Summary
Nós descrevemos métodos para estudar aspectos da amylopathies do verme
Abstract
Amylopathy é um termo que descreve a síntese e a acumulação anormal de beta-amilóide (Ap) em tecidos com o tempo. Ab é uma característica da doença de Alzheimer (AD) e é encontrado na demência com corpos de Lewy, a inclusão miosite corpo e angiopatia amilóide cerebral 1-4. Amylopathies desenvolver progressivamente com o tempo. Por esta razão, os organismos simples com tempos de vida curtos podem ajudar a elucidar os aspectos moleculares destas condições. Aqui, descrevemos os protocolos experimentais para estudar a neurodegeneração Aâ mediada através do verme Caenorhabditis elegans. Assim, construímos vermes transgênicos, injetando DNA humano codificação ABeta 42 para as gônadas de hermafroditas sincicial adultos. Linhas de transformantes são estabilizados por uma integração induzida por mutagénese. Nemátodes são sincronizados idade recolhendo e semeando os seus ovos. A função de neurónios que expressam Ap 42 é testada em ensaios comportamentais oportunos (ensaio de quimiotaxias). Culturas neuronais primárias obtidas a partir de embriões são usados para complementar os dados de comportamento e para testar os efeitos neuroprotectores dos compostos anti-apoptóticos.
Introduction
Beta amilóide (Ap) é um péptido de 36-43 aminoácidos que é formada após a clivagem sequencial da proteína precursora de amilóide (APP) por β e γ secretases 1. A secretase γ processa a extremidade C-terminal do péptido Aíi e é responsável pelos seus comprimentos variáveis 5. As formas mais comuns de Ap são Ap 40 e Ap 42, sendo o último mais comum associado a condições patológicas tais como a AD 5. Em altas concentrações ABeta forma β-folhas que agregam para formar fibrilas amilóides 6. Depósitos de fibrilas são o principal componente das placas senis que cercam os neurônios. Ambas as placas e difusíveis, oligómeros de Ap não-placa, são pensados para constituir as formas de Ap patogénicos subjacentes.
Estudo de laboratório de amylopathies neuronais é complicada pelo facto de estas condições o progresso ao longo do tempo. Portanto, é important para o desenvolvimento de animais geneticamente tratável modelos complementares para camundongos com vida curta. Estes modelos podem ser utilizados para elucidar os aspectos específicos de amylopathies-tipicamente celular e molecular, e em virtude da sua simplicidade, para ajudar a captar a essência do problema. O verme Caenorhabditis elegans quedas está nesta categoria. Ele tem uma vida curta, ~ 20 dias e, além disso processos celulares básicos, incluindo a regulação da expressão do gene, o tráfico de proteína, a conectividade neuronal, sinaptogênese, sinalização celular e morte são semelhantes aos dos mamíferos 7. As características únicas do worm incluem genética poderosos ea falta de um sistema de vasos, o que permite estudar dano neuronal independentemente de dano vascular. Por outro lado, a falta de um cérebro limita a utilização de C. elegans para estudar vários aspectos da neurodegeneração. Além disso, a reprodução e a identificação das distribuições anatómicas de lesões não pode ser executada neste organismo. Outro limiteções incluem a dificuldade para avaliar tanto as diferenças nos perfis de expressão gênica e comprometimento do comportamento complexo e função de memória. Aqui descrevemos métodos para gerar C. modelos elegans de amylopathies.
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Protocol
1. Construção de Worms transgênicos
- Transformação.
- Prepare pastilhas de injeção. Colocar uma gota de água quente, de agarose 2% dissolvido em água, sobre uma lamela de vidro. Colocar rapidamente de uma segunda lamela sobre a queda e leve toque nele. Após a agarose é solidificado, lamelas deslizantes afastados, e cozer a lamela direccional num forno de vácuo a 80 ° CO / N.
- Puxe pipetas. Nós usamos um Sutter P-97 extrator para puxar 1/0.5 mm OD / ID borosilicato capilares com filamento. As pipetas são fundidas com a ponta fechada, que está quebrado aberto numa fase posterior.
- Prepare mix de injeção. Adicione a mistura de injecção contendo o ADN de interesse (20 ng / mL por construto) mais DNA de plasmídeo vazio a uma concentração final de 150 ng / mL. Centrifugar a mistura de injecção para remover qualquer contaminação. Este passo é essencial porque os contaminantes reduzir a eficiência da transformação. Transferir o topo 5 ul (resíduos e outros contaminantes em recolher o fundo) para um tubo fresco para be utilizado na injecção.
- Carregar mix injeção por capilaridade. A parte inferior da pipeta está imerso na mistura de injecção. Normalmente 0,5 mL são suficientes para injetar 100 vermes.
- Carregar pipeta de injecção. Insira a pipeta para o titular do micromanipulador e quebrá-lo aberto, esfregando a ponta contra a borda de uma lamínula montado em uma lâmina de vidro ou alternativamente contra detritos no bloco de agarose. Este é um passo crucial como dicas muito grande dano a minhoca e também pequenas dicas são facilmente obstruídos. A qualidade da ponta quebrada pode ser julgada pela forma e, sobretudo, pela taxa de fluxo. O caudal pode ser avaliada através do tamanho das bolhas de fluir a partir da ponta aberta imerso numa gota de óleo 700 halocarboneto, em resposta a uma pressão de injecção.
- Transferir vermes pad injeção. Coloque uma gota de óleo de 700 halocarbono sobre uma almofada de injeção e transferir vários (1 ou 2 para iniciantes) vermes para o óleo. Use um verme escolher para empurrar os vermes para baixo sobre o bloco até oy aderir à agarose. Worms deve ser orientada em linhas com os lados ventral na mesma direção. Evite tocar a cabeça do verme. Se, depois de várias tentativas os vermes não aderem à almofada, substitua por uma nova almofada de agarose ou aumentar a espessura e / ou a concentração.
- Insira a pipeta no worm. Ao mover o palco, posicionar o verme sob a pipeta. Posicione a pipeta no núcleo central da gônada porque seu citoplasma é compartilhada por muitos núcleos de células germinativas. Isto aumenta a probabilidade de entregar o ADN injectado para muitos progenitura. A pipeta deve ficar quase paralelo ao worm (~ 15 ° -25 °). Empurrar verticalmente a ponta da pipeta para baixo do corpo do verme até que a pele está deprimido. Em seguida, toque suavemente no manipulador para induzir a inserção da ponta. Para melhores resultados injetar tanto gônadas.
- Injetar a solução de DNA. Aplique pressão para a pipeta até as ondas gônadas. Interromper o fluxo e puxar o verme para fora da pipeta. Teste da agulha para o fluxo e movapara o outro verme e etapas de injeção de repetição.
- Recuperar os vermes: Adicionar uma gota (~ 10 ml) de tampão de recuperação sobre os vermes e incubar até que os vermes começam a natação. Adicionar um volume igual de M9, espere até que os vermes retomar a natação e repetir várias vezes até que a solução é mais M9. Individualmente transferir vermes para placas semeadas.
- Integração.
- Coloque 40 saudável, bem alimentado, L4 vermes em um prato de doce
- Irradiar com γ-ray com 4.000 rads por 40 min. Transferir vermes irradiados (P0), em OP50 placas semeadas frescas (4 vermes / placa). Os vermes podem, alternativamente, ser irradiado com uma dose de 300 J / m 2 UVs.
- Transferir 10-20 transformantes de F1 a partir de cada uma das placas para placas individuais, rotular as placas com o correspondente origem P0.
- Destacar 2-4 transformantes F2 para cada F1 para placas separadas. Verifique a progenitura F3 para a transmissão de 100% do marcador de transformação. Normalmente, 1-3% da descendência de um wil verme irradiadoTenho um evento de integração.
- As existências de três ou mais linhas transformantes independentes.
2. Os testes comportamentais
- Age-sincronização.
- Crescer vermes em padrão 10 centímetros placas NGM + OP50 E. coli até uma grande população de adultos grávidos é alcançado (3-5 dias).
- Recolher os vermes em tubos Falcon de 50 ml de suspensão por eles em 1 ml de tampão M9.
- Adicionam-se 5 ml de tampão M9 e centrifugar a 450 xg durante 3 min. Elimine o sobrenadante. Repita 3-4x.
- No final da última centrifugação, remove-se o sobrenadante e adicionar 10 volumes de solução de hipoclorito de base (NaOH 0,5 M, 1% de hipoclorito recentemente misturado) para os vermes peletizadas. Incubar à temperatura ambiente durante ~ 10 min. A reacção de lise pode ser monitorizada por colocar uma gota da reacção de lise sobre uma lamela e examinando os vermes ao microscópio. Quando cerca de 80% dos vermes estão quebrados a reação deve ser interrompido.
- Parar a reacção de lise por adding o mesmo volume de tampão de ovo esterilizada.
- Recolher os ovos (e carcaças) por centrifugação a 450 xg durante 5 min.
- Lavar os ovos com tampão de ovo esterilizada 2-3x.
- Incubar a ovos de O / N em tampão M9 e sementes los em placas NGM padrão.
- Ensaio de quimiotaxia.
- Prepare vários pedaços de ágar cerca 0.5x0.5x0.5 cm. Nós depositar o agar em uma placa de 10 cm e corte os pedaços de ágar a partir daí.
- Embeber o pedaço de agar de uma solução contendo o atraente desejado (em concentrações saturantes, quase saturação) durante 2 horas. Chamarizes típicos são lisina (0,5 M), biotina (0,2 M).
- Depositar um pedaço de agar de uma placa de 10 cm de teste em que a localização de um local de teste e um ponto de controlo foram marcadas (Figura 1A). Permitir o equilíbrio e a formação de um gradiente de O / N (Figura 1B). Prepare 5 placas de uma única experiência.
- Antes do experimento adicione 10 ml de 20 mM NaN 3 (Anesthetic) para cada mancha.
- Colocar 20 vermes idade sincronizados no centro da placa. Colocar a placa na incubadora a 20 ° C.
- Após 1 h, a contagem dos animais sobre os pontos de teste / controlo e calcular o índice de quimiotaxia, (IC), como a seguir:
em que N, N e N teste Cnt., indicam o número total de animais, o número de animais no local de teste e o número de animais no ponto de controlo.
em que N, N e N teste Cnt., indicam o número total de animais, o número de animais no local de teste e o número de animais no ponto de controlo. 3. Principal Cultura de Células Embrionárias
- Lyse vermes como descrito na idade de sincronização.
- Parar a reacção de lise pela adição de igual volume de tampão de ovo esterilizada e centrifugar a 450 xg durante 5 min. Gentilmente elimine o sobrenadante com cuidado para não perder os ovos peletizadas. Repita 2-3x ou até sobrenadante é clara.
- Ressuspender ovos peletizada (e carcaças) Em 2 ml de tampão de ovo esterilizada e juntar 2 ml de solução estéril de 60% de sacarose em tampão de ovo. Misture esta solução até que os ovos estejam completamente ressuspenso (como eles tendem a formar aglomerados sob centrifugação) com a mão ou em vortex.
- Centrifugar a 450 xg durante 15 min.
- Transferir cuidadosamente o sobrenadante (contendo os ovos) para um tubo estéril. Descartar pelete que contém as carcaças e outros subprodutos da lise.
- Remover sacarose residual por ressuspensão em tampão de os ovos dos ovos e centrifugação a 450 xg durante 5 min. Gentilmente coletar e descartar o sobrenadante. 3x.
- Sob uma cobertura laminar ressuspender ovos peletizadas em tampão de ovo estéril contendo 1 U / ml de quitinase a RT para digerir as cascas dos ovos. Depois de 30 min começa a controlar a reacção (sob um microscópio invertido de cultura de células). Cada lote de quitinase tem uma actividade ligeiramente diferente. Tipicamente, a digestão é completada em 1 hora.
- Quando cerca de 70-80% cascas de ovos são digeridos por chitinase add CM-15 (G-15 cultura de células medium contendo 10% de soro fetal bovino, 50 U / ml de penicilina e 50 ug / ml de estreptomicina). Dissociar células usando uma seringa com uma calibre 27. Filtra-se a suspensão de células com 5,0 mM de filtro para remover os embriões intactos, aglomerados de células e larvas.
- Pellet a suspensão de células dissociadas por centrifugação a 450 xg durante 15 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em CM-15 de meio de cultura celular.
- Células dissociadas da placa de vidro sobre a cobertura desliza previamente revestida com lectina de amendoim (0,1 mg / ml) dissolvido em água Nota:. Células devem aderir ao substrato, a fim de se diferenciar.
- As células podem ser mantidas à temperatura ambiente (16-20 ° C) ao ar durante mais de 2 semanas.
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Representative Results
Com os nossos protocolos nós estudamos os efeitos do humano ABeta 42 oligômero na função neuronal 8. Um fragmento de codificação ABeta humano 42 eo sinal peptídeo sequência codificante artificial de Fogo vetor pPD50.52 foi amplificado a partir construção PCL12 9 usando primers que introduziram um Sma uma restrição local endonuclease nas extremidades. O fragmento foi então inserido em uma construção contendo um flp-6 sequência do promotor 2481 pb no vector pPD95.75 fogo entre o local Smal único 1 10. Usando as técnicas de transformação descritos no protocolo 1 construímos um verme transgênico expressando ABeta 42 nos neurônios ASE (FDX (SES25) tensão) 8. Para marcar transformantes positivos usamos a GFP repórter GCY P-5 :: que dirige especificamente a expressão da GFP no direito ASE (ASER) neurônio 11. Worms furar a almofada porque a agarose seca absorve a água. Por isso, é crucial de que os animais são colocados sobre o bloco de injeção e injetado de forma relativamente rápida, porque senão eles vão desidratar e morrer. A percentagem da descendência de F1 que transporta uma matriz extracromossómico transmissível pode variar. Os valores típicos estão no intervalo de 3-7%. É importante que a mistura de injecção (1.1.3) não contém ADN que codifica a partilha homologia de sequências com o ADN transgénico (geralmente vector vazio), porque os DNAs sofrer recombinação homóloga com o outro. No entanto, se sobre-expressão do transgene é um problema a mistura de injecção deve ser suplementado com 50-100 ng / ml de ADN genómico digerido com Sca 1. Neurónios ASE detectar água atractivos solúveis, tais como biotina e, por conseguinte, a sua função pode ser avaliada em ensaios comportamentais (ensaio de quimiotaxia, protocolo 2 e Figuras 1A e 1B) 12. Numa experiência típica, foi testada sete dias de idade vermes GCY expressam P-5 :: GFP sozinho (DA1262 estirpe) ou com Ap 42 (FDX (SES25)) paraquimiotaxia a biotina. Em vermes jovens (3-4 dias de idade) os efeitos da expressão Ab 42 são modestos, mas já detectável (~ redução de 10% no índice de quimiotaxia, ver ref. 8). Os resultados representativos desta experiência são apresentados nas Figuras 1C e 1D. A maioria dos vermes DA1262 foram encontradas em, ou próximo, do local de atracção (Figura 1C). Por outro lado apenas alguns vermes expressando ABeta 42 poderia encontrar o local atrativo (Figura 1D). Foram testados 100 animais / genótipos distribuídos em cinco placas de teste / genótipo obtenção de um índice de quimiotaxia para a biotina 0,68 ± 0,09 e 0,12 ± 0,04 para DA1262 e FDX (SES25), respectivamente. Vermes activas foram colhidos e transferido para o centro da placa de teste individualmente. É importante não só rapidamente, mas também transferir suavemente os vermes porque caso contrário eles podem permanecer inativo por vários minutos e não conseguem acompanhar o atrativo. No fim do experimento, sugerimos um monitor de vermesctivity vendo os seus caminhos. Se apenas algumas faixas são visíveis costumamos descartar a placa.
Fluorescência da GFP nos neurónios ASER de SES25 (FDX) vermes desaparece dentro dos primeiros 11 dias de vida (não mostrado). Isto sugere que estas células entram em apoptose, devido à presença de Ap 42. Portanto, determinou-se um inibidor de largo espectro da apoptose, tais como a caspase inibidor de N-(2-quinolil) metil-cetona valil-aspartil-(2,6-difluorofenoxi) (Q-VD-OPh) 13 poderia parar a perda de células ASER . Para este fim, empregada cultivadas neurônios ASER primários a partir de embriões de 14, que foram preparadas como descrito no protocolo 3. Imagens representativas de um neurônio ASER em um jovem (4 dias de idade) FDX (SES25) verme junto com as imagens de neurônios em cultura são mostrados nas Figuras 2A-C. ASER células cultivadas foram de curta duração (Figura 2D). Como esperado incubação com 0,3 ng / ml de Q-VD-OPh recém suplementados diariamente, c ompletely parou a perda de neurônios ASER fluorescentes. Quando se trabalha com os neurónios primários em cultura, é importante manter uma densidade de células oportuno. Este parâmetro depende principalmente do número de vermes usados para extrair os ovos. Nós medimos a densidade de células com um hemocitômetro padrão e ter um cuidado especial para manter constante a partir de cultura de células de cultura de células de densidade celular. Para as experiências farmacológicas, tais como aqueles descritos aqui que trabalhou com ~ 200000 células / cm 2, que foi obtido por colheita de quatro placas de 10 cm confluentes. As células foram semeadas em 12 cavidades de uma placa de 24 poços. Para resultados óptimos, é também importante para dissociar as células embrionárias antes da semeadura, já que tendem a formar aglomerados. Usamos uma seringa com uma agulha de calibre 27 e pequena nobreza aspirar a suspensão frente e para trás um par de vezes. Isto é geralmente suficiente para dissociar a maioria das células (especialmente no início sugerimos a verificar a suspensão sob um microscópio).
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Figura 1. Ensaio de quimiotaxia. A. representativas quimiotaxia placa. Attractant (biotina) e pontos de controlo foram marcados com uma cavidade e um círculo cheio. B. Uma placa de quimiotaxia carregado com uma peça de 0,5 cm de diâmetro de agar utilizadas para estabelecer um gradiente de biotina. O pedaço de agar foi cortada a partir de uma placa de 10 cm com o lado superior de uma pipeta de Pasteur de vidro. C. Distribuição representativas de vermes em torno do ponto de atracção. Neste exemplo, a maioria dos DA1262 vermes foram capazes de localizar a fonte de atraidor (biotina). D. Como em C, durante FDX (SES25) vermes. Esses vermes biotina insensíveis exibiu uma distribuição espalhados por todo o prato e poucos foram encontrados perto do local atrativo.
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Figura 2. Cultura de C. A. imagem de microscopia de fluorescência (foto à esquerda) e luz (foto à direita) células embrionárias elegans. tirado de um FDX (SES25) cabeça verme transgênico. Este worm expressa GFP no neurônio ASER impulsionado pelo GCY-5 promotor. B. imagem luz brilhante de uma cultura de FDX (SES25) células embrionárias. Barra de escala é 5 mm. C. imagem de um FDX culta (SES25) ASER neurônio microscopia de fluorescência. As imagens foram tiradas com um microscópio Olympus BX61 equipado com uma câmera digital. D. experiência Representante testar a viabilidade da cultura, idade sincronizados, ASER neurônios. As células foram obtidas a partir de embriões DA1262 (círculos vazios) ou (SES25) embriões FDX mantidas na ausência / presença de 300 ng / ml de Q-VD-Oph (quadrados vazios e cheios, respectivamente). O desaparecimento da fluorescência da GFP foi usado como uma medida de viabilidade de um neurónio. O experiment começou com ~ 300 neurônios ASER fluorescentes. Viabilidade foi calculada como 100 * (número de células fluorescentes no dia X dividido pelo número de células fluorescentes no dia 1). Clique aqui para ver a figura maior .
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Discussion
Aqui nós descrevemos uma abordagem combinada, para estudar aspectos celulares e moleculares da amylopathies usando C. elegans. As vantagens dessa abordagem incluem: 1.) De baixo custo C.elegans é mantido no prato normal de Petri semeadas com bactérias, à temperatura ambiente. 2) genética poderosas. Os animais transgénicos podem ser obtidos em alguns meses, e uma grande variedade de sequências de promotor está disponível para conduzir a expressão do gene desejado em neurónios específicos. 3) bem caracterizado, o sistema Simples, nervoso. C. elegans possui um sistema nervoso extremamente simples (302 neurônios). Essa simplicidade tem proporcionado ampla caracterização do sistema nervoso do worm, incluindo linhagem de células, a função / papel específico de cada neurônio e suas conexões sinápticas. As limitações de C. elegans incluem o pequeno tamanho das células, o que dificulta a aplicação de técnicas bioquímicas convencionais, tais como imuno-histoquímica e de uma pele grossa (cutícula) que isola neunios formar o ambiente externo. Assim, as abordagens farmacológicas podem ser de uma eficácia limitada em C. elegans. culturas de células primárias representam uma estratégia válida para melhorar parcialmente este problema.
As etapas críticas nestes protocolos experimentais incluem começando com grandes quantidades de vermes e monitorar os preparativos, a fim de não perder os ovos, os embriões etc. Também é crucial para aprender a lidar com os animais durante a injeção. Mantendo vermes na almofada de agarose demasiado longo, perfurando-os com uma pipeta ou injecção grande demais mistura de ADN pode irreversivelmente danificar. Expressão Eficiência da transformação, reprodutibilidade e transgene pode variar. A eficiência está relacionada com a pureza da mistura de injecção e a sua composição (presença de DNA não codificante). Matrizes extracromossómico variar de animal para animal, por conseguinte, que é fundamental para estabelecer, pelo menos, 2-3 linhas independentes por transgene. Por outro lado, a adição de digeridoADN genómico na mistura representa uma estratégia válida para reduzir a sobre-expressão transgénica. Ensaios de quimiotaxia são relativamente livre de problemas. No entanto, é crucial para manter a consistência no gradiente de concentração, a fim de evitar resultados falsos. Use pedaços de agar do mesmo tamanho, por exemplo, cortá-los com uma pipeta de Pasteur e manter o tempo de equilíbrio constante. Se houver, remover o excesso de solução com um cotonete.
Em conclusão, aqui nós fornecemos um exemplo de como um organismo simples, geneticamente tratável pode ser explorado para investigar aspectos moleculares da amylopathies. As mesmas técnicas experimentais poderia ser aplicada ao estudo de outras proteínas neuronais e para a geração de novos modelos animais de doença.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. NGM | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 3 g |
| Bacteriological agar | AMRESCO | J637 | 17 g |
| Bacto-peptone | AMRESCO | J636 | 2.5 g |
| Distilled Water | Bring to 975 ml | ||
| Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well | |||
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 1 ml of 1 M stock |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C3045 | 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol) |
| Potassium phosphate buffer | 25 ml of 1M stock | ||
| 2. Potassium phosphate buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 108.3 g |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | 35.6 g |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 3. M9 buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 3 g |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | 6 g |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 5 g |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm) | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 118 mM |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | 48 mM |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 2 mM |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | 2 mM |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | 25 mM |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 5. CM-15 | |||
| L-15 culture medium | Gibco | 11415 | 450 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | 50 ml |
| Penicillin | Gibco | 15140 | 50 units/ml |
| Streptomycin | Gibco | 15140 | 50 g/ml |
| Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C | |||
| 6. Other Reagents | |||
| Halocarbon 700 oil | Halocarbon Products | 9002-83-9 | |
| 5 μm Acrodisc Syringe Filter | PALL Co. | 4199 | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-5UN | |
| Lectin (peanut) | Sigma-Aldrich | L0881-10MG | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S320 | |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
References
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