Vi beskriver förfarandet och dataanalys av en kemisk screening system för glukokortikoid stresshormon signalering med hjälp av zebrafisk larver: glukokortikoid Responsive In vivo Zebrafish luciferasaktivitet (GRIZLY) analys. Analysen känsligt och specifikt upptäcker effekter på glukokortikoid signalering av föreningar som kräver metabolization eller påverkar endogen glukokortikoid produktion.
Glukokortikoid stresshormoner och deras konstgjorda derivat används ofta läkemedel för behandling av inflammation, men långvarig behandling med glukokortikoider kan leda till allvarliga biverkningar. Testsystem behövs för att söka efter nya substanser som påverkar glukokortikoid signalering in vivo eller för att bestämma oönskade effekter av föreningar på glukokortikoid signalväg. Vi har etablerat en transgen zebrafisk analys vilken tillåter mätningen av glukokortikoid aktivitet signalering in vivo och i realtid, den GRIZLY assay (Glukokortikoid Responsive In vivo Zebrafish luciferasaktivitet). Luciferas-baserad analys detekterar effekter på glukokortikoid-signalering med hög känslighet och specificitet, inklusive effekter genom föreningar som kräver metabolisering eller påverkar endogen glukokortikoid produktion. Vi presenterar här ett detaljerat protokoll för kemikaliefri skärmar med denna analys. Vi beskriver datainsamling, normalisering ochanalys, placera fokus på kvalitetskontroll och datavisualisering. Analysen ger en enkel, tidsupplöst och kvantitativ avläsning. Den kan drivas som en fristående plattform, men är också lätt integreras i high-throughput screening arbetsflöden. Det möjliggör dessutom för många tillämpningar utanför kemisk screening, såsom kontroll av hormonstörande ämnen eller stress miljöforskning.
Glukokortikoider (GCS) är steroidhormoner som produceras av binjuren, som spelar en viktig roll under stress och i regleringen av ämnesomsättningen 1. GC binder cytoplasmiska glukokortikoidreceptorer (GRS) av den nukleära receptorsuper som, vid bindning, translocate in i kärnan 2. Här kan de exempelvis trycka transkription genom att störa andra transkriptionsfaktorer (transrepression) eller aktivera gentranskription via glukokortikoid responselement (gres, trans). På grund av sina antiinflammatoriska egenskaper, är både naturliga och konstgjorda GC ofta används läkemedel för behandling av en rad sjukdomar, som astma eller artrit 3. Däremot kan speciellt långvarig användning av GC leda till allvarliga biverkningar, inklusive diabetes och glaukom 4. Därför är nya substanser som GC signalering med potentiellt mer gynnsam behandling effektivitet och tolerabilitet traktade akteruter. Viktigt kan ligand effekter som observerats i odlade celler skiljer sig från de som ses in vivo 5. Sådana effekter kan partiskhet resultat som erhållits med konventionella cellkultur baserad läkemedelsscreeninganalyser. Kemisk in vivo-screening som möjliggörs av den zebrafisk modell har nyligen kommit i fokus, eftersom den gör det möjligt att bestämma effekter ej finnas i cellodling 6,7.
Hormonella signalvägar kan också påverkas av miljöföroreningar. Så kallade hormonstörande kemikalier (EDC) påverkar olika hormonreglerade processer 8. Således kan fortplantning och sexuell differentiering av vattenlevande organismer moduleras av ämnen med östrogenliknande aktiviteter. Nyligen har framförts att metabola sjukdomar kan kopplas till EDCs i miljön 9. En väg måltavla för sådana "metabolisk störning" är glukokortikoid vägen, vilket också har varit inblandad i xenoantibiotika effekter på utveckling och immunförsvaret 10,11. Men jämfört med den stora mängd information som finns tillgänglig på föreningar som stör könssteroidhormon handling, relativt lite känt om hormonstörande effekter som förmedlas via GR. Därför är verktyg som behövs som tillåter övervakning av förorenande effekter på GC-signalering in vivo.
Den zebrafisk har länge varit en populär modell i utvecklingsbiologi och har på senare tid även lockat forskare från andra områden, inklusive endokrinologi 12. Jämfört med andra teleosts är systemet av zebrafisk GC signalerings mer liknar den hos däggdjur, eftersom zebrafisk-genom endast innehåller en GR-gen i motsats till de duplicerade receptorer i många andra fiskarter 13-15. Dessutom är hypotalamus-hypofys-binjure-axeln redan funktionella i 5 dygn gammal zebrafisk larver, vilka ökar endogen GC-produktion som svar på stressfaktorer 14,16-18.
Vi har nyligen genererat en transgen zebrafisk linje, GRE: Luc, som möjliggör övervakning av GC-signaleringsaktivitet in vivo och i realtid 18. Linjen uppbär en luciferasrapportörgen konstrukt under kontroll av en minimal TATA-box-promotorn och fyra concatemerized GRE (Figur 1A). GC inducerad bioluminiscens kan mätas från enstaka GRE: Luc larver i 96 väl mikrotiterplattor in vivo under längre perioder. Denna GRIZLY analys (för "Glukokortikoid Responsive In vivo Zebrafish luciferasaktivitet") kan användas inom en rad olika forskningsområden, såsom stress forskning, miljöövervakning, och farmakologiska skärmar 18. Vi kunde upptäcka den endogena ökningen av kortisol efter osmotisk stress från enstaka larver och kunde följa mognaden av svaret under utveckling. Dessutom kan vi övervaka effekterna på GC signalering av tennorganiskas som kräver metabolization av larven. Viktigt linjen kunde upptäcka dessa effekter på miljömässigt relevanta koncentrationer. Slutligen, i en pilot skärm analysen känsligt och specifikt detekterade föreningar med GC aktivitet från ett kemiskt bibliotek, däribland en förening som stimulerade endogen kortisolproduktion i larverna. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för kemiska skärmar använder GRIZLY assay.
Vi presenterar här arbetsflödet och dataanalys för en kemisk skärm som mäter GC-aktivitet in vivo med hjälp av GRIZLY analys 18. Analysen har kvalitetskontroll egenskaper och prestanda åtgärder som är jämförbara med konventionella cell baserade skärmar, en viktig fördel för dess användning i hög genomströmning inställningar. Dessutom, dock känner vivo-analysen i också föreningar som inte är tillgängliga för in vitro-skärmar. Detta exemplifieras av närvaron av prohormon pregnenolon bland träffarna. Således sträcker sig GRIZLY assay omfattningen av skärmar som syftar till GC signaleringsaktivitet.
Vikten av att upptäcka in vivo-effekter med vår analys illustreras också av resultat vi erhållits med tennorganiska föroreningar DBT och TBT 18. DBT, men inte TBT, har visats inhibera GC-signalering i däggdjurscellkultur, och vi observerade samma i zebrafisk cellkulturer uttryckaning GRE: Luc reporter. Viktigt är emellertid i GRIZLY assay TBT uppvisade inhibitorisk aktivitet på GC-vägen, eftersom den kan omvandlas till DBT genom larv metabolism. Denna hämning redan observerats vid miljömässigt relevanta koncentrationer av TBT. Dessa resultat visar vidare potentialen i GRIZLY analysen att upptäcka sammansatta effekter som bygger på interorgan överhörning och metabola förändringar hos föreningarna i det levande djuret. De belyser också tillämpningen potential GRIZLY analysen för miljöövervakning. Sålunda kan hormonstörande effekter studeras vid nivån för receptorsignalering, där disruptor stör GC signaleringsaktivitet som induceras av en GR-agonist, såsom dexametason. En annan möjlighet är att studera sammansatta effekter på pregnenolon stimulerad GC-syntes. Den höga genomströmning kvalitet hos analysen bör tillåta snabb screening av bibliotek miljöprov.
Användningen av luciferas som areporter genen tillåter en hög dynamiska området för detektering av signaleringsaktivitet 23. Faktum är att känsligheten hos analysen är det möjligt att detektera osmotisk stressinducerad GC produktion från enkelt larver 18. Den höga tidsupplösning uppnås med luciferas reporter tillåter oss att följa signalverksamhet över tid, vilket gör det möjligt att också analysera kinetik datan.
En potentiell nackdel för vissa tillämpningar är det begränsad lämplighet för fysisk övervakning av denna reporter systemet. Fluorescerande reportersystem kan vara bättre lämpad för analyser som kräver övervakning av vissa delar av larver. Dock kan sådana analyser lider av lägre känslighet på grund av bakgrundseffekter som orsakas av exciteringsljuset, som också utgör gränserna för detektion av fluorescerande föreningar. Dessutom kan de ge mindre kinetisk upplösning på grund av den generellt högre stabilitet av fluorescerande proteiner 23.Dessutom presenterar de utmaningar i form av bildutrustning, dataanalys och datalagring som kan begränsa deras användning för mindre forskningslaboratorier.
Upplägget av GRIZLY analysen som en mikrotiterplatta baserad analys möjliggör enkel integrering i typiska screening arbetsflöden. Analysen är lätt applicerbar även i mindre forskningslaboratorier på grund av dess enkla hantering och dataanalys. Samtidigt möjliggör det en hög grad av automatisering, t.ex. automatiserad läkemedelsansökan genom att pipettera robotar eller automatiserad distribution av embryon från embryo sorteringsanordningar 24,25. Den enkla avläsning kräver inte automatiserade screening mikroskop eller avancerad bildanalys programvara, men ändå ger en rik uppsättning av uppgifter om tidsmässiga och kvantitativa aspekterna av den studerade signalväg.
Sammanfattningsvis presenterar vi en steg-för-steg-protokoll för en relativt billig, robust och enkel att hantera kemiska screeninganalys för GCsignaleringsaktivitet in vivo och i realtid. Analysen gör det möjligt att bestämma in vivo-effekter av föreningar på GC signalering inte kan spåras i cellodling baserade analyser. Bland de många applikationer för analysen är t.ex. bestämning av genetiska effekter på glukokortikoid signalering, kontroll av hormonstörande effekter på glukokortikoid syntes och signalering aktivitet miljön, och screening av föreningar för oönskade effekter på GC-signalering eller för romanen in vivo modulatorer av detta viktig signalväg.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar S. Burkhart, C. Hofmann och Simone Gräßle för utmärkt tekniskt bistånd och är tacksamma för M. Ferg för hjälp med dataanalys. Vi tackar också S. Rastegar för kritiska synpunkter på manuskriptet. Vi erkänner finansiering från Studienstiftung des deutschen Volkes (till MW), DFG (DI913/4-1) och Helmholtz Program Biointerfaces på SATS.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Buffer composition + reagents | |||
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Carl Roth GmbH & Co KG | A994.2 | |
FDA approved drug library | Enzo Life Sciences | BML-2841-0100 | |
Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
E3 | N/A | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 |
Instruments | |||
Multiprobe II | PerkinElmer | 8 channel, equipped with disposable tip adaptor | |
Liquidator 96 | Steinbrenner Laborsysteme | hand-operated 96-channel pipette | |
EnVision XCite Multilabel Plate Reader | PerkinElmer | Equipped with stacker automation, temperature control, barcode reader and enhanced luminescence detector | |
Plasticware + consumables | |||
96-Well Storage Plate | ABgene | AB-0765 | round well, 0.8 ml |
Cover films, | ratiolab | 6018412 | self adhesive, DMSO resistent |
Pipette tips | Steinbrenner Laborsysteme | LRF-200L | for liquidator 96, 200 μl, low retention |
TopSeal-A | PerkinElmer | 6005185 | |
OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005299 | white opaque 96-well microplate |
Barcode Labels | PerkinElmer | 1608182 | |
filtered polypropylene IsoTip pipette tips | Corning | S058.4809 | |
Animals | |||
GRE:Luc fish | N/A | ZDB-TGCONSTRCT-120920-1 | available at the European Zebrafish Resource Centre EZRC, Karlsruhe |