 1D. De fleste DA1262 ormer ble funnet i, eller i nærheten, den tiltrekkende spot (figur 1C). Derimot bare noen få ormer uttrykker Aβ 42 kunne finne tiltrekkende sted (figur 1D). Vi testet 100 dyr / genotype fordelt på 5 test plater / genotype skaffe en kjemotaksis indeks for biotin 0.68 ± 0.09 og 0.12 ± 0.04 for DA1262 og FDX (ses25), henholdsvis. Aktive ormer ble individuelt plukket og overført til sentrum av testplaten. Det er viktig å ikke bare raskt, men også forsiktig overføre ormer fordi de ellers kan være inaktiv i flere minutter og ikke klarer å spore tiltrekkende. På slutten av forsøket foreslår vi monitor ormer enctivity ved å se på deres veier. Hvis bare noen få spor er synlige vi vanligvis kast platen.

GFP fluorescens i de ASER nevroner av FDX (ses25) ormer forsvinner i løpet av de første elleve dagene i livet (ikke vist). Dette antyder at disse cellene gjennomgå apoptose på grunn av tilstedeværelsen av Aβ 42.. Derfor bestemmes hvorvidt et bredspektret inhibitor av apoptose slik som kaspase-inhibitor N-(2-kinolyl)-valyl-aspartyl-(2,6-difluorfenoksy)-metylketon (Q-VD-OPH) 13 kunne stoppe tapet av ASER cellene . For å oppnå dette brukte vi dyrkede primære ASER nerveceller fra embryoer 14, som ble utarbeidet som beskrevet i protokoll 3. Representative bilder av en ASER nervecelle i en ung (4 dager gammel) FDX (ses25) orm sammen med bilder av nevroner i kultur er vist i figur 2A-C. Dyrkede Aser cellene var kortvarig (figur 2D). Som forventet inkubasjon med 0,3 mikrogram / ml Q-VD-Oph fersk daglig tilskudd, c ompletely stanset tapet av fluorescerende Aser nerveceller. Når man arbeider med primære neuroner i kultur er det viktig å opprettholde et beleilig celletetthet. Denne parameteren avhenger i hovedsak av hvor mange ormer som brukes til å hente ut eggene. Man måler celletetthet med en standard hemocytometer og tar særlig hensyn til å opprettholde konstant celletetthet fra cellekultur til cellekultur. For farmakologiske forsøk slik som de som er beskrevet her har vi arbeidet med ~ 200 000 celler / cm 2 som ble oppnådd ved å høste fire konfluent 10 cm plater. Celler ble platet ut i 12 brønner i en 24-brønns plate. For optimalt resultat er det også viktig å distansere de embryonale celler før såing som de pleier å danne klumper. Vi bruker en sprøyte med en 27 gauge nål og kondisjonerte suge suspensjon frem og tilbake et par ganger. Dette er vanligvis tilstrekkelig til å dissosiere de fleste av de celler (spesielt i begynnelsen foreslår vi å kontrollere suspensjonen under mikroskop).

t "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 1
Figur 1. Kjemotaksis analysen. A. Representant kjemotaksis plate. Tiltrekningsmiddel (biotin) og kontroll prikker er markert med en hul og utfylt sirkel. B. En kjemotaksis plate lastet med et 0,5 cm diameter stykke agar brukt til å etablere en gradient av biotin. Stykket av agar ble kuttet fra en 10-cm plate ved hjelp av den øvre side av en glass Pasteur-pipette. C. Representative fordeling av ormer rundt lokkemidlet flekk. I dette eksemplet er de fleste DA1262 ormer var i stand til å lokalisere kilden for tiltrekningsmidlet (biotin). D. Som i C i FDX (ses25) ormer. Disse biotin-insensitive ormer utstilt en spredt fordeling rundt plate og bare noen ble funnet i nærheten av tiltrekkende sted.

tp_upload/50435/50435fig2.jpg "/>
Figur 2. Culture of C. elegans embryonale celler. A. Fluorescensmikroskopi bilde (venstre bilde) og lys (høyre bilde) tatt fra en FDX (ses25) transgen ormen hode. Denne ormen uttrykker GFP i ASER nervecellen drevet av gcy-5 promoter. B. Bright lys bilde av en kultur av FDX (ses25) embryonale celler. Scale bar er 5 mikrometer. C. Fluorescensmikroskopi bilde av en kultivert FDX (ses25) ASER nervecellen. Bildene ble tatt med et Olympus BX61 mikroskop utstyrt med et digitalt kamera. D. Representant eksperiment teste levedyktighet av kulturperler, alder-synkronisert, Aser nerveceller. Celler ble oppnådd fra DA1262 embryoer (hule sirkler) eller FDX (ses25) embryoer opprettholdt i fravær / nærvær av 300 ng / ml Q-VD-Oph (hul og fylte kvadrater, henholdsvis). Forsvinningen av GFP fluorescens ble brukt som et mål på en nervecelle levedyktighet. ExForsøket startet med ~ 300 fluorescerende Aser nerveceller. Levedyktighet ble beregnet som 100 * (antall fluorescerende celler på dag X delt på antall fluorescerende celler på dag 1). Klikk her for å se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en kombinert tilnærming, for å studere cellulære og molekylære aspekter av amylopathies hjelp C. elegans. Fordelene ved denne metode er: 1). Lav kostnad C.elegans opprettholdes i normal petriskål podet med bakterier, ved romtemperatur. 2) Kraftige genetikk. Transgene dyr kan bli oppnådd i få måneder, og et bredt utvalg av promotor-sekvenser er tilgjengelig for å drive ekspresjon av det ønskede gen i bestemte nerveceller. 3) Enkle, godt karakterisert, nervesystemet. C. elegans besitter en usedvanlig enkel nervesystemet (302 nevroner). Denne enkelheten har gitt omfattende karakterisering av ormen nervesystemet inkludert celle avstamning, spesifikk funksjon / rolle hver nervecelle og dens synaptiske forbindelser. Begrensningene i C. elegans omfatter den lille størrelsen av cellene, som hindrer anvendelse av standard biokjemiske teknikker som immunhistokjemi og en tykk hud (hårstråene) som isolerer neurons danne det ytre miljø. Derfor kan farmakologisk behandling være av begrenset effekt i C. elegans. Kulturer av primære celler representerer en gyldig strategi for å delvis bøte dette problemet.

De kritiske trinnene i disse eksperimentelle protokoller inkluderer starter med store mengder ormer og overvåke forberedelsene for å ikke miste egg, embryo etc. Det er også viktig å lære å håndtere dyrene under injeksjon. Holde ormer i agarose pad for lenge, punching dem med en stor pipette eller injisere for mye DNA mix kan ubotelig skade dem. Transformasjon effektivitet, reproduserbarhet og transgene uttrykk kan variere. Effektivitet er relatert til renheten av injeksjonen blanding og dets sammensetning (tilstedeværelse av ikke-kodende DNA). Ekstrakromosomalt arrays variere fra dyr til dyr derfor er det viktig å etablere minst 2-3, uavhengige linjer pr transgenet. På den annen side, tilsetning av fordøydgenomisk DNA til blandingen representerer en gyldig strategi for å redusere transgen overekspresjon. Kjemotaksis analysene er relativt problemfri. Men det er viktig å opprettholde konsistens i konsentrasjonsgradienten for å unngå falske resultater. Bruk stykker av agar med samme størrelse, for eksempel skjære dem med en Pasteur-pipette-og opprettholde likevektsbufferen tidskonstant. Om noen, fjerne overflødig løsning med en bomullspinne.

I konklusjonen, her har vi et eksempel på hvordan en enkel, genetisk medgjørlig organisme kan utnyttes til å undersøke molekylære aspekter av amylopathies. De samme eksperimentelle teknikker kan brukes til å studere andre neuronale proteiner og til generering av nye dyremodeller av sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. NGM
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 3 g
Bacteriological agar AMRESCO J637 17 g
Bacto-peptone AMRESCO J636 2.5 g
Distilled Water Bring to 975 ml
Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 1 ml of 1 M stock
Cholesterol Sigma-Aldrich C3045 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)
Potassium phosphate buffer 25 ml of 1M stock
2. Potassium phosphate buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 108.3 g
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 35.6 g
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
3. M9 buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 3 g
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S5136 6 g
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 5 g
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 118 mM
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 48 mM
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 2 mM
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M4880 2 mM
HEPES Fisher Scientific BP310 25 mM
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
5. CM-15
L-15 culture medium Gibco 11415 450 ml
Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028 50 ml
Penicillin Gibco 15140 50 units/ml
Streptomycin Gibco 15140 50 g/ml
Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C
6. Other Reagents
Halocarbon 700 oil Halocarbon Products 9002-83-9
5 μm Acrodisc Syringe Filter PALL Co. 4199
Chitinase Sigma-Aldrich C6137-5UN
Lectin (peanut) Sigma-Aldrich L0881-10MG
Sodium hydroxide Fisher Scientific S320
Lysine Sigma-Aldrich L5501
Biotin Sigma-Aldrich B4639
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sucrose Sigma-Aldrich S0389

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
  2. Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer's disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).
  3. Greenberg, S. A. Inclusion body myositis: review of recent literature. Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).
  4. Revesz, T., et al. Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies. Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).
  5. Hartmann, T., et al. Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).
  6. Ohnishi, S., Takano, K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).
  7. C. elegans II. Cold Spring Harbor Monograph. DL, R. iddle, et al. 1, M. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1222 (1997).
  8. Cotella, D., et al. Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).
  9. Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).
  10. Cai, S. Q., Sesti, F. Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging. Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).
  11. Yu, S., et al. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).
  12. Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).
  13. Caserta, T. M., et al. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).
  14. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).

Tags

Nevrovitenskap Medicine nevrobiologi cellebiologi molekylær biologi genetikk Developmental Biology Cell Fysiologiske Phenomena nevrovitenskap beta-amyloid, Apoptose amylopathy amyloid beta Alzheimers sykdom AD nevroner cellekultur transgene orm dyremodell
En<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modell System for Amylopathy Study
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duan, Z., Sesti, F. A… More

Duan, Z., Sesti, F. A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study. J. Vis. Exp. (75), e50435, doi:10.3791/50435 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter