Summary
Мы опишем методы для изучения аспектов amylopathies в червя
Abstract
Amylopathy это термин, который характеризует ненормальное синтез и накопление бета-амилоида (Ар) в тканях со временем. Ар является отличительной чертой болезни Альцгеймера (БА) и находится в деменцию с тельцами Леви, миозит включения тела и церебральной амилоидной ангиопатии 1-4. Amylopathies постепенно развиваются с течением времени. По этой причине простые организмы с короткой продолжительностью жизни может помочь выяснить молекулярные аспекты этих условий. Здесь мы описываем экспериментальных протоколов для изучения Ар-опосредованной нейродегенерацию помощью червя Caenorhabditis Элеганс. Таким образом, мы построим трансгенных червей путем инъекции ДНК, кодирующей человеческий Ар 42 в синцитиальный гонад взрослых гермафродитов. Трансформированных линий стабилизируются индуцированного мутагенеза интеграции. Нематоды возраста синхронизированы путем сбора и посева их яйца. Функции нейронов выражения Ар 42 испытывается в подходящее поведенческого анализа (хемотаксисас). Первичных нейронов культур, полученных из эмбрионов, которые используются для дополнения и поведенческие данные для проверки нейропротекторное действие антиапоптотических соединений.
Introduction
Амилоида бета (Ар) представляет собой пептид из 36-43 аминокислот, которая образуется после последовательного расщепления белка-предшественника амилоида (APP) по β и γ секретазы 1. Γ секретазы обрабатывает C-конца пептида и отвечает за его переменной длины 5. Наиболее распространенными формами являются Ар Ар Ар 40 и 42, причем последний чаще ассоциируется к патологическим состояниям, таким как рекламы 5. При высоких концентрациях Ар форме β-листов для агрегации с образованием амилоидных фибрилл 6. Фибриллы депозиты являются основным компонентом старческих бляшек окружающих нейронов. Оба бляшек и диффузии, не доска олигомеров Ар, как полагают, являются основными формами патогенных Ар.
Лаборатория исследования нейронной amylopathies осложняется тем фактом, что эти условия прогресса с течением времени. Поэтому важнымиT развиваться генетически послушный животных моделях, комплементарные к мышам-с коротким сроком службы. Эти модели могут быть использованы для выяснения конкретных аспектов обычно amylopathies-клеточном и молекулярном и в силу своей простоты, помогают уловить суть проблемы. Червь Caenorhabditis Элеганс водопада эту категорию. Он имеет короткий срок службы, ~ 20 дней, а в дополнение основных клеточных процессах, включая регуляцию экспрессии генов, белков торговли, нейронные связи, синаптогенезе, клеточной сигнализации и смерти подобны млекопитающих 7. Уникальные особенности червя включают в себя мощные генетика и отсутствие сосудистой системы, которая дает возможность изучить повреждения нейронов независимо от сосудистых повреждений. С другой стороны, отсутствие мозга ограничивает применение С. Элеганс к изучению многих аспектов нейродегенерацию. Кроме того, воспроизведение и идентификации анатомических распределения повреждений не может быть выполнена в этом организме. Другой пределобъема отнести сложность для оценки как различия в профили экспрессии генов и обесценения сложное поведение и функции памяти. Здесь мы опишем методы генерирования C. Элеганс моделей amylopathies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Строительство трансгенные черви
- Трансформации.
- Приготовления инъекции колодки. Поместите каплю горячей, 2% агарозном растворяется в воде, на покровное стекло. Быстро разместить второй покровное на каплю и слегка коснитесь его. После того, как агароза затвердеет, покровные слайд друг от друга, и выпекать покровное площадкой в вакуумной печи при 80 ° CO / N.
- Потяните пипеток. Мы используем Саттер Р-97 Съемник тянуть 1/0.5 мм OD / ID боросиликатного капилляров с нитью. Пипетки кованые с закрытыми наконечник, который взломан на более позднем этапе.
- Приготовления инъекции смеси. Сделать инъекции смеси, содержащей интерес ДНК (20 нг / мкл в конструкции) плюс пустой плазмидой ДНК в конечной концентрации 150 нг / мкл. Центрифуга инъекции смеси для удаления любых загрязнений. Этот шаг имеет решающее значение, потому что загрязнители уменьшить эффективность трансформации. Передача Топ 5 мкл (мусора и других загрязнений собираются в нижней части) в чистую пробирку биспользуется в электронной инъекции.
- Загрузите инъекции смеси капиллярным. В нижней части пипетки погружен в инъекции смеси. Обычно 0,5 мкл достаточно, чтобы придать 100 червей.
- Загрузите инъекционной пипетки. Вставьте пипетки на держателе микроманипулятора и разорвать его открытым, потерев его кончик к краю покровного стекла установлены на стекло или же от космического мусора на площадку агарозы. Это очень важный шаг, поскольку слишком велики повреждения Советы червя и слишком маленькие чаевые легко засориться. Качество сломанный наконечник можно судить по форме и самое главное по расходу. Скорость потока может быть оценена по размеру пузырьки, вытекающих из открытый конец погружен в капли масла хладон 700 в ответ на давление нагнетания.
- Передача червей инъекции площадку. Поместить каплю 700 Галокарбоновое масло на инъекции площадку и передать несколько (1 или 2 для начинающих) червей к маслу. Используйте червя выбрать не подтолкнуть червей вниз на площадку, покау придерживаться агарозы. Черви должны быть ориентированы в ряд с вентральной сторон смотрят в одном направлении. Старайтесь не прикасаться голова червя. Если после нескольких попыток черви не соблюдают колодки, замените ее свежей площадку или увеличить толщину агарозы и / или концентрации.
- Вставьте пипетки в червя. При движении ступени, позиционировать червя под пипеткой. Поместите пипетку в центральном ядре гонад, потому что его цитоплазма разделяется многими ядер половых клеток. Это увеличивает вероятность того, чтобы доставить вводили ДНК многим потомства. Пипетки должны лежать почти параллельно червя (~ 15 ° -25 °). Нажмите вертикально кончик пипетки вниз тело червя, пока кожа не нажата. Затем осторожно нажмите на манипуляторе, чтобы вызвать вставку наконечника. Для достижения наилучших результатов как инъекционные половых желез.
- Введите раствора ДНК. Надавите на пипетку до гонаду набухает. Остановить поток и вытащить червя от пипетки. Проверьте иглу для потока, а затем перейтик следующему червя и повторите шаги инъекции.
- Восстановление черви: Добавить каплю (~ 10 мкл) буфера восстановления на червей и инкубировать, пока черви не начнут плавать. Добавить равный объем M9, подождите, пока черви не возобновить плавание и повторить несколько раз, пока раствор не в основном M9. Индивидуально передать червей семенами пластин.
- Интеграции.
- Налейте 40 здоровых, сытых, L4 червей в свежем пластины
- Облучают γ-лучей с 4000 рад в течение 40 мин. Передача облученных червей (P0) в свежем, OP50 пластин семенами (4 червей / пластина). Черви альтернативно может быть облучен дозой 300 Дж / м 2 координат.
- Трансфер F1 10-20 трансформантах из каждой чашки на отдельные пластины, маркировать пластин с соответствующей P0 происхождения.
- Выделить 2-4 F2 трансформантах для каждого F1 для отдельных пластин. Проверьте F3 потомства на 100% передачи преобразование маркера. Как правило, 1-3% потомства от облученных Виль червяУ меня интеграции события.
- Сделать запасы из трех или более независимых линий трансформантом.
2. Поведенческие Анализы
- Возраст-синхронизации.
- Расти червей в стандартных 10 см NGM пластин OP50 + E. палочки до большой популяции беременных взрослых достигается (3-5 дней).
- Соберите червей в 50 мл труб Сокол, приостановив их в 1 мл буфера M9.
- Добавить 5 мл M9 буфера и центрифуге при 450 мкг в течение 3 мин. Удалите супернатант. Повторите 3-4х.
- В конце последнего центрифугирования, удаления супернатанта и добавляют 10 объемов основной раствор гипохлорита (0,5 М NaOH, 1% гипохлорита свежеприготовленный) к гранулированным червей. Инкубируют при комнатной температуре в течение ~ 10 мин. Лизис Реакцию можно контролировать путем размещения капли реакции лизиса на покровное и изучение червей под микроскопом. Когда около 80% червей разбиты реакция должна быть остановлена.
- Остановить реакцию лизиса надстройкаг того же объема стерильного буфера яйца.
- Собирают яйца (и туши) центрифугированием при 450 х г в течение 5 мин.
- Мойте яйца с стерильном буфере яйцо 2-3х.
- Выдержите яйца O / N в M9 буфера и семя их на стандартные пластины NGM.
- Хемотаксиса.
- Подготовьте несколько частей агар 0.5x0.5x0.5 см примерно. Мы кладем на депозит агар, в 10-см пластины и режем кусками агар оттуда.
- Замачивание кусок агара в раствор, содержащий желаемую аттрактант (при насыщающих, почти насыщающей концентрации) в течение 2 часов. Типичные аттрактанты лизин (0,5 М), биотин (0,2 М).
- Депозит агар кусок в 10 см испытательной пластины, в которых расположение тест месте и контроль местная были отмечены (рис. 1А). Разрешить уравновешивания и формирование градиента O / N (фиг.1В). Подготовить 5 тарелок для одного эксперимента.
- До эксперимента добавить 10 мкл 20 мМ NaN 3 (Anesthetic) в каждом месте.
- Поместите 20 возрастных синхронизированы червей в центре пластины. Место пластины в инкубатор при 20 ° С.
- Через 1 ч рассчитывать животных на тест / контроль пятна и расчета индекса хемотаксиса, (CI) следующим образом:
где N, N испытаний и N Центр., указывают на общее количество животных, количество животных в тесте месте и количество животных в контрольной точке.
где N, N испытаний и N Центр., указывают на общее количество животных, количество животных в тесте месте и количество животных в контрольной точке. 3. Первичных эмбриональных клеточных культур
- Lyse червей, как описано в возрастной синхронизации.
- Стоп лизис реакцию добавлением такого же объема стерильного буфера яйцо и центрифугируют при 450 х г в течение 5 мин. Аккуратно отбросить супернатант соблюдая осторожность, чтобы не потерять гранулированные яиц. Повторите 2-3х или пока супернатант не ясно.
- Ресуспендируйте гранулированные яйца (и туши) В 2 мл стерильного буфера яйцо и добавить 2 мл стерильного 60% сахарозы в яйце буфера. Смешайте это решение, пока яйца не будут полностью ресуспендировали (поскольку они имеют тенденцию к образованию комков при центрифугировании) вручную или при помощи вортекса.
- Центрифуга при 450 мкг в течение 15 мин.
- Тщательно передачи надосадочной жидкости (содержащей яиц) в стерильную пробирку. Отменить гранул, которая содержит туши и другие побочные продукты лизиса.
- Удалить остаточной сахарозы путем ресуспендирования яйца в яйцо буфере и центрифугируют при 450 х г в течение 5 мин. Аккуратно собираем и отбросить супернатант. Повторить 3 раза.
- Под капотом ламинарного ресуспендируйте гранулированные яйца в яйца стерильном буфере, содержащем 1 Ед / мл хитиназе при комнатной температуре, чтобы переварить яичную скорлупу. Через 30 мин начинают осуществлять мониторинг реакции (под инвертированным микроскопом культуры клеток). Каждая партия хитиназе имеет несколько иную деятельность. Обычно пищеварения завершен в 1 час.
- Когда примерно 70-80% яичной скорлупы усваиваются хитиназе Добавить CM-15 (L-15 клеточной культуре Medбария, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 50 ед / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина). Диссоциируют клетки, используя шприц с калибра 27. Фильтр клеточной суспензии с 5,0 мкм фильтр для удаления нетронутыми эмбрионов, группы клеток и личинок.
- Гранул диссоциированной клеточной суспензии центрифугированием при 450 х г в течение 15 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в CM-15 клеточной культуральной среды.
- Пластина диссоциированных клеток на стеклянные покровные стекла, предварительно покрытые арахисовое лектинов (0,1 мг / мл), растворенных в воде. Примечание: клетки должны придерживаться подложки, чтобы отличать.
- Клетки могут быть выдерживают при комнатной температуре (16-20 ° C) на воздухе в течение более 2 недель.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С нашим протоколам, которые мы изучаем последствия человеческой Ар 42 олигомеров на функцию нейронов 8. Фрагмент, кодирующий человеческий Ар 42 и искусственные кодирующую последовательность сигнального пептида из своих вектор pPD50.52 амплифицировали из конструкции PCL12 9 с использованием праймеров, которые введены Sma один сайт эндонуклеазы рестрикции на концах. Затем фрагмент вставляется в конструкцию, содержащую 2481 п.н. FLP-6 последовательность промотора в pPD95.75 своих вектор между уникальными один сайт Sma 10. С помощью преобразования методов, описанных в протоколе 1 мы построили трансгенных червей выражения Ар 42 в АСЭ нейронов (FDX (ses25) деформации) 8. Чтобы отметить положительную трансформантах мы использовали репортер ПОКМ P-5 :: GFP, который специфически диски GFP выражение в правой ASE (ASER) нейронов 11. Черви придерживаться площадку, потому что сухой агарозы поглощает их водой. Поэтому CRUсоциального, что животные находятся на инжекторный площадку и вводят относительно быстро, потому что в противном случае они пересушивают и умирают. Процент потомства F1, который несет передаваемых внехромосомными массив может изменяться. Типичные значения находятся в диапазоне 3-7%. Важно, что введение смеси (1.1.3) содержит не-кодирующей ДНК обмена гомологии последовательности с трансгенной ДНК (обычно пустой вектор), потому что ДНК подвергаться гомологичной рекомбинации друг с другом. Однако, если избыточная экспрессия трансгена проблема инъекции смеси должна быть дополнена 50-100 нг / мкл геномной ДНК расщепляли с помощью Sca +1. ASE нейронов обнаружить водорастворимые аттрактанты, такие как биотин и, следовательно, их функции могут быть оценены в поведенческий анализ (хемотаксиса, схемы 2 и фиг.1А и 1В) 12. В типичном эксперименте мы тестировали семь дневных червей выражения P ПОКМ-5 :: GFP один (DA1262 штамм) или с Ар 42 (FDX (ses25)) прихемотаксис биотина. В молодые черви (3-4 дневных) влияние Ар 42 выражение скромные, но уже обнаруживается (~ 10% снижение индекса хемотаксиса, см. ссылку. 8). Представитель Результаты этого эксперимента показаны на фиг 1C и 1D. Большинство DA1262 черви были найдены в или рядом, аттрактантом пятна (рис. 1в). В отличие от этого только несколько червей выражения Ар 42 мог найти аттрактантом месте (рис. 1D). Мы протестировали 100 животных / генотип распространяется в 5 тестовых пластин / генотип получения индекса хемотаксиса для биотин 0,68 ± 0,09 и 0,12 ± 0,04 для DA1262 и FDX (ses25) соответственно. Активный червей определена индивидуально и передаются в центре испытательной пластине. Важно не только быстро, но и аккуратно передать червей, потому что в противном случае они могут оставаться неактивными в течение нескольких минут и не отслеживать аттрактанта. В конце эксперимента мы предлагаем монитор червиctivity, глядя на их пути. Если еще несколько треков видны мы обычно отказаться от пластины.
GFP флуоресценции в ASER нейронов FDX (ses25) червей исчезает в течение первых одиннадцати дней жизни (не показано). Это говорит о том, что эти клетки претерпевают апоптоз в связи с наличием Ар 42. Поэтому определить, является ли широкого спектра действия ингибитора апоптоза, таких как ингибитор каспазы N-(2-хинолил)-валил-аспартил-(2,6-дифторфенокси) метил кетон (Q-VD-OPh) 13 может остановить потерю ASER клетки . Для этого используют культивированный первичных нейронов ASER из эмбрионов 14, которые были получены, как описано в протоколе 3. Представитель изображения нейрона ASER в молодом (4 дневных) FDX (ses25) червя вместе с изображениями в культуре нейронов показаны на рисунках 2а-с. Искусственный клетки ASER были недолговечны (Рис. 2d). Как и ожидалось инкубации с 0,3 мкг / мл Q-VD-OPh недавно дополнена ежедневно, C ompletely остановили потерю нейронов ASER флуоресцентные. При работе с первичных нейронов в культуре важно поддерживать благоприятный плотности клеток. Этот параметр зависит главным образом от количества червей используется для извлечения яиц. Мы измеряем плотность клеток со стандартным гемоцитометром и уделять особое внимание для поддержания постоянной плотности клеток из культуры клеток в культуре клеток. Для фармакологических экспериментов, таких как описанные здесь мы работали с ~ 200000 клеток / см 2, который был получен путем сбора четыре сливной 10 см пластинах. Клетки высевали в 12 лунки 24-луночного планшета. Для получения оптимальных результатов важно также отделить эмбриональных клеток перед посевом, поскольку они имеют тенденцию к образованию сгустков. Мы используем шприц с иглой 27 и дворянства аспирации подвески туда и обратно несколько раз. Это как правило, достаточно отделить большинство клеток (особенно в начале, мы предлагаем, чтобы проверить подвески под микроскопом).
Т "FO: держать-together.within-страницы =" всегда ">
Рисунок 1. Хемотаксиса. А. Представитель хемотаксисе пластины. Аттрактант (биотин), а также контроль пятна обозначены полым и заполненный круг. B. пластина хемотаксис загружен 0,5 см в диаметре кусок агара используется для установления градиента биотина. Кусок агара была снижена с 10-см диск с помощью верхней стороне стеклянной пипетки Пастера. С. Характерное распределение червей вокруг аттрактант месте. В этом примере большинство DA1262 черви смогли локализовать источник аттрактанта (биотин). D. Как и в С в течение FDX (ses25) червей. Эти биотин-нечувствительной червей выставлены разбросаны распределения вокруг плиты, и лишь немногие были найдены около аттрактантом месте.
tp_upload/50435/50435fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Культура C. Элеганс эмбриональных клеток. А. люминесцентной микроскопии изображение (рисунок слева) и яркий свет (правая картинка), взятые из FDX (ses25) трансгенных голова червя. Этот червь выражает GFP в нейроне ASER обусловлен ПОКМ-5 промоутера. B. Яркое изображение свете культуры FDX (ses25) эмбриональных клеток. Шкала бар составляет 5 мкм. C. люминесцентной микроскопии образ культурной FDX (ses25) ASER нейрона. Снимки были сделаны с Olympus BX61 микроскоп с цифровой камерой. D. Представитель эксперимента тестирования жизнеспособности культурным, возрастным синхронизированы, нейроны ASER. Клетки были получены из DA1262 эмбрионов (светлые кружки) или FDX (ses25) эмбрионов поддерживается в отсутствие / наличие 300 нг / мл Q-VD-Oph (полые и закрашенными квадратами, соответственно). Исчезновение GFP флуоресценции была использована как мера жизнеспособности нейронов. ЭксЭксперимент начался с ~ 300 флуоресцентных ASER нейронов. Жизнеспособность в пересчете на 100 * (количество флуоресцирующих клеток в день х, деленное на количество флуоресцирующих клеток в 1-й день). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем комбинированный подход, изучать клеточные и молекулярные аспекты amylopathies использованием C. Элеганс. Преимущества этого подхода включают: 1.) Низкая стоимость C.elegans поддерживается в нормальном чашку Петри засевают бактерии, при комнатной температуре. 2) Мощный генетики. Трансгенные животные могут быть получены в несколько месяцев, и широкий спектр последовательности промотора доступно для управления экспрессией нужного гена в определенных нейронах. 3) простые, хорошо характеризуется, нервной системы. C. Элеганс обладает удивительно простой нервной системы (302 нейронов). Эта простота предоставил обширную характеристику нервной системы червя в том числе клеточной линии, определенной функции / роли каждого нейрона и его синаптических связей. Ограничения С. Элеганс включать в себя небольшой размер ячеек, что затрудняет применение стандартных биохимических методов, таких как иммуногистохимии и толстым (эпидермис), который изолирует нейтроновадроны образуют внешнюю среду. Таким образом, фармакологические подходы могут иметь ограниченную эффективность в C. Элеганс. культур первичных клеток представляет допустимую стратегию частично улучшить эту проблему.
Критические шаги в этих экспериментальных протоколов включают начиная с большого количества червей и мониторинга подготовку для того, чтобы не потерять яйца, эмбрионы и т.д.. Очень важно также, чтобы узнать, как обращаться с животными во время инъекции. Хранение червей в агарозном площадку слишком долго, пробивая их с большой пипетки или инъекционных слишком много ДНК смесь может необратимо повредить их. Трансформация эффективности, воспроизводимости и экспрессию трансгенов может изменяться. Эффективность связана с чистотой инъекции смеси и ее состав (наличие некодирующей ДНК). Внехромосомными массивы отличаются от животного к животному, поэтому крайне важно, чтобы создать по крайней мере 2-3, в независимых линий трансгенных. С другой стороны, добавление перевариваетсягеномной ДНК в смесь представляет собой допустимое стратегия сокращения трансгенных сверхэкспрессию. Хемотаксиса относительно бесперебойной. Однако очень важно сохранять последовательность в градиенту концентрации для того, чтобы избежать ложных результатов. Использование частей агар того же размера, например отрезать их с помощью пастеровской пипетки и поддерживать равновесие постоянной времени. Если таковые имеются, удалите излишки раствора с помощью ватного тампона.
В заключении, здесь мы приведем пример того, как простое, генетически послушный организм может быть использован для исследования молекулярных аспектов amylopathies. То же экспериментальные методы могут быть применены к изучению других нейронов белки и к генерации новых животных моделей болезни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. NGM | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 3 g |
| Bacteriological agar | AMRESCO | J637 | 17 g |
| Bacto-peptone | AMRESCO | J636 | 2.5 g |
| Distilled Water | Bring to 975 ml | ||
| Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well | |||
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 1 ml of 1 M stock |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C3045 | 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol) |
| Potassium phosphate buffer | 25 ml of 1M stock | ||
| 2. Potassium phosphate buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 108.3 g |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | 35.6 g |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 3. M9 buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 3 g |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | 6 g |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 5 g |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm) | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 118 mM |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | 48 mM |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 2 mM |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | 2 mM |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | 25 mM |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 5. CM-15 | |||
| L-15 culture medium | Gibco | 11415 | 450 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | 50 ml |
| Penicillin | Gibco | 15140 | 50 units/ml |
| Streptomycin | Gibco | 15140 | 50 g/ml |
| Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C | |||
| 6. Other Reagents | |||
| Halocarbon 700 oil | Halocarbon Products | 9002-83-9 | |
| 5 μm Acrodisc Syringe Filter | PALL Co. | 4199 | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-5UN | |
| Lectin (peanut) | Sigma-Aldrich | L0881-10MG | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S320 | |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
References
- Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
- Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer's disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).
- Greenberg, S. A. Inclusion body myositis: review of recent literature. Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).
- Revesz, T., et al. Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies. Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).
- Hartmann, T., et al. Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).
- Ohnishi, S., Takano, K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).
- C. elegans II. Cold Spring Harbor Monograph. DL, R. iddle, et al. 1, M. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1222 (1997).
- Cotella, D., et al. Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).
- Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).
- Cai, S. Q., Sesti, F. Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging. Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).
- Yu, S., et al. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).
- Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).
- Caserta, T. M., et al. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).
