Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

A Published: May 17, 2013 doi: 10.3791/50435
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Robert Wood Johnson Medical School, University of Medicine and Dentistry of New Jersey

Summary

Vi beskriver metoder til at studere aspekter af amylopathies i ormen

Abstract

Amylopathy er et begreb, der beskriver unormal syntese og akkumulering af amyloid beta (Ap) i væv med tiden. Ap er kendetegnende for Alzheimers sygdom (AD) og findes i Lewy body demens, inklusion krop myositis og cerebral amyloidangiopati 1-4. Amylopathies gradvist udvikle sig med tiden. Af denne grund simple organismer med kort levetid kan bidrage til at belyse molekylære aspekter af disse betingelser. Her beskriver vi forsøgsprotokoller at studere Ap-medieret neurodegeneration ved hjælp af ormen Caenorhabditis elegans. Således har vi konstruere transgene orme ved at indsprøjte DNA kodende human Ap 42 ind i de syncytial gonaderne af voksne hermafroditter. Transformant linjer stabiliseres ved en mutagenese-induceret integration. Nematoder er alder synkroniseres ved at indsamle og såning deres æg. Funktionen af neuroner udtrykker Ap 42 testes i opportunt adfærdsmæssige assays (kemotaxi-assayr). Primære neuronale kulturer opnået fra embryoner anvendes som et supplement adfærdsmæssige data og teste de neurobeskyttende virkninger af anti-apoptotiske forbindelser.

Introduction

Amyloid p (Ap) er et peptid på 36-43 aminosyrer, der dannes efter sekventiel spaltning af amyloidprecursorprotein (APP) ved β og γ sekretaser 1.. Den γ sekretase behandler den C-terminale ende af Ap-peptidet og er ansvarlig for dens variable længder 5. De mest almindelige former for Ap er Ap 40 og Ap 42, idet sidstnævnte mere almindeligt i forbindelse med patologiske tilstande, såsom AD 5. Ved høje koncentrationer Ap danner β-sheets, som aggregerer at danne amyloid fibriller 6.. Fibriller indskud er den vigtigste bestanddel af senile plaques omkringliggende neuroner. Både plaques og diffunderbare, ikke-plak Ap oligomerer, menes at udgøre de underliggende patogene former for Ap.

Laboratorieundersøgelse af neuronale amylopathies kompliceres af den kendsgerning, at disse betingelser fremskridt med tiden. Derfor er det important til at udvikle genetisk medgørlig dyremodeller-supplement til mus-med kort levetid. Disse modeller kan anvendes til at belyse specifikke aspekter af amylopathies-typisk cellulær og molekylær-og i kraft af deres enkelhed, hjælper til at fange essensen af ​​problemet. Ormen Caenorhabditis elegans falls er denne kategori. Den har en kort levetid, ~ 20 dage og derudover grundlæggende cellulære processer, herunder regulering af genekspression, protein menneskehandel, neuronal tilslutningsmuligheder, synaptogenesis, cellesignalering og død ligner pattedyr 7.. Unikke funktioner i ormen omfatter kraftige genetik og mangel på et fartøj system, som gør det muligt at studere nerveskader uafhængigt af vaskulær skade. På den anden side begrænser manglen på en hjerne brugen af C. elegans til at studere mange aspekter af neurodegeneration. Derudover kan reproduktion og identifikation af anatomiske fordelinger af læsioner ikke udføres i denne organisme. Anden begrænsningtioner omfatter det er vanskeligt at vurdere både forskelle i genekspression profiler og nedskrivninger af komplekse adfærd og memory funktion. Her beskriver vi metoder til at generere C. elegans modeller amylopathies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Konstruktion af transgene Worms

  1. Transformation.
    1. Forbered injektion pads. Placer en dråbe af varm, 2% agarose opløst i vand, på et dækglas. Hurtigt placere en anden dækglas på drop og let tryk på det. Efter agarose størknet, dias dækglas fra hinanden, og bage dækglasset-pad i en vakuumovn ved 80 ° CO / N.
    2. Træk pipetter. Vi bruger en Sutter P-97 aftrækker til at trække 1/0.5 mm OD / ID borosilicate kapillærer med glødetråd. Pipetter er smedet med lukket spids, som er brudt åbne på et senere tidspunkt.
    3. Forbered injektion mix. Gøre injektionen blanding indeholdende DNA'et af interesse (20 ng / ul pr konstrukt) eks. tomme plasmid-DNA til en endelig koncentration på 150 ng / ul. Centrifugeres injektion blandingen for at fjerne ethvert forurenende. Dette trin er afgørende, fordi forureninger reducere transformationseffektivitet. Overfør top 5 pi (snavs osv. indsamler i bunden) til et frisk rør til be anvendes i injektion.
    4. Load injektion mix af kapillære kræfter. Bunden af ​​pipetten er nedsænket i injektion mix. Typisk 0,5 pi er tilstrækkelige til at injicere 100 orme.
    5. Load injektion pipette. Sæt pipetten på indehaveren af ​​mikromanipulator og bryde det åbne ved at gnide spidsen mod kanten af ​​en dækglas monteret på en glasplade eller alternativt mod snavs på agarose pad. Dette er et afgørende skridt, da for store tips skader ormen og alt for små tips er let tilstoppet. Kvaliteten af ​​den brudte spids kan bedømmes af formen og vigtigst af strømningshastigheden. Flowet kan vurderes ved størrelsen af ​​boblerne flyder fra det åbne spids nedsænket i en dråbe halogencarbon 700 olie i respons på et indsprøjtningstryk.
    6. Overførsel orme til injektion pad. Placer en dråbe 700 halogencarbon olie på en indsprøjtning pad og overføre flere (1 eller 2 for begyndere) orme til olien. Brug en orm pick at skubbe orme ned på puden, indtily overholde agarose. Worms bør være orienteret i rækker med ventrale sider vender i samme retning. Undgå at røre ormen hoved. Hvis der efter flere forsøg ormene undlader at overholde den pad, udskift med en frisk pude eller øge agarose tykkelse og / eller koncentration.
    7. Sæt pipetten ind i ormen. Ved at flytte scenen, placere ormen under pipette. Placer pipetten i den centrale kerne af gonade fordi dens cytoplasma deles af mange kim cellekerner. Dette øger sandsynligheden for at levere injiceret DNA til mange afkom. Pipetten skal ligge næsten parallelt ormen (~ 15 ° -25 ° hældning). Skub lodret spidsen af ​​pipetten ned ormen krop indtil huden er deprimeret. Derefter forsigtigt tryk på manipulator at fremkalde tip s indsættelse. For de bedste resultater injicere begge kønskirtlerne.
    8. Injicer DNA løsning. Lægge pres på pipetten indtil gonade dønninger. Stoppe strømmen og træk ormen fra pipette. Test nålen for flow og derefter flyttetil næste ormen og gentag injektion trin.
    9. Recover ormene: Tilføj en dråbe (~ 10 ul) for inddrivelse buffer på orme og inkuberes indtil orme begynder svømning. Tilføj en tilsvarende mængde M9, vente, indtil orme genoptage svømning og gentag flere gange, indtil opløsningen er for det meste M9. Individuelt overføre orme seeded plader.
  2. Integration.
    1. Placer 40 sunde, velnærede, L4 orme ind i en frisk plade
    2. Bestråle med γ-ray med 4.000 rad for 40 min. Overfør bestrålede orme (P0) i friske, OP50 seedede plader (4 orme / plade). Orme kan alternativt bestråles med en dosis på 300 J / m 2 UVs.
    3. Overfør 10-20 F1 transformanter fra hver plade til individuelle plader, mærke pladerne med det tilsvarende P0 oprindelse.
    4. Single out 2-4 F2 transformanter for hver F1 til separate plader. Kontroller F3 afkom for 100% transmission af transformationen markør. Typisk 1-3% af afkom fra en bestrålet orm WilJeg har en integration begivenhed.
    5. Lagre af tre eller flere uafhængige transformante linjer.

2.. Adfærdsmæssige Analyser

  1. Age-synkronisering.
    1. Grow orme i standard 10 cm NGM plader + OP50 E. coli, indtil en stor bestand af drægtige voksne er nået (3-5 dage).
    2. Saml orme i 50 ml Falcon rør ved at suspendere dem i 1 ml M9 buffer.
    3. Tilsæt 5 ml M9-puffer og centrifugeres ved 450 xg i 3 min. Supernatanten kasseres. Gentag 3-4x.
    4. Ved afslutningen af ​​den sidste centrifugering, supernatanten fjernes, og der tilsættes 10 volumener basisk hypochloritopløsning (0,5 M NaOH, 1% hypochlorit friskblandet) til de pelleterede orme. Inkuber ved RT i ~ 10 min. Lysis Reaktionen kan overvåges ved at placere en dråbe af lysis reaktion på et dækglas og undersøge ormene under et mikroskop. Når omkring 80% af orme er brudt reaktionen bør stoppes.
    5. Stop lysis reaktionen ved adding den samme mængde sterilt æg buffer.
    6. Indsamle æg (og slagtekroppe) ved centrifugering ved 450 xg i 5 min.
    7. Vask æggene med sterilt æg buffer 2-3x.
    8. Inkuber æg O / N i M9 buffer og frø dem på standard NGM plader.
  2. Kemotaxi-assay.
    1. Forbered flere stykker agar ca 0.5x0.5x0.5 cm. Vi deponere agar i en 10 cm plade og vi skære agar bidder derfra.
    2. Soak agar bid i en opløsning indeholdende den ønskede lokkemiddel (ved mættende, nær-mættende koncentrationer) i 2 timer. Typiske lokkemidler er lysin (0,5 M), biotin (0,2 M).
    3. Deponere et agar bid i en 10 cm test plade, hvor placeringen af et test-spot og en kontrolpletten er blevet markeret (figur 1A). Tillad ækvilibrering og dannelse af en gradient O / N (figur 1B). Forbered 5 plader til et enkelt eksperiment.
    4. Forud eksperimentet tilsættes 10 ul 20 mM NaN3 (anesthetic) til hver plet.
    5. Placer 20 alder synkroniserede orme i midten af ​​pladen. Pladen anbringes i inkubatoren ved 20 ° C.
    6. Efter 1 time, tælle dyrene på test / kontrol spots og beregne kemotaksien indeks (CI) som følger: Ligning 1 hvor N, N test og N Cnt., angive det samlede antal dyr, antallet af dyr i testen stedet og antallet af dyr i kontrolgruppen stedet.

3.. Primære embryonale Cellekultur

  1. Lyse orme som beskrevet i alder-synkronisering.
  2. Stop lysis reaktionen ved tilsætning af samme mængde sterilt æg buffer og centrifugeres ved 450 xg i 5 min. Forsigtigt kassere supernatanten være omhyggelig med at ikke miste pelleterede æg. Gentag 2-3x eller indtil supernatanten er klar.
  3. Resuspendere pelleterede æg (og kroppe) I 2 ml steril æg puffer og der tilsættes 2 ml steril 60% saccharose i æg buffer. Bland denne løsning, indtil æggene er helt resuspenderet (da de har tendens til at danne klumper under centrifugering) i hånden eller ved vortex.
  4. Centrifuger ved 450 xg i 15 min.
  5. Forsigtigt overføre supernatanten (indeholdende æg) til et sterilt rør. Kassér pellet, som indeholder slagtekroppe og andre biprodukter af lysis.
  6. Fjern restsakkarose ved resuspendering æggene i æg-puffer og centrifugering ved 450 xg i 5 minutter. Forsigtigt indsamle og supernatanten. Gentag 3x.
  7. Under en laminar hætte resuspenderes pelleterede æg i steril æg buffer indeholdende 1 U / ml chitinase ved RT at fordøje de æggeskaller. Efter 30 minutter begynder at overvåge reaktionen (under et inverteret cellekultur mikroskop). Hvert parti chitinase har en lidt anden aktivitet. Typisk fordøjelse er afsluttet i 1 time.
  8. Når ca 70-80% æggeskaller fordøjes af chitinase add CM-15 (L-15 cellekultur withium indeholdende 10% føtalt bovint serum, 50 U / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin). Opdel celler ved hjælp af en sprøjte med en 27 gauge. Filter cellesuspensionen med en 5,0 um filter til at fjerne intakte fostre, klumper af celler og larver.
  9. Pellet den dissocierede cellesuspension ved centrifugering ved 450 xg i 15 min. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i CM-15 cellekulturmedium.
  10. Plate dissocierede celler på dækglas tidligere belagt med peanut lektin (0,1 mg / ml) opløst i vand Note:. Celler skal overholde underlaget for at differentiere.
  11. Celler kan opretholdes ved stuetemperatur (16-20 ° C) i luft i mere end 2 uger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med vores protokoller vi studerer virkningerne af human Ap 42 oligomer på neuronal funktion 8.. Et fragment koder for human Ap 42 og den kunstige signalpeptidkodende sekvens af Fire vektor pPD50.52 blev amplificeret fra konstrukt PCL12 9 anvendelse af primere, som indførte en Smal 1 restriktionsendonukleasested ved enderne. Fragmentet blev derefter indsat i en konstruktion indeholdende en 2.481 bp FLP-6 promotorsekvens i pPD95.75 Fire vektor mellem det unikke Sma 1-stedet 10. Brug af transformation teknikker beskrevet i protokol 1. konstruerede vi en transgen orm udtrykker Ap 42 i ASE neuroner (FDX (ses25) stamme) 8. For at markere positive transformanter vi brugt P GCY-5 :: GFP reporter, der specifikt driver GFP udtryk i ASE højre (ASER) neuron 11.. Worms holde sig til puden, fordi den tørre agarose absorberer deres vand. Derfor er det crusielle, at dyrene placeres på injektionen pad og injiceres relativt hurtigt, for ellers vil de tørre ud og dø. Procentdelen af ​​F1-afkom, der bærer en overførbar ekstrakromosomalt matrix kan variere. Typiske værdier er i 3-7% interval. Det er vigtigt, at injektionen mix (1.1.3) indeholder ikke-kodende DNA-deling sekvenshomologi med den transgene DNA (normalt tom vektor) fordi DNA'erne gennemgå homolog rekombination med hinanden. Men hvis overekspression af transgenet er et problem injektionen mix bør suppleres med 50-100 ng / gl af genomisk DNA fordøjet med Sca 1. ASE neuroner registrerer vandopløselige lokkemidler såsom biotin og dermed deres funktion kan vurderes i adfærdsmæssige assays (chemotaxis assay, protokol 2 og figur 1A og 1B) 12. I et typisk eksperiment, testede vi syv dage gamle orme udtrykker P GCY-5 :: GFP alene (DA1262 stamme) eller med Ap 42 (FDX (ses25)) forkemotaksi til biotin. Hos unge orme (3-4 dage gamle) virkningerne af Ap 42 udtryk er beskedne, men allerede påviselig (~ 10% fald i chemotaxis indeks se ref. 8). Repræsentative resultater af dette eksperiment er vist i figur 1C og 1D. De fleste DA1262 orme blev fundet i eller i nærheden, lokkemidler plet (figur 1C). Derimod kun et par orme udtrykker Ap 42 kunne finde lokkemidler plet (figur 1D). Vi testede 100 dyr / genotype fordelt på 5 prøveplader / genotype opnåde chemotaxis indeks for biotin 0,68 ± 0,09 og 0,12 ± 0,04 for DA1262 og FDX (ses25), hhv. Aktive orme blev individuelt opsamlet og overført til midten af ​​testpladen. Det er vigtigt ikke kun hurtigt, men også forsigtigt overføre ormene for ellers kan forblive inaktiv i flere minutter og undlader at spore lokkemidler. Ved afslutningen af ​​forsøget foreslår vi overvåger orme enctivity ved at kigge på deres veje. Hvis kun nogle få spor er synlige, vi normalt kassere pladen.

GFP-fluorescens i Aser neuroner i FDX (ses25) orme forsvinder indenfor de første elleve dage af livet (ikke vist). Dette antyder, at disse celler undergår apoptose på grund af tilstedeværelsen af Ap 42. Derfor har vi bestemt, om en bredspektret inhibitor af apoptose såsom caspaseinhibitoren N-(2-quinolyl) valyl-aspartyl-(2,6-difluorphenoxy) methyl keton (Q-VD-OPh) 13 kunne standse tabet af Aser celler . Til dette formål har vi ansat dyrkede primære Aser neuroner fra fostre 14, der blev fremstillet som beskrevet i protokol nr. 3. Repræsentative billeder af en ASER neuron i en ung (4 dage gamle) FDX (ses25) orm sammen med billeder af neuroner i kultur er vist i figur 2A-C. Dyrkede Aser celler var kortvarig (figur 2D). Som forventet inkubation med 0,3 mikrogram / ml Q-VD-OPh frisk suppleret dagligt, c ompletely stoppet tabet af fluorescerende Aser neuroner. Når man arbejder med primære neuroner i kultur, er det vigtigt at opretholde et belejligt celledensitet. Denne parameter afhænger primært af antallet af orme, der anvendes til at udtrække æggene. Vi måler celletæthed med en standard hæmocytometer og tage særlig omhu for at bevare celledensiteten konstant fra cellekultur til cellekultur. Til farmakologiske eksperimenter såsom dem beskrevet her vi arbejdede med ~ 200.000 celler / cm 2 som blev opnået ved at høste fire sammenflydende 10 cm plader. Celler blev udpladet i 12 brønde i en plade med 24 brønde. For at opnå optimale resultater er det også vigtigt at adskille de embryonale celler før såning, da de har tendens til at danne klumper. Vi bruger en sprøjte med en 27 gauge nål og landadel aspirer suspension og tilbage et par gange. Dette er normalt tilstrækkeligt at adskille de fleste af cellerne (især i starten foreslår vi at kontrollere suspensionen under et mikroskop).

t "fo: keep-together.within-page =" altid "> Figur 1
Figur 1. Kemotaksi assay. A. repræsentant kemotaxi plade. Lokkemiddel (biotin) og kontrol pletter er markeret med et hul og en udfyldt cirkel. B. En chemotaxis plade fyldt med en 0,5-cm diameter stykke agar bruges til at etablere en gradient af biotin. Det stykke agar blev skåret fra en 10 cm plade med oversiden af en glas Pasteur-pipette. C. repræsentant fordeling af orme omkring tiltrækkende stedet. I dette eksempel størstedelen af DA1262 orme var i stand til at lokalisere kilden til tiltrækningsstoffet (biotin). D. Som i C i FDX (ses25) orme. Disse biotin-ufølsomme orme udviste en spredt fordeling omkring pladen, og kun få blev fundet nær tiltrækkende stedet.

tp_upload/50435/50435fig2.jpg "/>
Figur 2. Kultur C. elegans embryonale celler. A. Fluorescensmikroskopi billede (billedet til venstre), og skarpt lys (højre billede) taget fra en FDX (ses25) transgen orm hoved. Denne orm udtrykker GFP i ASER neuron drevet af GCY-5 promotor. B. Bright lys billede af en kultur af FDX (ses25) embryonale celler. Målestokken er 5 um. C. Fluorescens mikroskopi billede af en kultiveret FDX (ses25) ASER neuron. Billeder blev taget med et Olympus BX61 mikroskop udstyret med et digitalt kamera. D. Repræsentant eksperiment teste levedygtighed dyrkede, alder synkroniseret, Aser neuroner. Cellerne blev indhentet fra DA1262 embryoner (hule cirkler) eller FDX (ses25) embryoner opretholdt i fravær / tilstedeværelse af 300 ng / ml Q-VD-Oph (hule og fyldte pladser, henholdsvis). Forsvinden af ​​GFP-fluorescens blev anvendt som et mål for en neuron levedygtighed. Exeksperiment begyndte med ~ 300 fluorescerende Aser neuroner. Levedygtighed blev beregnet som 100 * (antal fluorescerende celler på dag X divideret med antallet af fluorescerende celler på dag 1). Klik her for at se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en kombineret tilgang, for at studere cellulære og molekylære aspekter af amylopathies hjælp C. elegans. Fordelene ved denne fremgangsmåde omfatter: 1). Lave omkostninger C.elegans opretholdes i normal petriskål podet med bakterier, ved stuetemperatur. 2) Stærke genetik. Transgene dyr kan opnås i nogle måneder, og en bred vifte af promotorsekvenser er tilgængelig til at drive ekspression af det ønskede gen i bestemte neuroner. 3) Enkle, velkarakteriseret, nervesystem. C. elegans besidder en bemærkelsesværdig enkel nervesystem (302 neuroner). Denne enkelhed har der ydes en omfattende karakterisering af ormen nervesystem, herunder celleafstamning, bestemt funktion / rolle i hver neuron og dens synaptiske forbindelser. Begrænsningerne i C. elegans omfatter den lille størrelse af de celler, som hindrer anvendelsen af standard biokemiske teknikker såsom immunohistokemi og en tyk hud (kutikula), der isolerer neuRons danner det ydre miljø. Derfor kan farmakologiske tilgange være af begrænset effekt i C. elegans. Kulturer af primære celler udgør et gyldigt strategi til delvis lindre dette problem.

De kritiske trin i disse eksperimentelle protokoller inkluderer starter med store mængder af orme og overvågningen af de forberedelser for at ikke miste æg, embryoner osv. Det er også afgørende at lære at håndtere dyrene under injektion. Holde orme i agarose puden for længe, ​​stansning dem med en stor pipette eller injicere for meget DNA mix kan irreversibelt beskadige dem. Transformationseffektivitet, reproducerbarhed og transgen ekspression kan variere. Effektivitet er relateret til renheden af ​​injektionen mix og dens sammensætning (tilstedeværelse af ikke-kodende DNA). Ekstrakromosomale arrays varierer fra dyr til dyr og det er derfor afgørende at etablere mindst 2-3, uafhængige linier per transgen. På den anden side, fordøjet tilsætning afgenomisk DNA til mix er en gyldig strategi for nedbringelse transgene overekspression. Chemotaxis assays er relativt problemfri. Men det er afgørende at fastholde sammenhængen i koncentrationsgradient for at undgå falske resultater. Brug stykker af agar af samme størrelse-for eksempel skære dem med en Pasteur-pipette-og vedligeholde Ekvilibreringstiden konstant. Hvis nogen, fjernes overskydende opløsning med en vatpind.

Afslutningsvis har vi her et eksempel på, hvordan en enkel, genetisk medgørlig organisme kan udnyttes til at undersøge molekylære aspekter af amylopathies. De samme eksperimentelle teknikker kunne anvendes til undersøgelse af andre neuronale proteiner, og til generering af nye dyremodeller for sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. NGM
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 3 g
Bacteriological agar AMRESCO J637 17 g
Bacto-peptone AMRESCO J636 2.5 g
Distilled Water Bring to 975 ml
Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 1 ml of 1 M stock
Cholesterol Sigma-Aldrich C3045 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)
Potassium phosphate buffer 25 ml of 1M stock
2. Potassium phosphate buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 108.3 g
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 35.6 g
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
3. M9 buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 3 g
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S5136 6 g
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 5 g
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 118 mM
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 48 mM
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 2 mM
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M4880 2 mM
HEPES Fisher Scientific BP310 25 mM
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
5. CM-15
L-15 culture medium Gibco 11415 450 ml
Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028 50 ml
Penicillin Gibco 15140 50 units/ml
Streptomycin Gibco 15140 50 g/ml
Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C
6. Other Reagents
Halocarbon 700 oil Halocarbon Products 9002-83-9
5 μm Acrodisc Syringe Filter PALL Co. 4199
Chitinase Sigma-Aldrich C6137-5UN
Lectin (peanut) Sigma-Aldrich L0881-10MG
Sodium hydroxide Fisher Scientific S320
Lysine Sigma-Aldrich L5501
Biotin Sigma-Aldrich B4639
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sucrose Sigma-Aldrich S0389

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
  2. Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer's disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).
  3. Greenberg, S. A. Inclusion body myositis: review of recent literature. Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).
  4. Revesz, T., et al. Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies. Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).
  5. Hartmann, T., et al. Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).
  6. Ohnishi, S., Takano, K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).
  7. C. elegans II. Cold Spring Harbor Monograph. DL, R. iddle, et al. 1, M. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1222 (1997).
  8. Cotella, D., et al. Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).
  9. Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).
  10. Cai, S. Q., Sesti, F. Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging. Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).
  11. Yu, S., et al. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).
  12. Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).
  13. Caserta, T. M., et al. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).
  14. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).

Tags

Neuroscience medicin neurobiologi cellebiologi molekylærbiologi genetik Developmental Biology Cell Fysiologiske Phenomena neurovidenskab beta-amyloid, Apoptose amylopathy amyloid beta Alzheimers sygdom AD neuroner cellekultur transgene orm dyremodel
A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Model System for Amylopathy Study
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duan, Z., Sesti, F. A… More

Duan, Z., Sesti, F. A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study. J. Vis. Exp. (75), e50435, doi:10.3791/50435 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter