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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

La Published: May 17, 2013 doi: 10.3791/50435
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Robert Wood Johnson Medical School, University of Medicine and Dentistry of New Jersey

Summary

Se describen métodos para estudiar los aspectos de la amylopathies en el gusano

Abstract

Amylopathy es un término que describe la síntesis y la acumulación anormal de la proteína beta amiloide (Aß) en los tejidos con el tiempo. Aß es un sello distintivo de la enfermedad de Alzheimer (EA) y se encuentra en la demencia con cuerpos de Lewy, la miositis de cuerpos de inclusión y la angiopatía amiloide cerebral 1-4. Amylopathies desarrollan progresivamente con el tiempo. Por esta razón organismos simples con periodos de vida cortos pueden ayudar a dilucidar los aspectos moleculares de estas condiciones. A continuación, se describen los protocolos experimentales para el estudio de la neurodegeneración mediada por Aß usando el gusano Caenorhabditis elegans. Así, construimos gusanos transgénicos mediante la inyección de ADN que codifica Aß humano 42 en las gónadas sincitial de adultos hermafroditas. Líneas transformantes se estabilizan mediante una integración mutagénesis inducida. Los nematodos son la edad sincronizado mediante la recolección y la siembra de sus huevos. La función de las neuronas que expresan Aß 42 se prueba en ensayos de comportamiento oportunos (ensayo de quimiotaxiss). Cultivos neuronales primarios obtenidos a partir de embriones se utilizan para complementar los datos de comportamiento y para probar los efectos neuroprotectores de los compuestos anti-apoptóticas.

Introduction

Beta amiloide (Aß) es un péptido de 36-43 aminoácidos que se forma después de la escisión secuencial de la proteína precursora de amiloide (APP) por β y γ secretasas 1. La secretasa γ procesa el extremo C-terminal del péptido Aß y es responsable de sus longitudes variables 5. Las formas más comunes de Aß son Aß 40 y Ap 42, siendo esta última más comúnmente asociado a condiciones patológicas tales como 5 AD. A altas concentraciones de Aß forma β-hojas que se agregan para formar fibrillas amiloides 6. Depósitos de fibrillas son el principal componente de las placas seniles que rodean las neuronas. Ambas placas y difusibles, oligómeros Aß no la placa, se cree que constituyen las formas patogénicas subyacentes de Aß.

El estudio de laboratorio de amylopathies neuronales se complica por el hecho de que estas condiciones de progreso con el tiempo. Por lo tanto, es IMPORTANTESt para el desarrollo de animales genéticamente manejable modelos complementarios a los ratones-con vida corta. Estos modelos se pueden utilizar para elucidar aspectos específicos de amylopathies-típicamente celular y molecular y en virtud de su simplicidad, para ayudar a capturar la esencia del problema. El gusano Caenorhabditis elegans cataratas es esta categoría. Tiene una vida corta, ~ 20 días y, además, los procesos celulares básicos como la regulación de la expresión génica, el tráfico de proteínas, la conectividad neuronal, sinaptogénesis, la señalización celular y la muerte son similares a los mamíferos 7. Las características únicas del gusano incluyen la genética de gran alcance y la falta de un sistema de vasos, lo que permite estudiar el daño neuronal independientemente del daño vascular. Por otro lado, la falta de un cerebro limita el uso de C. elegans para estudiar muchos aspectos de la neurodegeneración. Además, la reproducción y la identificación de las distribuciones anatómicas de las lesiones no se pueden realizar en este organismo. Otro límiteciones incluyen la dificultad para evaluar tanto las diferencias en los perfiles de expresión génica y alteraciones de la conducta compleja y la función de la memoria. A continuación se describen los métodos para generar C. modelos elegans de amylopathies.

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Protocol

1. Construcción de gusanos transgénicos

  1. Transformación.
    1. Preparar almohadillas de inyección. Coloque una gota de caliente, 2% de agarosa disuelta en agua, sobre un cubreobjetos de vidrio. Colocar rápidamente un segundo cubreobjetos sobre la gota y golpee suavemente ella. Después de la agarosa se ha solidificado, cubreobjetos diapositivas aparte, y hornear el cubre-pad en un horno de vacío a 80 º CO / N.
    2. Tire de pipetas. Utilizamos un P-97 Extractor Sutter tirar 1/0.5 mm OD / ID capilares de borosilicato con filamento. Las pipetas se forjan con punta cerrada que se rompe abierto en una etapa posterior.
    3. Prepare la mezcla de inyección. Hacer la mezcla de inyección que contiene el ADN de interés (20 ng / l por construcción) más ADN de plásmido vacío a una concentración final de 150 ng / l. Centrifugar la mezcla de inyección para eliminar cualquier contaminante. Este paso es crucial, ya que los contaminantes reducen la eficiencia de transformación. Transferir el 5 l superior (escombros y otros contaminantes se acumulan en la parte inferior) a un tubo nuevo de be utilizada en la inyección.
    4. Cargar la mezcla de inyección por capilaridad. La parte inferior de la pipeta se sumerge en la mezcla de inyección. Típicamente 0,5 l son suficientes para inyectar 100 gusanos.
    5. Cargar pipeta de inyección. Inserte la pipeta en el soporte del micromanipulador y lo rompiera abierto por el roce de la punta contra el borde de una hoja de cubierta montada en un portaobjetos de vidrio o alternativamente contra los desechos en la plataforma de agarosa. Este es un paso crucial como consejos muy grande el daño del gusano y demasiado pequeños consejos se obstruyen fácilmente. La calidad de la punta rota puede ser juzgado por la forma y lo más importante por la tasa de flujo. La velocidad de flujo se puede evaluar por el tamaño de las burbujas que fluyen desde la punta abierta inmerso en una gota de aceite de halocarbono 700 en respuesta a una presión de inyección.
    6. Traslado gusanos para rellenar inyección. Ponga una gota de aceite de hidrocarburo halogenado 700 en una plataforma de inyección y transferir varios (1 o 2 para principiantes) gusanos para el aceite. Utilice un gusano recoger a empujar los gusanos hacia abajo sobre la almohadilla hasta que lay se adhieren a la agarosa. Los gusanos deben estar orientadas en filas con lados ventrales en la misma dirección. Evite tocar la cabeza del gusano. Si después de varios intentos de los gusanos no se adhieren a la almohadilla, reemplazar con una almohadilla fresca o aumentar agarosa espesor y / o concentración.
    7. Inserte la pipeta en el gusano. Al mover la etapa, colocar el gusano debajo de la pipeta. Coloque la pipeta en el núcleo central de la gónada porque su citoplasma es compartida por muchos núcleos de células germinales. Esto aumenta la probabilidad de entregar ADN inyectado a muchos progenie. La pipeta debe estar casi en paralelo al tornillo sin fin (~ 15 ° -25 ° de ángulo). Empuje verticalmente la punta de la pipeta hacia abajo el cuerpo del gusano hasta que se presiona la piel. A continuación, toque suavemente en el manipulador para inducir la inserción de la punta. Para obtener los mejores resultados inyectar ambas gónadas.
    8. Se inyecta la solución de ADN. Aplique presión sobre la pipeta hasta que las olas gónadas. Detener el flujo y tire el gusano de la pipeta. Prueba de la aguja para el flujo y luego pasara la siguiente gusano y etapas de inyección de repetición.
    9. Recuperar los gusanos: Añadir una gota (~ 10 l) de tampón de recuperación en los gusanos y se incuba hasta que los gusanos comienzan a nadar. Añadir un volumen igual de M9, espere hasta que los gusanos reanudar natación y repetir varias veces hasta que la solución es principalmente M9. Transferir individualmente gusanos de placas sembradas.
  2. Integración.
    1. Coloque 40 sanos, bien alimentados, L4 gusanos en un plato fresco
    2. Irradiar con γ-ray con 4.000 rads de 40 min. Traslado gusanos irradiados (P0), en placas sembradas OP50 frescas (4 gusanos / placa). Los gusanos, alternativamente, pueden ser irradiados con una dosis de 300 J / m 2 UVs.
    3. Traslado 10-20 transformantes F1 de cada placa para placas individuales, etiquetar las placas con el correspondiente origen P0.
    4. Individual a cabo 2-4 transformantes F2 para cada F1 para placas separadas. Comprobar la progenie F3 para la transmisión de 100% del marcador de transformación. Por lo general, el 1-3% de la progenie de un wil gusano irradiadoTengo un evento de integración.
    5. Hacer existencias de tres o más líneas transformantes independientes.

2. Los ensayos de comportamiento

  1. Edad-sincronización.
    1. Crecer gusanos en estándar 10 cm placas NGM + OP50 E. coli hasta una gran población de adultos grávidas se alcanza (3-5 días).
    2. Recoja los gusanos en tubos Falcon de 50 ml de suspensión en 1 ml de tampón M9.
    3. Añadir 5 ml de tampón M9 y se centrifuga a 450 g durante 3 min. Desechar el sobrenadante. Repita 3-4x.
    4. Al final de la última centrifugación, eliminar el sobrenadante y añadir 10 volúmenes de solución de hipoclorito básica (NaOH 0,5 M, 1% de hipoclorito recién mezclado) a los gusanos sedimentadas. Incubar a temperatura ambiente durante ~ 10 min. La reacción de lisis se puede controlar mediante la colocación de una gota de la reacción de lisis en un cubreobjetos y el examen de los gusanos bajo un microscopio. Cuando más o menos 80% de los gusanos están rotos la reacción debe ser detenido.
    5. Detenga la reacción de lisis por complementog el mismo volumen de tampón de huevo estéril.
    6. Recoger los huevos (y canales) por centrifugación a 450 xg durante 5 min.
    7. Lavar los huevos con tampón estéril huevo 2-3x.
    8. Incubar los huevos O / N en tampón M9 y sembrarlos en placas NGM estándar.
  2. Ensayo de quimiotaxis.
    1. Prepare varias piezas de agar aproximadamente 0.5x0.5x0.5 cm. Depositamos el agar en una placa de 10 cm y cortamos los trozos de agar a partir de ahí.
    2. Remojar el trozo de agar en una solución que contiene el atrayente deseada (en concentraciones saturantes, cerca-saturantes) durante 2 horas. Atrayentes típicos son lisina (0,5 M), biotina (0,2 M).
    3. Depositar un trozo de agar en una placa de ensayo de 10 cm en la que se han marcado la ubicación de un punto de prueba y un punto de control (Figura 1A). Permitir equilibración y la formación de un gradiente de O / N (Figura 1B). Preparar 5 placas para un solo experimento.
    4. Antes del experimento añadir 10 l de 20 mM NaN 3 (anesthetic) para cada punto.
    5. Coloque 20 gusanos edad sincronizados en el centro de la placa. Colocar la placa en la incubadora a 20 ° C.
    6. Después de 1 hora, contar los animales en los puntos de prueba / control y calcular el índice de quimiotaxis (CI) de la siguiente manera: Ecuación 1 donde N, test N y N Cnt., indican que el número total de animales, el número de animales en el área de análisis y el número de animales en el punto de control.

3. Primaria embrionarias de cultivo celular

  1. Lyse gusanos como se describe en la edad de sincronización.
  2. Detener la reacción mediante la adición de lisis el mismo volumen de tampón de huevo estéril y se centrifuga a 450 xg durante 5 min. Deseche con cuidado el sobrenadante, teniendo cuidado de no perder los huevos sedimentadas. Repita 2 a 3 veces o hasta que sobrenadante quede claro.
  3. Resuspender pellet (huevos y cadáveres) En 2 ml de tampón de huevo estéril y añadir 2 ml de sacarosa al 60% estéril en tampón de huevo. Mezclar esta solución hasta que los huevos se resuspendieron completamente (ya que tienden a formar grumos bajo centrifugación) a mano o por agitación.
  4. Centrifugar a 450 xg durante 15 min.
  5. Transferir cuidadosamente el sobrenadante (que contiene los huevos) a un tubo estéril. Descartar sedimento que contiene canales y otras sub-productos de la lisis.
  6. Retire sacarosa residual mediante resuspensión en tampón de los huevos de huevo y centrifugación a 450 xg durante 5 min. Recoger con cuidado y desechar el sobrenadante. Repita 3 veces.
  7. Bajo una campana laminar resuspender huevos sedimentadas en tampón de huevo estéril que contiene 1 U / ml quitinasa a temperatura ambiente para digerir las cáscaras de huevo. Después de 30 min empieza a controlar la reacción (bajo un microscopio de cultivo de células invertida). Cada lote de quitinasa tiene una actividad ligeramente diferente. Típicamente, la digestión se completó en 1 hr.
  8. Cuando aproximadamente 70-80% cáscaras de huevo son digeridos por quitinasa complemento CM-15 (L-15 de cultivo celular medio que contiene 10% de suero bovino fetal, 50 U / ml de penicilina, y 50 mg / ml de estreptomicina). Disociar las células utilizando una jeringa con un calibre de 27. Se filtra la suspensión de células con un filtro de 5,0 micras para eliminar embriones intactos, grupos de células y larvas.
  9. Pellet la suspensión de células disociadas por centrifugación a 450 xg durante 15 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 15-CM medio de cultivo celular.
  10. Células disociadas Plate sobre cubreobjetos de vidrio previamente revestidas con lectina de cacahuete (0,1 mg / ml) disuelto en agua Nota:. Células deben adherirse al sustrato con el fin de diferenciar.
  11. Las células se pueden mantener a temperatura ambiente (16-20 ° C) en aire durante más de 2 semanas.

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Representative Results

Con nuestros protocolos se estudian los efectos de los humanos Aß 42 oligómero en la función neuronal 8. Un fragmento que codifica Aß humano 42 y la secuencia de codificación del péptido señal artificial de fuego vector de pPD50.52 se amplificó a partir constructo PCL12 9 usando cebadores que introdujeron un Sma 1 sitio de endonucleasa de restricción en los extremos. El fragmento se inserta en un constructo que contiene un FLP-6 secuencia del promotor de 2481 pb en el vector de fuego pPD95.75 entre el único sitio Sma 1 10. Utilizando las técnicas de transformación descritas en el protocolo 1 se construyó un gusano transgénico que expresa Aß 42 en las neuronas ASE (cepa FDX (ses25)) 8. Con motivo de los transformantes positivos se utilizó el periodista gcy P-5 :: GFP que impulsa específicamente la expresión de GFP en el derecho ASE (ASER) neuronas 11. Los gusanos se adhieren a la plataforma ya la agarosa seca absorbe el agua. Por lo tanto, es crusocial que los animales se colocan en la almohadilla de la inyección y se inyecta de forma relativamente rápida, porque de lo contrario desecar y morir. El porcentaje de la progenie F1 que lleva una matriz de extracromosómico transmisible puede variar. Los valores típicos están en el rango de 3-7%. Es importante que la combinación de inyección (1.1.3) no contiene ADN que codifica compartir homología de secuencia con el ADN transgénico (por lo general vector vacío) porque los ADN se someten a recombinación homóloga entre sí. Sin embargo, si la sobreexpresión del transgen es un problema de la mezcla de inyección debe ser complementado con 50-100 ng / l de ADN genómico digerido con Sca 1. Neuronas ASE detectar atrayentes solubles en agua tales como la biotina y por lo tanto su función pueden ser evaluados en ensayos de comportamiento (ensayo de quimiotaxis, protocolo 2 y las Figuras 1A y 1B) 12. En un experimento típico, hemos probado siete días de edad gusanos que expresan P gcy-5 :: GFP solo (DA1262 cepa) o con Aß 42 (FDX (ses25)) para losquimiotaxis a la biotina. En los gusanos jóvenes (3-4 días de edad) los efectos de la expresión Aß 42 son modestas, pero ya detectable (~ 10% de disminución en el índice de quimiotaxis, ver ref. 8). Los resultados representativos de este experimento se muestran en las Figuras 1C y 1D. La mayoría DA1262 gusanos se encuentran en, o cerca, el lugar atrayente (Figura 1C). Por el contrario sólo unos gusanos que expresan Aß 42 pueden encontrar el lugar atrayente (Figura 1D). Hemos probado 100 animales / genotipo distribuidos en 5 placas de ensayo / genotipo obtención de un índice de quimiotaxis para la biotina 0,68 ± 0,09 y 0,12 ± 0,04 para DA1262 y FDX (ses25), respectivamente. Gusanos activas se recogieron individualmente y se transfieren al centro de la placa de ensayo. Es importante no sólo rápidamente, sino también transferir suavemente los gusanos porque de lo contrario pueden permanecer inactivos durante varios minutos y no pueda seguir el atrayente. Al final del experimento, se aconseja un monitor de gusanosctividad examinado sus caminos. Si sólo unas pocas pistas son visibles solemos descartar la placa.

La fluorescencia de GFP en las neuronas de ASER (ses25) gusanos FDX desaparece dentro de los primeros once días de vida (no se muestra). Esto sugiere que estas células se someten a la apoptosis debido a la presencia de Aß 42. Por lo tanto, se determinó si un inhibidor de amplio espectro de la apoptosis tales como caspasa inhibidor de N-(2-quinolil) valil-aspartil-(2,6-difluorofenoxi) metil cetona (Q-VD-OPh) 13 podría detener la pérdida de células ASER . Para ello se emplearon cultivos de neuronas ASER primarios de embriones 14, que se prepararon como se describe en el protocolo 3. Imágenes representativas de una neurona ASER en un joven (4 días de edad) FDX (ses25) gusano junto con las imágenes de las neuronas en cultivo se muestran en las Figuras 2A-C. ASER células cultivadas fueron de corta duración (Figura 2D). Como se esperaba incubación con 0,3 mg / ml de Q-VD-OPh recién complementado diaria, c ompletely dejado de la pérdida de neuronas ASER fluorescentes. Cuando se trabaja con las neuronas primarias en cultivo es importante para mantener una densidad celular oportuno. Este parámetro depende principalmente del número de gusanos utilizados para extraer los huevos. Medimos la densidad de las células con un hemocitómetro estándar y tomar especial cuidado para mantener constante del cultivo de células de cultivo de células de la densidad celular. Para los experimentos farmacológicos, tales como los descritos aquí trabajamos con ~ 200.000 células / cm 2 que se obtuvo por la recolección de cuatro placas de 10 cm confluentes. Las células se sembraron en 12 pocillos de una placa de 24 pocillos. Para obtener resultados óptimos, también es importante para disociar las células embrionarias antes de la siembra, ya que tienden a formar grumos. Utilizamos una jeringa con una aguja de calibre 27 y la alta burguesía aspiran la suspensión de ida y vuelta un par de veces. Esto es generalmente suficiente para disociar la mayoría de las células (sobre todo al principio, se aconseja revisar la suspensión bajo un microscopio).

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Figura 1. Ensayo de quimiotaxis. A. placa de quimiotaxis Representante. Manchas Attractant (biotina) y el control se marcan con un hueco y un círculo relleno. B. Una placa de quimiotaxis cargado con una pieza diámetro de 0,5 cm de agar utilizado para establecer un gradiente de biotina. La pieza de agar se corta de una placa de 10 cm usando el lado superior de una pipeta Pasteur de vidrio. C. distribución representativa de los gusanos de todo el punto atrayente. En este ejemplo, la mayoría de los DA1262 gusanos fueron capaces de localizar la fuente de atrayente (biotina). D. Como en C durante FDX (ses25) gusanos. Estos gusanos biotina no sensibles mostraron una distribución dispersa alrededor de la placa, y sólo unos pocos fueron encontrados cerca del lugar atrayente.

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Figura 2. Cultura de C. A. Imagen de microscopía de fluorescencia (foto izquierda) y de luz brillante (foto de la derecha) de las células embrionarias elegans. tomadas de un (ses25) la cabeza del gusano transgénico FDX. B. imagen de luz brillante de una cultura de FDX (ses25) células embrionarias Este gusano expresa GFP en la neurona ASER impulsado por el promotor gcy-5.. Barra de escala es de 5 m. C. Imagen de microscopía de fluorescencia de una FDX culta (ses25) ASER neurona. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio Olympus BX61 equipado con una cámara digital. D. experimento representativo probar la viabilidad de cultivo, la edad sincronizadas, las neuronas ASER. Las células se obtuvieron a partir de embriones DA1262 (círculos huecos) o (ses25) FDX embriones se mantienen en la ausencia / presencia de 300 ng / ml de Q-VD-Oph (cuadrados huecos y rellenos, respectivamente). La desaparición de la fluorescencia de GFP se utilizó como una medida de la viabilidad de una neurona. El exexperimento comenzó con ~ 300 neuronas ASER fluorescentes. La viabilidad se calcula como 100 * (número de células fluorescentes en día X dividido por el número de células fluorescentes en el día 1). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

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Discussion

Aquí se describe un enfoque combinado, para estudiar los aspectos celulares y moleculares de amylopathies utilizando C. elegans. Las ventajas de este enfoque incluyen:. 1) bajo costo C.elegans se mantiene en la placa de Petri normal de sembrado con bacterias, a temperatura ambiente. 2) genética potentes. Los animales transgénicos pueden obtenerse en pocos meses y una amplia gama de secuencias de promotor está disponible para conducir la expresión del gen deseado en las neuronas específicas. 3), bien caracterizado, el sistema nervioso simple. C. elegans posee un sistema nervioso muy simple (302 neuronas). Esta simplicidad ha proporcionado una amplia caracterización del sistema nervioso del gusano incluyendo linaje celular, la función específica / papel de cada neurona y sus conexiones sinápticas. Las limitaciones de C. elegans incluyen el pequeño tamaño de las células, lo que dificulta la aplicación de técnicas bioquímicas estándar, tales como inmunohistoquímica y una piel gruesa (cutícula) que aísla neurons forman el medio ambiente externo. Por lo tanto, los enfoques farmacológicos pueden ser de una eficacia limitada en C. elegans. Los cultivos de células primarias representan una estrategia válida para mejorar parcialmente este problema.

Los pasos críticos en estos protocolos experimentales incluyen a partir de grandes cantidades de gusanos y supervisar los preparativos con el fin de no perder los huevos, embriones, etc. También es fundamental para aprender a manejar los animales durante la inyección. Mantener los gusanos en la plataforma de agarosa demasiado tiempo, la perforación con una gran pipeta o inyectar demasiada mezcla DNA irreversible puede dañarlos. Eficacia de la transformación, reproducibilidad y la expresión del transgen puede variar. La eficiencia está relacionada con la pureza de la mezcla de inyección y su composición (presencia de ADN no codificante). Extracromosómicos arrays varían de un animal a otro por lo que es fundamental establecer por lo menos 2-3 líneas independientes por transgenes. Por otro lado, la adición de digeridoADN genómico a la mezcla representa una estrategia válida para reducir la sobre-expresión transgénica. Ensayos de quimiotaxis son relativamente libre de problemas. Sin embargo, es crucial para mantener la consistencia en el gradiente de concentración con el fin de evitar resultados falsos. Utilice pedazos de agar del mismo tamaño-por ejemplo cortar con una pipeta Pasteur, y mantener constante el tiempo de equilibrio. En su caso, eliminar el exceso de solución con un hisopo de algodón.

En conclusión, aquí le ofrecemos un ejemplo de cómo un organismo simple, manejable de forma genética puede ser explotado para investigar aspectos moleculares de amylopathies. Las mismas técnicas experimentales podrían aplicarse al estudio de otras proteínas neuronales y para la generación de nuevos modelos animales de la enfermedad.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. NGM
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 3 g
Bacteriological agar AMRESCO J637 17 g
Bacto-peptone AMRESCO J636 2.5 g
Distilled Water Bring to 975 ml
Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 1 ml of 1 M stock
Cholesterol Sigma-Aldrich C3045 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)
Potassium phosphate buffer 25 ml of 1M stock
2. Potassium phosphate buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 108.3 g
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 35.6 g
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
3. M9 buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 3 g
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S5136 6 g
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 5 g
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 118 mM
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 48 mM
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 2 mM
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M4880 2 mM
HEPES Fisher Scientific BP310 25 mM
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
5. CM-15
L-15 culture medium Gibco 11415 450 ml
Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028 50 ml
Penicillin Gibco 15140 50 units/ml
Streptomycin Gibco 15140 50 g/ml
Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C
6. Other Reagents
Halocarbon 700 oil Halocarbon Products 9002-83-9
5 μm Acrodisc Syringe Filter PALL Co. 4199
Chitinase Sigma-Aldrich C6137-5UN
Lectin (peanut) Sigma-Aldrich L0881-10MG
Sodium hydroxide Fisher Scientific S320
Lysine Sigma-Aldrich L5501
Biotin Sigma-Aldrich B4639
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sucrose Sigma-Aldrich S0389

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References

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La<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para el Estudio Amylopathy
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Duan, Z., Sesti, F. A… More

Duan, Z., Sesti, F. A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study. J. Vis. Exp. (75), e50435, doi:10.3791/50435 (2013).

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