Summary
Drosophila a émergé comme un système modèle important pour disséquer les fondements cellulaires et moléculaires de réponses comportementales à l'alcool. Nous présentons ici un protocole pour la collecte de données sur la sensibilité de l'alcool dans un contexte circadien qui peut être facilement appliquée à d'autres expériences et est bien adapté pour la recherche de premier cycle.
Abstract
Les mouches des fruits (Drosophila melanogaster) sont un modèle établi pour la recherche de l'alcool et de la biologie circadienne. Récemment, nous avons montré que l'horloge circadienne module la sensibilité à l'alcool, mais pas la formation de la tolérance. Ici, nous décrivons notre protocole en détail. L'alcool est administré à vol utilisant la barre stabilisatrice. Dans cette configuration, la vapeur d'alcool saturé est mélangé avec l'air humidifié dans des proportions fixes, et administré à vol dans quatre tubes simultanément. Les mouches sont élevées dans des conditions normalisées de manière à minimiser la variation entre les répétitions. Trois jours anciens mouches de différents génotypes ou de traitements sont utilisés pour les expériences, de préférence par vol de deux points différents dans le temps (par exemple, CT 5 et CT 17) de faire des comparaisons directes possible correspondant. Pendant l'expérience, les mouches sont exposés pendant 1 heure pour le pourcentage prédéterminé de la vapeur d'alcool et le nombre de mouches qui présentent la perte du réflexe de redressement (Lorr) ou sedation sont comptées toutes les 5 min. Les données peuvent être analysées selon trois approches statistiques différentes. La première consiste à déterminer l'heure à laquelle 50% des mouches ont perdu leur réflexe de redressement et en utilisant une analyse de la variance (ANOVA) pour déterminer s'il existe des différences significatives entre les points dans le temps. Le second est de déterminer le pourcentage des mouches qui montrent Lorr après un certain nombre de minutes, suivie d'une analyse de variance. La dernière méthode est d'analyser l'ensemble des séries chronologiques en utilisant les statistiques multivariées. Le protocole peut également être utilisé pour des expériences ou des comparaisons non circadiens entre les génotypes.
Introduction
Drosophila melanogaster démontrer réponses comportementales biphasique à l'alcool 1 qui sont analogues aux réponses humaines à ce médicament 2,3. Lors de l'exposition initiale à de faibles concentrations d'alcool, les mouches augmentation de l'activité locomotrice d'exposition, remplacé par un manque de coordination motrice, la perte du contrôle postural et les réflexes de redressement (perte du réflexe de redressement: Lorr), et une sédation (absence complète de l'activité du moteur en réponse à la stimulation mécanique) que l'exposition à l'alcool progresse 4-9. L'horloge circadienne endogène est une forte modulateur de la sensibilité de l'alcool et de la toxicité comme observé chez les souris, les rats 10,11 12, et les humains 13. Les avancées récentes dans la recherche drosophile ont montré l'horloge circadienne module sensibilité aiguë à l'alcool mais pas tolérance à l'alcool 1. Les approches génétiques puissants disponibles chez la drosophile par des études de mutants et les manipulations transgéniques de l'espaceet l'expression des gènes temporelle fournir un système qui permet de rapides progrès dans l'identification des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents aux comportements complexes. L'utilisation de la drosophile comme un outil d'enquête a permis des avancées importantes dans la compréhension de la neurobiologie de l'alcool qui peuvent être traduits rapidement aux mammifères 14-16. Afin de faciliter la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels l'horloge circadienne module la sensibilité à l'alcool et à mesurer de manière uniforme à travers les réponses comportementales points de temps circadiens, un protocole d'administration de l'alcool approprié pour une utilisation dans des conditions de faible lumière rouge est nécessaire. Pour la drosophile, l'alcool peut être administré par une supplémentation alimentaire pour une exposition chronique ou de manière fiable grâce à l'administration d'alcool sous forme de vapeur pour des expositions aiguës. Ici, nous décrivons un protocole d'administration d'alcool approprié pour l'évaluation de la modulation circadienne de la perte-de-réflexe (Lorr) 1 ainsi quesédation.
Les mouches sont entraînés avec 12 h: 12 h cycles LD à température constante, puis transférés à un régime de lumière contrôlée pendant 2-5 jours en fonction de la question expérimentale. Les mouches sont exposés à la vapeur d'éthanol dans un dispositif connu sous le nom la barre stabilisatrice. Dans ce dispositif, des quantités contrôlées d'air sont à barboter dans l'eau et l'alcool; les vapeurs sont ensuite mélangés et dirigés dans un boîtier flacon les mouches. Toutes les 5 min vol sont marqués pour le nombre que ne parvient pas à afficher redressement réflexes ou sont devenus des sédatifs. Pourcentages Lorr pour chaque point de temps sont calculés et comparés entre les points de temps circadiens ou entre les souches de mouches. La simplicité et la fiabilité de la livraison d'alcool en utilisant la livraison d'alcool barre stabilisatrice combinée avec des options d'analyse comportementale fournit un avantage significatif pour les expériences menées circadiens dans des conditions sombres.
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Protocol
1. Assemblée de la barre stabilisatrice
Justification et vue d'ensemble: Le système est conçu pour administrer des pourcentages contrôlées de vapeur d'alcool aux mouches. Remarque: La figure 1 donne un aperçu schématique de la barre stabilisatrice mis en place comme décrit ci-dessous en trois étapes (assemblage de l'écoulement de l'air, mise en place de l'alcool et des bouteilles d'eau, et l'assemblage des flacons d'observation). En bref, un flux d'air constant est divisé en deux fractions qui sont gondolées par l'alcool et de l'eau, respectivement, mélangés, et administrés à 4 flacons d'observation.
- Assemblée de l'Airflow
- Connecter un court morceau de tuyau souple en silicone, soit à l'air d'un bâtiment ou d'un aérateur d'aquarium pour générer un écoulement d'air uniforme et fendu à l'aide d'un raccord en Y. Connecter la première branche au régulateur de débit d'air qui commande la quantité totale d'air à travers le système (généralement 1000 ml / min pendant 4 fioles d'observation).
- Insérer un raccord rapide dans le deuxième tubede sorte que le courant d'air peut être interrompu au début de l'expérience, sans affecter l'écoulement d'air calibré. Ajouter un raccord en Y et relier chaque tube de dérivation vers le régulateur de débit d'air.
- Relier les tubes pour les régulateurs de débit d'air, puis relier deux mètres de débit d'air.
- Mise en place des bouteilles d'alcool et de l'eau
- Ajouter tube flexible à la sortie des compteurs de débit d'air et d'insérer un tube en verre mince (sections de pipettes 1 ml) en verre avec un coude à 90 ° dans l'extrémité de chaque longueur de tube. Ce sera le débit d'air d'admission dans les bouteilles d'eau et d'alcool.
- Placer des bouchons en caoutchouc avec 2 trous à travers eux dans les bouteilles remplies avec de l'alcool et de l'eau. Gardez les deux bouteilles à une température constante de 2 ° C supérieure à la température de l'air ambiant en utilisant un bain d'eau. Dans nos expériences, la chambre de l'environnement est maintenu à 25 ° C, tandis que le bain d'eau est à 27 ° C.
- Insérer la pipette de verre droit pour la uneir entrée à travers le bouchon de caoutchouc et s'étendent dans le liquide jusqu'à environ 1 cm du fond de la bouteille.
- Insérer une section de coude de la pipette de verre dans l'autre trou dans le bouchon de caoutchouc jusqu'à ce que l'extrémité du verre soit de niveau avec le fond du bouchon dans la bouteille. Insérer cette sortie d'air dans une autre longueur de tube.
- Réunir les courants d'air au moyen d'un raccord en Y et en utilisant une autre longueur de tube en silicone pour diriger le flux d'air à travers un mélange flacon ou une bouteille vide avec des sections de pipette de verre courbés insérés à travers un bouchon en caoutchouc à deux trous. Utilisez une autre longueur de tube de silicone pour le flux d'air mixte sortie.
- Assemblée de l'Observation Vial
- Diviser le courant d'air d'évacuation sortant de la fiole de mélange 2 à 3 fois pour obtenir 4 ou 8 petits courants d'air de sorte que de multiples flacons d'observation peuvent être utilisées dans chaque expérience. Raccordez le tube de silicone souple pour les flacons d'observation.
- Mettre en place la observatisur des flacons en utilisant des flacons vides fermés par un bouchon en caoutchouc comportant deux trous à travers lesquels des tubes de verre fournissent une entrée et une sortie pour la vapeur d'alcool.
- Couvrir la fin du premier tube de verre avec un filet et garder le filet en place à l'aide d'un petit morceau de tube en plastique souple. Insérer ce tube à travers le premier trou jusqu'à ce qu'elle s'étende à peu près la moitié de la longueur du flacon. Si nécessaire, utilisez du ruban téflon pour obtenir un ajustement parfait.
- Insérer le second tube de verre également avec l'extrémité couverte par le filet jusqu'à ce qu'il soit de niveau avec le bord intérieur du bouchon de caoutchouc.
- Placer les flacons horizontalement sur une feuille de papier blanc pour maximiser le contraste avec les mouches dans des conditions de faible lumière rouge.
- Mélanger fractions appropriées du flux d'air à barboter dans l'alcool et le flux d'air à barboter dans l'eau. Surveillance de la pression de l'air en continu et faire les ajustements nécessaires pour maintenir le mélange souhaité des courants d'air.
Remarque: Le fonctionnement continude plusieurs essais Fly Bar en parallèle ou même un seul essai dans une petite pièce peut conduire à une accumulation notable de vapeur d'alcool. Pour éviter la libération continue de la vapeur d'alcool qui peuvent potentiellement affecter le chercheur dans une pièce fermée, un système approprié doit être mis en place qui permet d'éliminer convenablement la vapeur d'alcool généré au cours de l'expérience. Pour éliminer les vapeurs d'alcool, connecter un morceau de tuyau 6-12 pouces sur le second tube de verre en saillie de chaque flacon, les regrouper et ordonner à un système d'entonnoir vide. Les chercheurs doivent aussi veiller à ce que la salle d'essai expérimental est correctement ventilée.
2. Préparation des animaux d'expérimentation
Justification et aperçu: culture et de logements de vol appropriée permettra de réduire la variabilité des données. Ce résultat est obtenu grâce à la standardisation et la réduction du stress vécu par les mouches. Pour cette raison, aucune anesthésie (CO 2 ou alternatives) est utilisé During quelconque des étapes suivantes du protocole. En outre, les mouches doivent être appariés pour l'âge à travers des expériences et des points de temps pour minimiser la variabilité comme c'est la norme pour d'autres analyses comportementales, y compris l'apprentissage et de la mémoire des expériences 17.
La lumière différente: l'obscurité peuvent être utilisés pour sonder la fonction de l'horloge circadienne dans la réponse comportementale à l'éthanol. Pour déterminer si un rythme diurne existe, les expériences peuvent être effectuées en vertu d'un cycle de LD définis pour mesurer la performance à Zeitgeber temps spécifique (ZT). ZT 0 représente l'aube et est défini comme le temps de lumières sous cycles LD, alors que ZT 12, les feux sont éteints temps avec un cycle de LD 12:12 h. Dans des conditions constantes, le temps circadien (CT) mesure le temps pour l'animal en l'absence de signaux de l'environnement, c'est à dire le temps de roue libre, et est liée au cycle LD d'entraînement précédente. Dans de type sauvage drosophile, CT reflète la ZT précédente pour la première de plusieurs jourss dans des conditions constantes que la période circadienne roue libre et les rythmes sont ~ 24 h. Pour mesurer la modulation circadienne et d'éliminer les effets de lumière aiguë sur le comportement, les mouches sont entraînées à la lumière: cycles sombres et ensuite transférés à l'obscurité constante (DD) avant les expériences. Expériences circadiens sont effectuées sur la deuxième journée de DD pour mesurer la performance à circadien temps spécifique (CT).
Chez la drosophile, la lumière continue (LL) conditions entraînent un dysfonctionnement circadien avec des oscillations moléculaires mouillées ou supprimés de base gènes circadiens et la perturbation des rythmes circadiens de comportement, comme en témoigne l'activité locomotrice arythmique 18-21 et arythmique mémoire à court terme 17. Le protocole est optimisée pour les études circadiens et peut être simplifié pour d'autres expériences. Toutes les expériences circadiens sont effectuées avec lumière tamisée rouge (lumière rouge de tête ambiante <1 lux au-dessus de banc, les petites lumières rouges utilisé à 12 pouces de tubes~ 1 lux de lumière).
- Arrière vol à 25 ° C sous 12h12 h lumière: conditions d'entraînement sombres (LD).
- Recueillir les mouches fraîchement éclos à la fin de la période de lumière du jour le jour 1 et les stocker pendant 24 heures dans des conditions de LD en tenant flacons contenant une petite quantité d'aliments riches en concentration agar pour minimiser la viscosité des aliments. Remarque: Pour assurer la santé, vol normalement développés sont collectées, utilisez uniquement des mouches capturées dans les premiers jours après l'éclosion commence dans un flacon de culture.
- Recueillir des lots d'environ 30 (25-35) vole en utilisant un aspirateur le jour 2 vers la fin de la période de lumière, et le transfert des flacons de maintien frais.
- Utilisez une forte source de lumière pour diriger vol à l'extrémité du flacon. Dans cette gamme, le nombre exact de vol dans chaque flacon n'est pas critique tant que les observations comportementales sont rapportés en pourcentages en nombre total de mouches comptées à la fin de chaque expérience.
- Maintenir vol dans des conditions DD à 25 ° C for deux jours.
- Le jour de l'expérience, toutes les mouches placer logés dans des conditions différentes ou d'autres incubateurs de la salle de comportement expérimental dans la chambre pendant au moins 1 heure avant l'expérience. Acclimatation réduit la variabilité due aux changements de température ou d'humidité.
- Faire des observations à six points de temps par jour (CT 1, 5, 9, 13, 17 et 21) afin de tester pour la modulation circadienne de comportement.
- Comparez plusieurs points dans le temps au sein d'un ensemble unique d'expériences comportementales pour augmenter la robustesse de la conception expérimentale et de minimiser la variabilité spécifique à une seule expérience. Par exemple, les observations de CT 1 et CT 13 peuvent être obtenues simultanément si deux incubateurs avec des horaires clair-obscur opposés sont utilisés pour l'entraînement.
Remarque: Le procédé ci-dessus décrit la préparation d'animaux de laboratoire pour des dosages effectués en état circadien d'obscurité constante. Différents lumière: conditions sombres peuvent être utilisés pour sonder la fonction de l'horlogedans les réponses comportementales à l'alcool. Pour déterminer si un rythme diurne existe les expériences peuvent être réalisées en vertu d'un cycle de LD pour mesurer la performance à Zeitgeber temps spécifique (ZT). En outre, le protocole peut être utilisé avec des mouches élevés dans des conditions de lumière constante pour la vérification des expériences dysfonction circadien. Pour les protocoles alternatifs qui testent vol logés dans des conditions de lumière, tests comportementaux doivent encore être effectuées dans des conditions sombres. Les mouches doivent être transférés dans l'obscurité pendant 1 heure avant l'expérience pour minimiser la variabilité du comportement dû aux effets aigus de la lumière sur le comportement.
3. Observations comportementales
Justification et aperçu: Le protocole d'administration d'alcool suivante est optimisé pour observations sous condition de faible lumière rouge. Les deux mesures comportementales Lorr et sédation représentent deux points distincts de mouche ivresse. Lorr représente un point fin d'ébriété incorporant la perte omoteur de f et le contrôle postural, tandis que les mesures de sédation un point final très tardif de l'intoxication. Génotype ou modulation circadienne peuvent affecter ces deux mesures différentes; donc on peut souhaiter examiner à la fois. En bref, les mouches sont chargées dans les flacons, le numéro de vol affichant LORR sédation ou reçu sont toutes les 5 minutes pendant l'exposition à la vapeur d'alcool, et le nombre total de mouches comptées à la fin de l'expérience.
- Avant de commencer l'expérience, exécutez l'air à travers le système (air barboter dans des bouteilles d'eau et d'alcool) pendant au moins 10 min et utiliser ce temps pour calibrer les flux d'air.
- Débranchez la libération rapide d'arrêter le flux d'air. Chargez les mouches dans les flacons, et rebranchez le flux d'air et commencer les minuteries. Remarque: Si les mouches qui ne répondent pas ou mouches mortes sont laissées dans les flacons de retenue, cela pourrait être une indication de conditions de stress. En général, ces conditions peuvent être soulagés en logeant moins de mouches dans les flacons de maintien ou de diminuer la viscosité des aliments en utilisant une légèrela concentration en gélose ment plus élevé pendant la préparation des aliments. Pour les analyses comportementales optimales et une variabilité minimale entre les expériences, vol doivent être en bonne santé avant les expériences.
- Pour la tenue de l'heure exacte, utilisez une minuterie pour garder une trace de la durée totale de l'exposition de l'alcool et d'utiliser un second minuteur-retour pour marquer les intervalles de 5 min.
- Placez un morceau de papier blanc sous les coupes pour augmenter le contraste et voler visibilité, en particulier dans des conditions de faible lumière rouge.
- Vérifiez régulièrement le flux d'air lors d'une expérience de maintenir des niveaux constants. Généralement, une fois que les flux d'air se sont stabilisés, ils restent stables pendant la durée de l'expérience.
- Comptez le nombre de mouches qui ont perdu leur réflexe de redressement, une fois toutes les 5 minutes pendant une période de 1 heure. Comme la sensibilité à l'alcool varie entre génotypes et des arrière-plans génétiques, il peut être souhaitable d'effectuer des évaluations plus fréquentes ou de procéder à l'expérience pendant une période de temps plus longue.
- Soulevez le slightl flacony à partir de la surface, et à diriger la lumière provenant d'une lampe-torche de lumière rouge vers le papier derrière le flacon. Gardez les lampes de poche rouges à main à une distance d'au moins 12 pouces dans le flacon expérimental pour maintenir des niveaux ne dépassant pas 1 lux de lumière pour toutes les expériences dans des conditions de faible lumière rouge.
- Mesurer les niveaux d'éclairage utilisant un posemètre à établir des normes pour toutes les expériences.
- Déterminer le nombre de mouches qui ont perdu leur réflexe de redressement en appliquant un robinet ferme le flacon et compter le nombre de mouches ne parviennent pas à se redresser dans environ 4 sec. Les mouches qui affichent Lorr peuvent encore bouger les jambes et les ailes, mais ne peuvent pas se transformer en position verticale.
- A la fin de la session, compter le nombre total de mouches dans chaque flacon.
Remarque: Parfois, une seule mouche peut être pris entre le bouchon et le côté lors du chargement vole dans les flacons expérimentaux. Comme cela se fait dans l'obscurité, il ne peut pas être facilement remarqué, il est donc nécessaire de compter le engourdi totaleer de vol à la fin de l'expérience de calculer correctement les pourcentages.
En outre, ce procédé peut également être utilisé pour mesurer la sédation de vol, qui représente un critère d'évaluation du comportement différent. Alors que les mouches sédation ont perdu leur bon réflexe, la sédation nécessite une plus grande exposition à l'alcool. Comportemental, la sédation peut être caractérisé par l'absence totale de l'activité motrice apparente avec des mouches restant immobile dans le flacon après le cabinet d'aa robinet dans le flacon. Pour la sédation, compter le nombre de mouches qui restent immobiles sans jambe en agitant après la livraison d'un robinet cabinet du flacon. En outre, le flacon peut être roulé côté à l'autre afin de déterminer si les mouches individuels conservent leur réflexe saisissant.
4. Analyse des données
- Déterminer le pourcentage Lorr à chaque fois évaluée sur la base du nombre total de mouches dans chaque flacon.
- différences Estimer entre les points ou les souches de temps circadiens par calculating du LORR de 50% pour chaque échantillon qui tombe à l'intérieur de la partie linéaire de la courbe sigmoïde (voir figure 2 ci-dessous).
- Autres statistiques:
- Si la comparaison entre les génotypes sont prévues, il est souhaitable d'analyser tout le cours du temps en utilisant des mesures répétées ANOVAand pour déterminer la plage de points de temps que les différences sont significatives par tests post-hoc (Figure 3). Pour ces tests, nous préférons utiliser une valeur de 0,001. Ceci permet à des différences des temps d'exposition individuelles à évaluer ainsi que les différences entre les génotypes à la pente de la courbe.
- Les différences de sensibilité pour peuvent être déterminées pour des moments précis de l'exposition à l'alcool pour une réponse particulière tels que la sédation de la partie linéaire de la courbe (figure 4).
- Les différences entre les souches ou les points de temps circadien peuvent être estimées en utilisant F-statistiques standards et des tests post-hoc.
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Representative Results
Modulation circadienne de l'alcool Sensibilité à l'aide de 50% Lorr comme un marqueur.
Un exemple représentatif montrant modulation circadienne de la sensibilité de l'alcool au cours de la journée est présenté à la figure 2. Lorr a été mesurée à six points dans le temps au cours de la 2 e journée de DD à Canton-S et les 50% Lorr a été déterminée pour chaque point de temps. L'analyse a montré un effet significatif du moment de la journée (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p <0,001, N = 6-10 par point de temps). Le test LSD de Fisher a montré des différences significatives entre CT1 vs CT5, CT5 vs CT13, CT5 vs CT17, CT5 vs CT 21, CT9 vs CT13, CT9 vs CT17, et CT9 vs CT 21. Ce résultat est cohérent avec nos résultats publiés antérieurement 1.
Différences entre type sauvage et mouches mutantes.
Le deuxième exemple utilise des séries chronologiques pour montrer les différences dans la Lorr et sédation entre-mouches de type sauvage et fli Canton-Ses porteurs d'une mutation perte de fonction blanc (w 1118) dans le même fond génétique (Figure 3). La mutation w 1118 est d'un intérêt particulier pour les chercheurs de Drosophila en tant que lignées transgéniques sont souvent créées à l'aide de ces mouches et de nombreuses lignées mutantes pour les gènes de l'horloge circadienne ont également la mutation w 1118. Les résultats sont présentés sous forme d'une série temporelle (figure 3) avec des données indiquées pour toutes les 5 minutes pendant toute la période d'exposition. Les observations sont limitées à 60 min afin d'éviter les effets de l'accumulation rapide de tolérance de 22 à 24. Les mutants w 1118 affichent une sensibilité réduite de manière significative en réponse à LORR vapeur d'éthanol que ne le fait Canton-S (ANOVA entre les sujets F 1,10 = 57,12, p <0,001, n = 6). différences de signification (a = 0,001) ont été trouvés dans cette expérience de min 20 min par 60 (figure 3A w 1118 et Canton-S ont également été trouvés dans le taux de sédation (ANOVA entre les sujets F 1,10 = 137,301, p <0,001, N = 6). Dans le test de sédation, des différences significatives (a = 0,001) ont été trouvés dans 50 minutes, 55 et 60 (figure 3B). En plus de l'absence de pigments de dépistage dans les yeux, les mutants w 1118 ont également réduit les niveaux de sérotonine, de la dopamine et l'histamine 25,26. Ces changements dans les niveaux d'aminés biogéniques peuvent rendre compte de la sensibilité altérée à l'éthanol dans les mutants 27,28 1,118 w. Par conséquent, en contrôlant le niveau d'expression blanc dans les génotypes testés peut être essentielle pour l'évaluation précise de la sensibilité à l'éthanol.
Modulation circadienne de sédation.
Dans le troisième exemple, nous avons mesuré le pourcentage de Canton-S vole calmed après un certain laps de temps afin de déterminer s'il existe un effet circadien de l'alcool sur la sédation (figure 4). Nous avons comparé le pourcentage de mouches sous sédation à 40 min (30% de la vapeur d'alcool) à CT 5 et 17 et les résultats montrent qu'il ya beaucoup moins de mouches sous sédation pendant la journée par rapport à l'exposition à l'alcool pendant la nuit (ANOVA: F 1,20 = 6,21, p = 0,022, N = 10 (CT5) et 12 (CT17)). Les mouches n'ont pas atteint la sédation barre des 50% dans l'heure que les observations ont été faites dans nos conditions Lorr standards afin de faire une comparaison directe possible. Observations au-delà de l'heure sont problématiques en raison de l'accumulation de la tolérance rapide 22-24. Dans cette expérience, moins de 25% des mouches à l'un des points de temps circadien ont été sous sédation à 40 min, ce qui indique qu'il ya une différence de sensibilité premier bord de sédation entre ces groupes. La collecte de données à ce stade au début de la sédation est un INDICAT utileion que des différences existent néanmoins la possibilité de déterminer l'effet du traitement sur la forme de la distribution dans les réponses de sédation est limitée. Pour déterminer s'il existe une différence dans la distribution de la totalité de la sédation, une concentration en éthanol plus élevée doit être utilisée pour assurer une vitesse plus rapide de la sédation.
Figure 1. La barre stabilisatrice pour mesurer la sensibilité de l'alcool et de la sédation dans les mouches des fruits.
.. Figure 2 Exemple représentatif montrant modulation circadienne significative de la sensibilité de l'alcool au cours de la journée (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p <0,001, N = 6-10 par point de temps; différences significatives entre CT5 vs CT1, CT13, CT17, CT21 et CT13 et CT9 contre, CT17, CT21 &).
Figure 3. Effets de l'alcool sur les réponses comportementales sont significativement différentes entre-type sauvage Canton-S mouches et les blancs 1118 mouches mutantes perte de fonction. A) Canton-S vol montrent une augmentation significative de sensibilité à l'alcool, telle que mesurée par rapport à Lorr mouches avec le même fond génétique portant la mutation blanc (ANOVA entre les sujets F 1,10 = 57,12, p <0,001, n = 6). B) Canton-S mouches sont plus sensibles à l'alcool de sédation w 1118 mutants (ANOVA entre les matières F = 137,301 1,10, p <0,001, n = 6). *p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
. Figure 4 des données représentatives comparant le pourcentage de Canton-S mouches sous sédation à 40 min entre 5 et CT CT 17 mouches de type sauvage montrent significativement plus grande augmentation de la sédation initiale au CT 17 par rapport à CT 5 (ANOVA:. F 1,20 = 6,21, p = 0,022, N = 10 (CT5) et 12 (CT17)).
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Discussion
Les coûts de l'abus d'alcool et l'alcoolisme pour la société est énorme, tant en termes de coûts humains et économiques 29 30,31. Drosophile comme modèle propose un système rapide et souple pour examiner rapidement les réponses comportementales d'un grand nombre d'individus et en tant que tel a été largement utilisé à la fois pour la recherche et l'alcool 5,7,32-34 circadien 35-37.
Ici, nous avons décrit un protocole simple pour l'administration contrôlée de la vapeur d'alcool aux mouches adultes dans des conditions circadiens.
Les mouches cultivées dans des conditions normalisées sont exposés à de la vapeur d'alcool pendant 1 heure au cours de laquelle le nombre de mouches qui ont perdu leur réflexe de redressement a reçu sont toutes les 5 min. Le protocole décrit ici est optimisée pour les expériences circadiens en raison des exigences supplémentaires pour l'entraînement et le logement dans des conditions constantes. Diverses mesures peuvent être simplified pour les études génériques par la suppression de ces mesures qui sont essentielles pour les expériences circadiens tels que le stockage dans l'obscurité pendant au moins une journée ou de faire des expériences dans des conditions de faible lumière rouge. Ce protocole peut également être utilisé pour exposer grand nombre de mouches d'une manière contrôlée à différentes concentrations d'alcool pour des analyses biochimiques ou moléculaires ultérieures. Par souci de cohérence avec d'autres expériences de comportement chez la drosophile comme l'apprentissage et observations de mémoire, mesure des réponses comportementales dans des conditions de faible lumière rouge peut être souhaitable même pour les expériences non circadiens.
Variation entre les répétitions indépendantes de l'expérience peut masquer de petites différences entre les mutants ou de souches transgéniques ou entre les points de temps circadiens. Il est donc recommandé d'échantillons d'essai de plusieurs souches ou des points de temps circadiens simultanément (voir les exemples), de sorte que "réplique" peut être ajouté sous forme d'une variable aléatoire, afin d'éliminer l'effet de la variation entre les répliques.
La sensibilité à l'alcool varie entre les souches. pourcentages d'alcool (le pourcentage du flux d'air barbotage dans l'alcool) doivent être ajustés en conséquence. Comme on le voit sur la figure 3, les mouches portant la mutation blanc sont moins sensibles aux effets de l'exposition à l'alcool que de type sauvage Canton-S vole. Pour l'analyse de lignées portant la mutation blanc, il peut être souhaitable d'augmenter le taux d'alcool dans laquelle les mouches sont exposées de façon à effectuer le test de comportement dans le même laps de temps d'autres expériences, comme une exposition plus longue à l'alcool peut conduire à une tolérance rapide développement. Pour les mutants extrêmement sensibles et pour des expériences dans lesquelles il est nécessaire de diminuer le pourcentage d'alcool utilisé, comme observé pour les mouches contenant une mutation dans le gène yellow, le flux d'air peut être augmenté pour calibrer l'alcool saturé avec précision le flux d'air. De petites augmentations ou DECreases (± 10%) dans le flux d'air totale (gamme de débit d'air réalisable de 900-1,100 ml / min pour 4 flacons d'observation) ne semblent pas affecter négativement les mouches.
Observations au-delà de 1 h doivent être évitées si possible en raison du potentiel de l'accumulation de la tolérance rapide des mouches 22-24 qui affecte la sensibilité de l'alcool. Au lieu de cela, déterminer le pourcentage d'alcool pour chaque souche qui se traduit par une participation d'environ 50% par Lorr 30-40 min. Si la comparaison de plusieurs souches indépendantes est nécessaire, choisissez un pourcentage d'alcool qui fonctionne pour toutes les souches.
Ce protocole dépend fortement des observations du comportement, de sorte strict respect d'un protocole standardisé est essentielle pour éviter toute dérive dans l'observation du comportement au fil du temps. Si possible, les observations comportementales doivent être réalisées de telle sorte que l'observateur est aveugle au point de génotype ou de temps en cours de test. Afin de détecter un biais potentiel sur la base de ces inconnus et d'autres facteurs,il est souhaitable d'examiner les données sur un décours temporel et pour vérifier que les observations restent dans la même gamme tout au long de la série expérimentale.
La barre stabilisatrice set-up offre certains avantages par rapport aux autres méthodes d'administration d'alcool pour les mouches, en particulier pour les chercheurs de premier cycle ou d'études circadiens sur les effets négatifs de l'éthanol. Un dispositif alternatif à mesurer l'effet de l'alcool sur le contrôle moteur en vol est la inebriometer, une colonne verticale dans laquelle la vapeur d'éthanol est distribué par la hausse des chicanes et la perte du contrôle postural ou de la sensibilité de la mouche peut être mesurée en déterminant le temps qu'il faut à tomber au fond de la colonne 38,39. Le inebriometer fournit une lecture automatisée de contrôle de perte de la posture et s'est avéré précieux pour la recherche d'alcool chez la drosophile 9,22,39,40, mais ce paradigme comportemental nécessite un équipement relativement coûteux, l'espace pour l'appareil, et le temps de calibreret d'optimiser les conditions. Ainsi, la inebriometer peut pas être bien adapté pour de nombreux laboratoires d'enseignement de premier cycle avec des budgets limités ou de l'espace, ou pour les chercheurs effectuant des essais circadiens. Un autre procédé de délivrance d'alcool pour les mouches et la mesure consiste à placer une sédation petite quantité d'alcool liquide sur un matériau absorbant soit en haut ou en bas d'un flacon, puis en laissant l'alcool avec le temps de se vaporiser 41,42. Comme la concentration de l'augmentation de la vapeur d'alcool en fonction du temps, les réactions comportementales peuvent être évaluées. Bien que cette méthode de livraison est facile à mettre en place, la quantité de vapeur d'alcool auxquelles les mouches sont exposés varie avec le temps et les conditions. Pour les questions expérimentales dans lesquelles différences sont évaluées dans les taux initiaux de la sensibilité ou de la sédation, telles que la modulation du rythme circadien, il est souhaitable d'avoir un niveau constant de la vapeur d'alcool directement à vol. En outre, l'exposition d'un grand nombre de mouches à une quantité constante de l'alcool exposure, comme effectuée avec la barre stabilisatrice, est souhaitable pour l'exécution précise des dosages cellulaires ou biochimiques en aval. Une autre méthode de livraison d'alcool à mouches communes dans la recherche au début de la drosophile alcool impliqué mélange de l'alcool dans la nourriture car il a été préparé. Bien que cette méthode est simple et nécessite peu de set-up, il est le mieux adapté pour l'exposition chronique à l'alcool au cours des jours que la concentration de l'alcool change avec le temps.
, Des méthodes automatisées plus sophistiquées sont également disponibles pour évaluer les réponses locomotrices de mouches à l'exposition à l'alcool, y compris l'enregistrement de l'activité vidéo et des logiciels d'analyse d'image 7,43. Elles sont particulièrement puissant pour évaluer les effets positifs, hyper-activation de l'éthanol. Cependant, ces méthodes automatisées peuvent être prohibitifs pour les projets de recherche de premier cycle ou des laboratoires d'enseignement et peuvent ne pas être parfaitement conçu pour l'analyse d'un grand nombre de mouches dans des conditions de circadientions (par exemple, la capture vidéo dans des conditions sombres nécessite équilibrée et diffuse un éclairage infrarouge et des caméras sensibles aux infrarouges). Nous croyons que la barre stabilisatrice donne un pour mettre en place la méthode, le coût-efficace facile pour le système de livraison d'alcool et l'évaluation des réponses comportementales à l'alcool qui est bien adapté à une variété de conditions et des conceptions de laboratoire.
MODIFICATIONS DU PROTOCOLE:
Le protocole décrit ci-dessus vise à examiner l'effet de l'exposition à l'alcool sur la perte de-redressement-Reflex dans un contexte circadien. Cependant, le protocole peut être facilement modifié pour s'adapter à d'autres types d'expériences à l'alcool.
L'examen de la réponse à l'alcool de moins de 12 h-12 h de lumière-obscurité (LD; Zeitgeber Time) conditions: Maintenir vol de moins de 12 heures: 12 cycle de LD h jusqu'à l'expérience. Transférer les mouches à l'obscurité environ 1 h avant l'expérience menée au cours de la phase légère (ZT 1, 5Et 9) de la journée. Cela permettra d'assurer que l'effet aigu de la lumière n'est pas confondant les résultats.
L'examen de la réponse à l'alcool dans des conditions de lumière constante: vol culture dans des conditions de lumière des résultats constants dans la perturbation de leur horloge circadienne 18-21 et réponses arythmiques à l'exposition à l'alcool 1. Les mouches peuvent être transférées à l'obscurité à environ 1 heure avant l'expérience de sorte que les mouches sont testés dans les mêmes conditions que les mouches ou maintenues dans des conditions LD DD.
Sédation: Les mouches qui sont sous sédation peuvent être séparés de Lorr vole car les mouches restent immobiles sur le fond du flacon, tout en Lorr oiseau va encore bouger leurs ailes, la tête et les jambes. Mouches qui présentent Lorr encore répondre à des mouvements subtils lorsque le flacon est perturbé. Sédation de vol est déterminé par le comptage du nombre de mouches reste immobile après un cabinet tap dans le flacon. En outre, le laminage de la fiole peut être utilisé pour déterminer si les mouches individuelles conservent leur réflexe saisissant.
Récupération: L'analyse comportementale peut être prolongée par la mesure de la récupération comme un paramètre supplémentaire de la réponse de l'alcool. Cesser exposition à l'alcool et continuer à faire des observations au sujet de la Lorr toutes les 5 min. Continuer le flux d'air humidifié à travers les flacons pendant les périodes de récupération.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Le financement de cette recherche a été assuré par un programme en neurosciences Prix de la Florida State University College of Medicine et le soutien du Département de sciences biologiques à l'ex-URSS. Le financement supplémentaire a été fourni par une subvention en aide provenant du Fonds de recherche de la vente d'alcool Fabricant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y-connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature air regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature air regulator mounting bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini flashlights with red filters | Mag-light |
References
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