Summary
우리는 벌레에 amylopathies의 양상을 연구하는 방법을 설명
Abstract
Amylopathy 시간과 조직에서 아밀로이드 베타의 비정상적인 합성과 축적을 (Aβ)에 대해 설명하는 용어입니다. Aβ는 알츠하이머 병 (AD)의 특징과 Lewy 바디 치매, 봉입체 근염의 대뇌 아밀로이드 angiopathy 1-4에서 찾을 수 있습니다. Amylopathies 점차적으로 시간 개발할 수 있습니다. 이러한 이유로 짧은 수명과 간단한 유기체는이 조건의 분자 측면을 명료하게하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기, 우리는 웜 Caenorhabditis의 elegans의를 사용하여 Aβ 매개 신경 변성을 연구하는 실험 프로토콜을 설명합니다. 따라서, 우리는 어른 자웅 동체의 세포 융합 생식선에 DNA 인코딩 인간의 Aβ에게 42 주입하여 유전자 변형 벌레를 구축합니다. 형질 전환 라인은 돌연변이에 의한 통합에 의해 안정화된다. 선충이 알을 수집 및 시드에 의해 동기화 시대입니다. Aβ 42을 표현 뉴런의 기능은 (좋은 기회 행동 분석에서 테스트 화성 분석들). 배아에서 얻은 기본의 연결을 문화는 행동 데이터를 보완하고 항 세포 사멸 화합물의 신경 효과를 테스트하는 데 사용됩니다.
Introduction
아밀로이드 베타 (Aβ) β 및 γ의 secretases 1에 의한 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 연속 절단 한 후 형성되는 36-43 아미노산 펩티드이다. γ의 secretase에는 Aβ 펩타이드의 C-말단을 처리하고 그 변수 길이 5에 대한 책임이 있습니다. Aβ의 가장 일반적인 형태는 Aβ 40 Aβ 42, 더 일반적으로 같은 AD 5와 같은 병적 상태에 관련되는 후자입니다. 높은 농도의 Aβ 양식 β-시트에있는 아밀로이드 원 섬유는 6을 형성 집계. 섬유 보증금 신경을 둘러싸고있는 치매 plaques의 주요 구성 요소입니다. 플라크와 확산 성, 비 플라크 Aβ 올리고머, 모두 Aβ의 기본 병원성 양식을 구성하는 것으로 생각되고 있습니다.
신경 amylopathies의 실험실 연구는 시간이이 조건이 진행 사실에 의해 복잡합니다. 따라서 importan입니다마우스 - 짧은 수명에 모델을 보완하는 유전자 다루기 쉬운 동물을 개발하는 t. 이러한 모델은 amylopathies - 일반적으로 세포 및 분자 및 그 단순 덕택으로, 문제의 본질을 포착하는 데 도움의 특정 측면을 명료하게 할 수 있습니다. 웜 Caenorhabditis의 엘레 가을이 범주입니다. 그것은 짧은 수명을 가지고 ~ 20의 일 유전자 발현, 단백질 밀매, 신경 연결, 시냅스, 세포 신호, 죽음의 규제 등뿐만 아니라 기본적인 세포 과정에서 포유류 7과 비슷합니다. 웜의 독특한 특징은 강력한 유전 독립적으로 혈관 손상 신경 손상을 연구 할 수있는 혈관 시스템의 부족이 (가) 있습니다. 반면에, 뇌의 부족 C.의 사용을 제한 신경 변성의 여러 측면을 연구하는 엘레 간스. 또한, 병변의 해부학 적 분포의 재생 및 식별이 유기체에서 수행 할 수 없습니다. 다른 제한관리 포인트는 유전자 발현 프로파일과 복잡한 행동과 메모리 기능의 장애 모두에서 차이를 평가하는 어려움이 있습니다. 여기에서 우리는 C를 생성하는 방법을 설명 amylopathies의 elegans의 모델.
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Protocol
1. 형질 전환 웜 건설
- 변환.
- 사출 패드를 준비합니다. 유리 coverslip에 위에 물에 용해 뜨거운, 2 % 아가로 오스의 드롭 놓습니다. 신속하게 드롭 번째 coverslip을 배치하고 가볍게 누릅니다. 아가로 오스가 떨어져 슬라이드의 coverslips에게 응고, 그리고 80 진공 오븐에서 coverslip에 패드 ° CO / N. 구워 후
- 피펫을 잡아 당깁니다. 우리는 1/0.5 mm 필라멘트와 OD / ID 붕 규산염 모세 혈관을 당겨 셔터 P-97 풀러를 사용합니다. 피펫은 나중 단계에서 열려 깨진 닫힘 끝으로 위조된다.
- 사출 믹스를 준비합니다. μL / 150 NG의 최종 농도에 관심 DNA (구조 20 NG / μL)와 빈 플라스미드 DNA를 포함하는 주입 혼합물을 확인합니다. 모든 오염 물질을 제거하는 사출 혼합물을 원심 분리기. 오염 물질 변환 효율을 줄일 수 있기 때문에이 단계는 중요합니다. B에 신선한 튜브에 상위 5 μL를 (이물질 및 기타 오염 물질이 바닥에 수집) 전송전자 주입에 사용됩니다.
- 모세관 현상에 의해 주입 혼합을로드합니다. 피펫의 바닥은 사출 믹스에 몰두하고 있습니다. 일반적으로 0.5 μL 100 벌레를 주입하기에 충분합니다.
- 주입 피펫을로드합니다. micromanipulator에의 홀더에 피펫을 삽입하고 아가로 오스 패드에 파편에 유리 슬라이드 또는 양자 택일로 장착 된 커버 슬립의 가장자리에 그 끝을 문질러서이 열려 휴식. 이 너무 큰 팁을 손상 웜으로 중요한 단계입니다 너무 작은 팁은 쉽게 막혀 있습니다. 깨진 팁의 질은 유량에 의해 가장 중요한 형상에 의해 판단 할 수 있습니다. 유량은 분사 압력의 질문에 답변 할로 카본 700 기름 한 방울에 몰두 열린 끝에서 흐르는 거품의 크기에 의해 평가 될 수있다.
- 사출 패드에 웜을 전송합니다. 주입 패드 700 할로 카본 오일 한 방울을 배치하고 기름 (초보자를위한 1 또는 2) 여러 벌레를 전송할 수 있습니다. 때까지 패드에 벌레를 밀어 선택 웜을 사용y는 아가을 준수합니다. 웜은 같은 방향으로 향하게하는 복부 측면과 행 지향적이어야한다. 웜의 머리를 만지지 마십시오. 벌레가 패드에 준수하지 않는 여러 시도 후 경우, 신선한 패드로 교체하거나 아가로 오스의 두께 및 / 또는 농도를 증가시킨다.
- 웜에 피펫을 삽입합니다. 스테이지를 이동하여, 피펫에서 벌레를 배치합니다. 의 세포질 많은 생식 세포 핵에 의해 공유되기 때문에 생식선의 중앙 코어 피펫을 놓습니다. 이것은 많은 자손을 주입 DNA를 제공 할 가능성이 높아집니다. 피펫 웜 (~ 15 ° -25 ° 각도)에 거의 평행하게 놓여 있어야합니다. 피부가 침체 될 때까지 수직으로 웜의 몸 아래로 피펫의 팁을 누르십시오. 그런 다음 부드럽게 끝의 삽입을 유도하는 조작에 누릅니다. 최상의 결과를 모두 생식선을 주입.
- DNA 용액을 주입. 생식선 부풀 때까지 피펫에 압력을 적용합니다. 흐름을 중지하고 피펫 떨어져 벌레를 잡아 당깁니다. 이동 한 후 흐름 바늘을 테스트하고다음 웜과 반복 주입 단계.
- 벌레를 복구 : 웜에 대한 복구 버퍼의 드롭 (~ 10 μL)을 추가하고 벌레가 수영을 시작할 때까지 배양한다. 솔루션은 대부분 M9 때까지 벌레가 수영을 다시 시작하고 여러 번 반복 될 때까지 M9의 동일한 볼륨을 추가 기다립니다. 개별 시드 플레이트에 벌레를 전송할 수 있습니다.
- 통합.
- 신선한 플레이트로 40 건강하고 먹이, L4 벌레를 배치
- 40 분 동안 4,000 라드와 γ-선 조사. 신선한, OP50 시드 플레이트 (4 웜 / 플레이트)에 조사 웜 (P0)를 전송합니다. 웜 또는 300 J / 평방 미터 UV를의 선량을 조사 할 수 있습니다.
- 개인 접시에 각 플레이트 10-20 F1 형질 전환을 전송, 해당 P0 원점 번호판을 레이블을 지정합니다.
- 별도의 플레이트에 각 F1 2-4 F2 형질 중 하나. 변환 마커의 100 % 전송을위한 F3 자손을 확인합니다. 일반적으로, 조사 웜 줘야에서 자손의 1-3%난 통합 이벤트가 있습니다.
- 세 개 이상의 독립적 인 형질 전환 라인의 주식을합니다.
2. 행동 분석 실험
- 나이 동기화.
- 표준 10cm NGM 플레이트 + OP50 E.에있는 벌레를 성장 임신하는 성인의 많은 인구까지 대장균 (3-5 일)에 도달합니다.
- 1 ML M9 버퍼에서 그들을 정지 50 ML 팔콘 튜브에 벌레를 수집합니다.
- 3 분 450 XG에서 5 ML M9 버퍼와 원심 분리기를 추가합니다. 상층 액을 버린다. 3 배 반복합니다.
- 마지막으로 원심 분리의 끝에서, 상층 액을 제거하고 침전 웜 기본 차아 염소산 용액 (0.5 M NaOH를 갓 혼합 1 % 차아 염소산)의 10 볼륨을 추가합니다. ~ 10 분 동안 RT에서 품어. 용해 반응은 coverslip에의 용해 반응의 저하를 배치하고 현미경으로 벌레를 검사하여 모니터링 할 수 있습니다. 벌레의 약 80 %가 파손되면 반응을 중지해야합니다.
- 추가 기능에 의해 용해 반응을 정지살균 계란 버퍼의 G는 같은 볼륨.
- 5 분 450 XG에서 원심 분리하여 계란 (그리고 시체)를 수집합니다.
- 살균 계란 버퍼 2 배와 계란을 씻으십시오.
- M9 버퍼와 씨앗들을 표준 NGM 플레이트에있는 계란 O / N를 품어.
- 화성 분석.
- 한천 약 0.5x0.5x0.5 cm의 여러 조각을 준비합니다. 우리는 10 cm 플레이트 한천을 입금하고 우리는 거기에서 한천 덩어리를 잘라.
- 2 시간에 원하는 유인을 (포화에 가까운 포화 농도)를 포함하는 용액에 한천 덩어리를 적시십시오. 일반적인 유인 라이신 (0.5 M), 비오틴 (0.2 M)입니다.
- 시험 장소의 위치와 제어 지점 (그림 1A)로 표시되어있는 10 센티미터 테스트 플레이트 한천 덩어리를 입금. 평형 및 그라데이션 O / N (그림 1B)의 형성을 허용합니다. 한 실험 5 접시를 준비합니다.
- 이전 실험은 20 mM의 NaN의 3 (네스트의 10 μl를 추가각 장소에) hetic.
- 접시의 중앙에 20 나이 동기화 벌레를 놓습니다. 20 ℃에서 인큐베이터에있는 접시를 놓습니다
- 1 시간 후, 테스트 / 제어 장소에서 동물을 계산하고 다음과 같이 화성 지수 (CI)를 계산 :
N, N 테스트 및 N Cnt 필드는., 동물의 총 수, 시험 현장에서 동물의 수와 제어 지점에있는 동물의 수를 표시 함.
N, N 테스트 및 N Cnt 필드는., 동물의 총 수, 시험 현장에서 동물의 수와 제어 지점에있는 동물의 수를 표시 함. 3. 기본 배아 세포 배양
- 나이 동기화에 설명 된대로 벌레를 용해.
- 5 분 450 XG에서 살균 계란 버퍼와 원심 분리기의 동일한 볼륨을 추가하여 용해 반응을 중지합니다. 부드럽게 펠렛 계란을 잃게하지 않도록주의하면서 상층 액을 버린다. 2 배 반복하거나 뜨는 선명해질 때까지.
- 펠렛 달걀 (그리고 시체를 Resuspend) 2 ㎖ 멸균 계란 버퍼와 계란 버퍼에 멸균 60 %의 자당 2 ML를 추가합니다. 계란이 완전히 손으로 또는 텍싱하여 (그들은 원심 분리에 따라 덩어리를 형성하는 경향) 현탁 될 때까지이 솔루션을 섞는다.
- 15 분 450 XG에 원심 분리기.
- 조심스럽게 멸균 튜브에 뜨는를 (계란 포함) 전송합니다. 시체와 용해의 제품으로 다른 포함 된 펠렛을 폐기하십시오.
- 계란 버퍼에 계란을 현탁 5 분 XG 450 원심 분리하여 잔류 자당을 제거합니다. 부드럽게 수집하고 상층 액을 버린다. 배 반복합니다.
- 층류 후드 아래에 달걀 껍질을 소화하기 위해 RT에서 1 U / ㎖ 키티 나제를 포함하는 살균 계란 버퍼에 펠렛 계란을 resuspend을. 30 분 반응 (거꾸로 세포 배양 현미경)를 모니터링하기 시작하면. 키티 나제의 각 배치는 약간 다른 활동이있다. 일반적으로 소화는 1 시간에 완료됩니다.
- 약 70-80%의 달걀 껍질은 키티 나제 CM-15 추가 (L-15 세포 배양 의대에 의해 소화 될 때IUM은 10 % 태아 소 혈청, 50 U / ML 페니실린, 50 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신)를 포함. 27 게이지 주사기를 사용하여 세포를 떼어 놓다. 그대로 배아를 제거하는 필터 5.0 μm의, 세포와 유생의 대단히 짧은 시간에 세포 현탁액을 필터링합니다.
- 펠릿은 450 원심 분리하여 해리 된 세포 현탁액은 15 분 동안 XG. 상층 액을 제거하고 CM-15 세포 배양 배지에서 펠렛을 resuspend을.
- . 유리 커버 플레이트에 해리 세포는 이전에 물 주에 용해 땅콩 렉틴 (0.1 밀리그램 / ML)로 코팅 미끄러 져 : 세포가 분화하기 위해 기판을 준수해야합니다.
- 세포는 2 주 이상 공기 RT (16-20 ° C)로 유지 될 수 있습니다.
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Representative Results
우리의 프로토콜로 우리는 신경 기능 8 인간의 Aβ 42 올리고머의 효과를 연구한다. 조각 인코딩 인간의 Aβ 42 화재 벡터 pPD50.52의 인공 신호 펩타이드 코딩 순서는 끝 스몰 1 제한 효소 사이트를 소개 프라이머를 사용하여 구조 PCL12 9에서 증폭되었다. 조각은 그 독특한 스몰 1 사이트 10 ~ pPD95.75 화재 벡터의 2,481-BP FLP-6 프로모터 서열을 포함하는 구조에 삽입되었다. 프로토콜 1에 설명 된 변환 기술을 사용하여 우리는 ASE 뉴런 (FDX (ses25) 변형) 8 Aβ 42을 표현하는 유전자 변형 벌레를 구축. 긍정적 인 형질을 표시하기 위해 우리는 특히 ASE 오른쪽 (ASER) 신경 세포의 11 GFP 발현을 구동 P GCY-5 :: GFP 기자를 사용했습니다. 건조한 아가가 물을 흡수하기 때문에 웜 패드에 붙어 있습니다. 따라서이 CRU입니다CIAL 동물 사출 패드에 배치하고 그렇지 않으면이 마르다 죽을 것이기 때문에 상대적으로 빠르게 주입합니다. 전염성 extrachromosomal 배열을 전달 F1 자손의 비율은 다를 수 있습니다. 일반적인 값은 3~7% 범위에 있습니다. 그것은 DNA를 서로 상동 재조합을 받아야하기 때문에 주입 혼합 (1.1.3)는 형질 전환 DNA (일반적으로 빈 벡터)와 비 암호화 DNA를 공유 시퀀스 상동를 포함하는 것이 중요합니다. 유전자의 과발현이 문제가 될 경우에는, 주입 혼합은 50 ~ 100 NG / 무서 1 소화 게놈 DNA의 μL로 보충해야한다. ASE 뉴런은 비오틴과 같은 수용성 유인을 감지하기 때문에 그 기능은 행동 분석 (화성 분석, 프로토콜 2와 그림의 1A와 1B) 12에서 평가 될 수있다. 전형적인 실험에서, 우리는 P GCY-5를 표현 칠일 오래된 웜 :: GFP 형 (DA1262 변형) 또는 Aβ 42 (FDX (ses25))에 대한 테스트비오틴에 화성. 젊은 웜 (3-4 일 이전)에 Aβ 42 표현의 효과는 겸손하지만 이미 감지됩니다 (화성 지수 ~ 10 % 감소, REF를 참조하십시오. 8). 이 실험의 대표적인 결과는 그림의 1C 및 1D에 표시됩니다. 대부분의 DA1262 웜 근처 유인 자리 (그림 1C)를 발견, 또는 하였다. 대조적으로 Aβ 42을 표현 몇 벌레 유인 자리 (그림 1D)를 찾을 수 있습니다. 우리는 각각 DA1262와 FDX (ses25)에 대한 비오틴 0.68에 대한 화성 지수 ± 0.09와 0.12을 얻는 5 테스트 판 / 유전자형의 분포 100 동물 / 유전자형 ± 0.04을 테스트했습니다. 활동 웜은 개별적으로 포착하고 테스트 판의 중앙에 옮겨졌다. 그것은에뿐만 아니라 신속하게 중요하지만, 또한 그렇지 않으면 몇 분 동안 비활성 상태로 유지하고 유인을 추적하지 못할 수 있기 때문에 조심스럽게 벌레를 전송합니다. 실험의 끝에서 우리는 모니터 벌레에게 제안자신의 경로를 보면서 ctivity. 몇 트랙을 볼 수 있다면 우리는 일반적으로 판을 버린다.
FDX (ses25) 웜의 ASER 뉴런에 GFP 형광 (미도시) 인생의 첫 십일일 내에 사라집니다. 이 이러한 세포는 Aβ (42)의 존재로 인해 apoptosis를 받아야하는 것이 좋습니다. 그러므로 우리는 결정 여부와 같은 세포 사멸의 넓은 스펙트럼 억제 카스파 제 억제제 N-(2 - 퀴 놀릴) valyl-aspartyl - (2,6 - difluorophenoxy) 메틸 케톤 (Q-VD-OPH) 13 ASER 세포의 손실을 막을 수 . 이를 위해 우리는 프로토콜 3에 설명 된대로 준비되었다 배아 14 일에서 배양 기본 ASER 신경을 채택했다. 젊은 (4 일 이전) FDX (ses25) 문화 뉴런의 이미지와 함께 벌레에 ASER 신경 세포의 대표 이미지는 그림 2A-C에 나와 있습니다. 배양 ASER 세포 (그림 2D) 단명했다. 0.3 ㎍ / mL로 예상 배양으로 Q-VD-OPH 갓 매일 C를 보충 ompletely 형광 ASER 뉴런의 손실을 중단했다. 문화의 기본 뉴런과 작업 할 때 그것은 좋은 기회 세포 밀도를 유지하는 것이 중요합니다. 이 매개 변수는 주로 계란을 추출하는 데 사용되는 웜의 수에 따라 달라집니다. 우리는 표준 혈구와 세포 밀도를 측정하고 세포 배양에서 세포 배양에 일정한 세포 밀도를 유지하기 위해 특히주의하십시오. 것과 같은 약물 실험은 여기에 설명을 위해 우리는 네 가지 합류 10cm 플레이트를 수확을 얻었다 ~ 200,000 세포 / cm 2했다. 세포는 24 - 웰 플레이트의 12 우물에서 도금되었다. 최적의 결과를 위해 그들이 덩어리를 형성하는 경향 파종하기 전에 배아 세포를 해리하는 것도 중요합니다. 우리는 27 게이지 바늘과 상류 계급이 다시 현탁액을 대기음 앞뒤로 몇 번으로 주사기를 사용합니다. 이것은 일반적으로 세포 (특히 처음에 우리가 현미경으로 서스펜션을 확인하는 것이 좋습니다)의 대부분을 떼어 놓다하기에 충분합니다.
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그림 1. 화성 분석. A. 대표 화성 플레이트. 유인 (비오틴) 및 제어 장소는 빈과 채워진 원으로 표시됩니다. B. 비오틴의 그라데이션을 설정하는 데 한천 0.5 cm 직경의 조각으로로드 화성 플레이트. 한천 조각은 유인 현장 주변에 웜의 유리 파스퇴르 피펫. C. 대표 배포의 상단을 사용하여 10 cm 플레이트에서 절단되었다. 이 예에서는 DA1262 벌레의 대부분은 FDX (ses25) 웜 C. 마찬가지로 유인의 소스 (비오틴). D.를 지역화 할 수 있었다. 이러한 비오틴 구분 웜 플레이트 주위에 흩어져 분포를 전시하고 단 몇은 유인 현장 근처에서 발견되었다.
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그림 2. C. 문화 엘레 배아 세포. A. 형광 현미경 이미지 (왼쪽 사진)와 밝은 빛 (오른쪽 그림) FDX (ses25) 형질 전환 웜 머리에서 촬영. 이 웜은 GCY-5 프로모터에 의해 구동 ASER 뉴런에 GFP를 표현한다. FDX (ses25) 배아 세포의 문화의 B. 밝은 빛을 이미지. 스케일 바는 10 μm의 수 있습니다. 배양 FDX (ses25) ASER 신경 세포의 C. 형광 현미경 이미지. 이미지는 디지털 카메라가 장착 올림푸스 BX61 현미경으로 촬영했다. D. 대표 실험은 배양, 나이 동기화 ASER 신경 세포의 생존을 테스트. 세포 유지 DA1262 배아 (빈 원) 또는 FDX (ses25) 배아에서 얻은 부재 / 300 NG / ML Q-VD-OPH (빈과 채워진 사각형, 각각)의 존재. GFP 형광의 실종은 신경 세포의 생존 능력의 척도로 사용되었다. 전periment는 ~ 300 형광 ASER 뉴런 시작했다. 생존 100 * (1 일에 형광 세포의 수로 나눈 일 X에서 형광 세포의 수)로 계산 하였다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
여기에서 우리는 C를 사용하여 amylopathies의 세포 및 분자 측면을 연구하기 위해, 결합 방법을 설명 엘레 간스. 이 방법의 장점은 다음과 같습니다. 1) 저렴한 비용으로 C.elegans는 상온에서, 박테리아 파종 일반 페트리 접시에 유지됩니다. 2) 강력한 유전학. 형질 전환 동물은 몇 개월 만에 얻은 프로모터 서열의 다양한 특정 뉴런에서 원하는 유전자의 발현을 유도 할 수있다 할 수 있습니다. 3) 단순, 잘 특성화, 신경계. C. 엘레은 매우 간단 신경계 (302 뉴런)를 보유하고있다. 이 단순 세포 혈통, 각 신경 세포의 특정 기능 / 역할과 시냅스 연결을 포함하여 벌레의 신경계의 광범위한 특성을 여유했다. C.의 한계 엘레은 면역 표준 생화학 기술의 응용 프로그램과 노를 격리한다 두꺼운 피부 (표피)을 방해하는 세포의 작은 크기를 포함RONS은 외부 환경을 형성한다. 따라서 약물 접근법 C로 제한 효능이 될 수 있습니다 일차 전지의 엘레 간스. 문화는 부분적으로이 문제를 개량하는 유효한 전략을 나타냅니다.
이 실험 프로토콜의 중요한 단계는 웜의 대량 시작하여 계란, 배아 등을 잃지하기 위해 준비를 모니터링 (가) 있습니다. 또한 주입하는 동안 동물을 처리하는 방법을 배울 매우 중요합니다. 큰 피펫을 펀칭 또는 너무 많은 DNA 믹스를 주입, 너무 오래 아가로 오스 패드에서 벌레를 유지하는 것은 돌이킬를 손상시킬 수 있습니다. 변환 효율성, 재현성 및 유전자 발현이 다를 수 있습니다. 효율은 주입 믹스의 순도와 그것의 구성 (비 코딩 DNA의 존재)에 관련되어 있습니다. Extrachromosomal 배열 동물에서 동물에 따라 다릅니다 따라서이 유전자 당 2-3 적어도 독립적 인 라인을 구축하는 것이 중요합니다. 반면에,의 첨가 소화믹스로 게놈 DNA가 과발현 형질 전환 줄이기 위해 유효한 전략을 나타냅니다. 화성 분석은 상대적으로 문제가 무료입니다. 그러나 그것은 잘못된 결과를 방지하기 위해 농도 구배의 일관성을 유지하기 위해 매우 중요합니다. 파스퇴르으로 그들을 잘라 피펫 및 평형 시간이 일정한 유지 예를 들어 사이즈 같은의 한천 조각을 사용합니다. 어떤 경우 면봉으로 과량의 용액을 제거합니다.
결론적으로, 우리가 간단한 유전자 다루기 쉬운 유기체가 amylopathies의 분자 측면을 조사하기 위해 악용 할 수있는 방법의 예를 제공합니다. 동일한 실험 기술은 다른 신경 세포 단백질의 연구와 질병의 새로운 동물 모델의 생성에 적용 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. NGM | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 3 g |
| Bacteriological agar | AMRESCO | J637 | 17 g |
| Bacto-peptone | AMRESCO | J636 | 2.5 g |
| Distilled Water | Bring to 975 ml | ||
| Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well | |||
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 1 ml of 1 M stock |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C3045 | 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol) |
| Potassium phosphate buffer | 25 ml of 1M stock | ||
| 2. Potassium phosphate buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 108.3 g |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | 35.6 g |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 3. M9 buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 3 g |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | 6 g |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 5 g |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm) | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 118 mM |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | 48 mM |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 2 mM |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | 2 mM |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | 25 mM |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 5. CM-15 | |||
| L-15 culture medium | Gibco | 11415 | 450 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | 50 ml |
| Penicillin | Gibco | 15140 | 50 units/ml |
| Streptomycin | Gibco | 15140 | 50 g/ml |
| Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C | |||
| 6. Other Reagents | |||
| Halocarbon 700 oil | Halocarbon Products | 9002-83-9 | |
| 5 μm Acrodisc Syringe Filter | PALL Co. | 4199 | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-5UN | |
| Lectin (peanut) | Sigma-Aldrich | L0881-10MG | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S320 | |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
References
- Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
- Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer's disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).
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