Summary
Drosophila surgiu como um sistema modelo importante para dissecar as bases celulares e moleculares de respostas comportamentais ao álcool. Aqui é apresentado um protocolo para a recolha de dados de sensibilidade do álcool em um contexto circadiano que pode ser facilmente aplicado a outros ensaios e é bem adequada para a pesquisa de graduação.
Abstract
Moscas de frutas (Drosophila melanogaster) são um modelo estabelecido para a pesquisa de álcool e biologia circadiano. Recentemente, mostramos que o relógio circadiano modula sensibilidade ao álcool, mas não a formação de tolerância. Aqui, descrevemos nosso protocolo em detalhe. O álcool é administrado às moscas usando flybar. Nesta configuração, o vapor de álcool saturado é misturado com o ar umidificado em proporções definidas e administradas às moscas em quatro tubos simultaneamente. As moscas são criadas sob condições padronizadas, a fim de minimizar a variação entre as repetições. Três dias de idade moscas de diferentes genótipos ou tratamentos são utilizados para os experimentos, de preferência por moscas de dois pontos diferentes de tempo (por exemplo, CT 5 e CT 17) fazendo comparações diretas possível combinar. Durante a experiência, as moscas são expostos durante 1 hora a percentagem pré-determinada de vapor de álcool e o número de moscas que exibem a perda do reflexo de endireitamento (LORR) ou sedção são contados a cada 5 min. Os dados podem ser analisados utilizando-se três abordagens estatísticas diferentes. A primeira é a de determinar o tempo em que 50% das moscas têm perdido o reflexo de endireitamento e usar uma análise da variância (ANOVA) para determinar se existem diferenças significativas entre pontos de tempo. O segundo é o de determinar as moscas percentuais que mostram Lorr após um determinado número de minutos, seguido de uma análise ANOVA. O último método é analisar toda a série vezes utilizando estatística multivariada. O protocolo também pode ser usado para as experiências não circadianos ou comparações entre genótipos.
Introduction
Drosophila melanogaster demonstrar respostas comportamentais bifásicos ao álcool 1, que são análogas às respostas humanas a este fármaco 2,3. Após a exposição inicial a baixas concentrações de álcool, moscas apresentam aumento da atividade locomotora, substituído por uma falta de coordenação motora, a perda de controle postural e reflexos de endireitamento (perda do reflexo de endireitamento: Lorr) e sedação (completa falta de atividade motora em resposta a estimulação mecânica) como a exposição ao álcool progride 4-9. O relógio circadiano endógeno é um forte modulador de álcool sensibilidade e toxicidade, como observado em ratinhos, ratos 10,11 12, 13 e os seres humanos. Os recentes avanços na pesquisa Drosophila mostraram o relógio circadiano modula a sensibilidade aguda de álcool, mas não de álcool tolerância 1. As poderosas abordagens genéticas disponíveis em Drosophila através de estudos mutantes e manipulações transgênicas de espaciale expressão gênica temporal, fornecer um sistema que permite um progresso rápido na identificação dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes para comportamentos complexos. O uso de Drosophila como ferramenta de investigação tem permitido avanços substanciais na compreensão da neurobiologia de álcool que podem ser rapidamente convertidos em mamíferos 14-16. A fim de facilitar a compreensão dos mecanismos moleculares pelos quais o relógio circadiano modula a sensibilidade do álcool e para medir respostas comportamentais uniformemente em toda a pontos de tempo circadiano, um protocolo de administração do álcool apropriado para o uso em fracas condições de luz vermelha não é requerida. Para Drosophila, o álcool pode ser administrado por meio de suplementação alimentar para a exposição crônica ou de forma confiável através de administração de álcool na forma de vapor para exposições agudas. Aqui, descrevemos um protocolo de administração de álcool adequado para a avaliação da modulação circadiana da Loss-of-reflexo de endireitamento (Lorr) 1, bem comosedação.
As moscas são arrastadas com 12 horas: 12 horas LD ciclos a uma temperatura constante e, em seguida, transferida para um regime de luz controlada durante 2-5 dias, dependendo da questão experimental. As moscas são expostas a vapor de etanol, em um aparelho conhecido como o Flybar. Neste dispositivo, quantidades controladas de ar são borbulhar na água e álcool; Os vapores são então misturados e dirigido para uma caixa de frasco, as moscas. Cada 5 min as moscas são marcados para o número que não consegue exibir corrigir reflexos ou tornaram-se sedado. Percentagens Lorr para cada ponto de tempo é calculado e comparado entre os pontos de tempo circadianos ou entre estirpes de moscas. A simplicidade e confiabilidade do fornecimento de álcool com a entrega de álcool Flybar combinado com opções de análise de comportamento proporciona um benefício significativo para os experimentos realizados circadianos em ambientes escuros.
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Protocol
1. Assembleia da Flybar
Fundamentação e visão geral: O sistema é projetado para administrar porcentagens controladas de vapor de álcool às moscas. Nota: A Figura 1 fornece uma visão esquemática do Flybar set-up, conforme descrito abaixo em três etapas (montagem do fluxo de ar, set-up do álcool e garrafas de água, e montagem dos frascos de observação). Em suma, um fluxo de ar constante é dividido em duas frações que são borbulhar álcool e água, respectivamente, misturados e administrados a 4 frascos de observação.
- Assembleia da Airflow
- Conecte um pequeno pedaço de tubo de silicone flexível a qualquer edifício de ar ou um aerador de aquário para gerar um fluxo de ar consistente e divisão por meio de conector y. Ligue o primeiro ramo do regulador de fluxo de ar que controla a quantidade total de ar através do sistema (normalmente de 1.000 ml / min durante 4 frascos de observação).
- Insira um conector de engate rápido no segundo tubode modo que o fluxo de ar pode ser interrompido no começo do ensaio, sem afectar o fluxo de ar calibrado. Adicionar um conector y e conectar cada tubo de ramificação para o regulador de fluxo de ar.
- Conecte tubulação para os reguladores de fluxo de ar e, em seguida, conectar dois metros de fluxo de ar.
- Set-up das garrafas de álcool e água
- Adicionar tubo flexível para a saída dos medidores de fluxo de ar e inserir um tubo de vidro fino (secções de 1 ml de pipetas de vidro) com um ângulo de 90 ° para dentro da extremidade de cada troço de tubo. Isto servirá como o fluxo de ar de entrada para as garrafas de água e álcool.
- Coloque tampas de borracha com 2 buracos através deles para as garrafas cheias de álcool e água. Manter ambos os frascos a uma temperatura constante da temperatura de 2 ° C acima da temperatura do ar ambiente, utilizando um banho de água. Nas nossas experiências, o quarto meio ambiente é mantida a 25 ° C, enquanto que o banho de água é a 27 ° C.
- Insira a pipeta de vidro direto para o umri admissão através da rolha de borracha e se estender para o fluido até cerca de 1 cm a partir do fundo da garrafa.
- Insira uma secção em cotovelo de uma pipeta de vidro para dentro do buraco remanescente na rolha de borracha até à extremidade do vidro é nivelada com o fundo da rolha para dentro da garrafa. Insira esta saída de ar em outro comprimento da tubulação.
- Reunir as correntes de ar usando um conector-Y e usar um outro comprimento de tubagem de silicone para dirigir o fluxo de ar através de um frasco de mistura vazio ou garrafas com secções de pipetas de vidro dobradas inseridos através de uma rolha de borracha de dois furos. Use outro pedaço de tubo de silicone para a corrente de ar misturado tomada.
- Assembleia da Observação Vial
- Dividir a corrente de ar de saída que emerge a partir da mistura de frasco 2-3x obter quatro ou oito fluxos de ar mais pequenas, de modo que vários frascos de observação pode ser utilizado em cada experiência. Conecte o tubo de silicone flexível para os frascos de observação.
- Configure o observatiem frascos utilizando frascos vazios fechados com uma rolha de borracha que contém dois orifícios através dos quais os tubos de vidro proporcionam uma entrada e uma saída para o vapor de álcool.
- Cobrir a extremidade do primeiro tubo de vidro com rede e manter a rede no lugar, usando uma pequena peça de tubagem de plástico flexível. Inserir este tubo através do primeiro furo, até que se estende até cerca de metade do comprimento do tubo. Se necessário, use fita de teflon para obter um ajuste confortável.
- Insira o segundo tubo de vidro também com o fim coberto por compensação até que ela fique nivelada com a borda interna da tampa de borracha.
- Colocar os tubos na horizontal em um pedaço de papel branco para maximizar o contraste com as moscas sob fracas condições de luz vermelha.
- Misture fracções apropriadas da corrente de ar borbulhada através de álcool e a corrente de ar borbulhada através de água. Monitorar a pressão de ar de forma contínua e fazer os ajustes necessários para manter a mistura desejada dos fluxos de ar.
Nota: O funcionamento contínuode vários ensaios Fly Bar em paralelo ou mesmo um único ensaio em uma pequena sala pode levar a uma acumulação considerável de vapor de álcool. Para evitar a libertação contínua de vapor de álcool que pode potencialmente afetar o pesquisador em uma sala fechada, um sistema adequado precisa ser colocado no lugar que remove adequadamente vapor de álcool gerado durante o experimento. Para remover vapores de álcool, ligar um pedaço de tubo de 6-12 polegadas para o segundo tubo de vidro salientes de cada frasco, e empacotá-los directamente para um sistema de vácuo em forma de funil. Os investigadores devem também assegurar que a sala de ensaio experimental é adequadamente ventilado.
2. Preparação de Animais Experimentais
Fundamentação e visão geral: a cultura adequada e habitação das moscas vai reduzir a variabilidade nos dados. Isto é conseguido através da normalização e minimização do esforço experimentado pelas moscas. Por esse motivo, sem anestesia (CO 2 ou alternativas) é usado during de qualquer um dos seguintes passos do protocolo. Além disso, as moscas deve ser a mesma faixa etária em todo experiências e pontos de tempo para minimizar a variabilidade como é padrão para outras análises comportamentais, incluindo experiências de aprendizagem e memória 17.
Luz diferente: condições de escuridão pode ser usado para sondar a função do relógio circadiano em resposta comportamental de etanol. Para determinar se um ritmo diurno existe, os experimentos podem ser realizados no âmbito de um ciclo LD definido para medir o desempenho em específico Zeitgeber Times (ZT). ZT 0 representa madrugada e é definido como o tempo de luzes acesas em ciclos LD, enquanto ZT 12 é as luzes de tempo estão desligados com um ciclo CE 12:12 h. Sob as condições constantes, o tempo circadiano (CT) mede o tempo para que o animal, na ausência de sinais do ambiente, ou seja, o tempo de funcionamento livre, e é relacionada com o ciclo LD arrastamento anterior. Em tipo selvagem Drosophila, CT reflete a ZT anterior pela primeira vários diass em condições constantes como o período circadiano free-running e ritmos são ~ 24 horas. Para medir a modulação circadiano e eliminar efeitos de luz agudas sobre o comportamento, as moscas são arrastadas para claro e escuro e, em seguida, transferido para constantes condições de pouca luz (DD) antes de experimentos. Experimentos circadianos são realizadas no segundo dia de DD para medir o desempenho em específico circadiano Times (CT).
Em Drosophila, luz contínua (LL) condições resultar em disfunção circadiana com oscilações moleculares umedecido ou abolida de genes circadianos centrais e perturbação dos ritmos circadianos comportamentais como evidenciado pela atividade locomotora arrítmico 18-21 e memória arrítmico de curto prazo 17. O protocolo é otimizado para estudos circadianos e pode ser simplificada para outros experimentos. Todos os experimentos circadianos são realizados utilizando pouca luz vermelha (sobrecarga ambiente luz vermelha <1 lux em bancada; pequenas luzes vermelhas usadas em 12 polegadas de tubos~ 1 lux de luz).
- Traseiros as moscas a 25 ° C sob 0:12 hr luz: as condições de arrastamento escuros (LD).
- Recolhe moscas recém eclosed no final do período de luz do dia, no dia 1 e armazená-los durante 24 horas sob condições de LD em segurando frascos contendo uma pequena quantidade de alimento de alto concentração agar, para minimizar a viscosidade dos alimentos. Nota: Para garantir saudáveis, moscas normalmente desenvolvidos são coletados, apenas usar moscas coletadas nos primeiros dias após a eclosão começa em um frasco de cultura.
- Recolhe lotes de cerca de 30 (25-35) opera através de um aspirador no dia 2, para o fim do período de luz, e transferência para ampolas de detenção frescos.
- Use uma fonte de luz forte para dirigir moscas até o final do frasco. Dentro desta gama, o número exacto de moscas em cada frasco não é crítica como as observações comportamentais são relatados em percentagem com o número total de moscas contadas no fim de cada experiência.
- Manter moscas sob condições DD a 25 ° C for dois dias.
- No dia da experiência, coloca todas as moscas alojados em condições diferentes ou outras do que o quarto comportamento experimental no ambiente durante, pelo menos, 1 hora antes da experiência incubadoras. Aclimatação reduz a variabilidade devido a mudanças na temperatura ou umidade.
- Fazer observações em pontos de tempo de seis por dia (CT 1, 5, 9, 13, 17 e 21), a fim de testar a modulação do comportamento circadiano.
- Compare vários pontos de tempo dentro de um único conjunto de experimentos comportamentais para aumentar a robustez do desenho experimental e minimizar a variabilidade específica para um único experimento. Por exemplo, observações de um CT e CT 13 podem ser obtidos simultaneamente se duas incubadoras com horários claro-escuro opostos são usados para o arrastamento.
Nota: O procedimento anterior descreve a preparação dos animais experimentais para ensaios realizados em condições de escuridão constante circadiano. Luz diferente: condições de escuridão pode ser usado para sondar a função do relógionas respostas comportamentais ao álcool. Para determinar se existe um ritmo diurno os experimentos podem ser realizados no âmbito de um ciclo de LD para medir o desempenho em específico Zeitgeber Times (ZT). Além disso, o protocolo pode ser utilizado com moscas criadas sob condições de luz constante para testar experimentos disfunção circadiano. Para protocolos alternativos que testam moscas alojados em condições de luz, ensaios comportamentais ainda deve ser realizado sob condições de pouca luz. Moscas devem ser transferidas para o escuro durante 1 hora antes da experiência, para minimizar a variabilidade comportamental devido aos efeitos agudos de luz sobre o comportamento.
3. Observações comportamentais
Fundamentação e visão: O seguinte protocolo de administração de álcool é otimizado para observações sob fraca condição de luz vermelha. O Lorr duas medidas comportamentais e sedação representam dois pontos distintos de mosca embriaguez. Lorr representa um ponto final de embriaguez incorporando a perda of do motor e controle postural, que as medidas de sedação um ponto final muito tarde de intoxicação. Genótipo ou modulação circadiano podem afetar estas duas medidas de forma diferente; portanto, pode-se desejar examinar ambos. Em suma, as moscas são carregados nos frascos, o número de moscas que exibem Lorr ou sedação estão marcados a cada 5 min durante exposição ao vapor de álcool, e o número total de moscas contadas no fim da experiência.
- Antes de iniciar a experiência, executar o ar através do sistema (ar borbulhado através de garrafas de água e álcool), durante pelo menos 10 minutos e usar esse tempo para calibrar os fluxos de ar.
- Desligue a liberação rápida para parar o fluxo de ar. Coloque as moscas nos frascos, e volte a ligar o fluxo de ar e iniciar os temporizadores. Nota: Se as moscas que não respondem ou moscas mortas são deixados nos frascos de retenção, isso pode ser um indicativo de condições de estresse. Em geral, estas condições podem ser aliviados, alojando menos moscas nos frascos que prendem ou diminuir a viscosidade de alimentos usando um ligeiroly maior concentração de ágar durante a preparação de alimentos. Para as análises comportamentais ideais e variabilidade mínima entre os experimentos, as moscas deve ser saudável antes de experimentos.
- Para manter o tempo exato, utilize um cronômetro para controlar o tempo total de exposição ao álcool e usar um segundo temporizador de contagem de volta para marcar os 5 minutos de intervalo.
- Coloque um pedaço de papel branco sob os frascos para aumentar o contraste e visibilidade voar, especialmente sob condições de iluminação vermelha.
- Verifique o fluxo de ar regularmente durante um experimento para manter níveis constantes. Geralmente, uma vez que os fluxos de ar ter estabilizado, que se mantêm estáveis durante a duração da experiência.
- Contar o número de moscas que perderam o reflexo de endireitamento uma vez a cada 5 min por um período hr 1. Como a sensibilidade do álcool varia entre os genótipos e origens genéticas, pode ser desejável para realizar avaliações mais frequentes ou a realizar o ensaio para um longo período de tempo.
- Levante a slightl frascoy a partir da superfície, e dirigir a luz a partir de uma lanterna de luz vermelha para o papel por detrás do frasco. Mantenha as lanternas de mão vermelho a uma distância de pelo menos 12 polegadas para o frasco experimental para manter os níveis de luz não superiores a 1 lux para todos os experimentos sob condições de iluminação vermelha.
- Medir os níveis de luz usando um medidor de luz para estabelecer padrões para todos os experimentos.
- Determinar o número de moscas que perderam o reflexo de endireitamento, aplicando um toque firme para o frasco e contar quantas moscas não conseguem endireitar-se dentro de aproximadamente 4 segundos. Moscas que exibem Lorr ainda pode mover as pernas e asas, mas não pode transformar-se em pé.
- No fim da sessão, contar o número total de moscas em cada frasco.
Nota: Às vezes, uma única mosca pode ser preso entre a tampa eo lado quando a carga voa para os frascos experimentais. Como isto é feito no escuro, pode não ser facilmente notado por isso, é necessário contar o total de dormenteser de moscas no fim da experiência para calcular corretamente percentagens.
Além disso, este procedimento também pode ser utilizado para medir a sedação de moscas, que representa um ponto de extremidade de comportamento diferente. Enquanto moscas sedados perderam seu reflexo direito, sedação exige uma maior exposição ao álcool. Em termos de comportamento, a sedação pode ser caracterizado pela completa falta de atividade motora aparente com moscas permanecendo imóvel no frasco seguinte empresa aa torneira para o frasco. Para sedação, contar o número de moscas que permanecer imóvel sem perna balançando após a entrega de um toque firme do frasco. Além disso, o frasco pode ser rolado lado para o outro para determinar se as moscas individuais ainda mantêm o seu reflexo agarrando.
4. Análise de Dados
- Determinar a percentagem LORR em cada tempo avaliado com base no número total de moscas em cada frasco.
- Estimativa diferenças entre momentos de tempo circadiano ou estirpes por calculating a Lorr 50% para cada amostra, que cai dentro da porção linear da curva sigmóide (veja a Figura 2 abaixo).
- Estatísticas alternativas:
- Se as comparações entre genótipos são planejadas, é desejável para analisar todo o curso do tempo usando medidas repetidas ANOVAand para determinar o intervalo de pontos no tempo que as diferenças são significativas com testes post-hoc (Figura 3). Para estes testes, é preferível utilizar um valor de 0,001. Isso permite que as diferenças de tempos de exposição individuais a serem avaliadas, bem como as diferenças entre os genótipos na inclinação da curva.
- As diferenças na sensibilidade para pode ser determinada por períodos específicos de exposição do álcool para uma resposta específica, tais como a sedação a partir da porção linear do gráfico (Figura 4).
- As diferenças entre estirpes ou pontos de tempo circadiano pode ser estimada utilizando padrão F-estatísticas e testes post-hoc.
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Representative Results
Modulação circadiano de Álcool Sensibilidade usando o Lorr 50% como um marcador.
Um exemplo representativo, mostrando a modulação circadiana na sensibilidade do álcool durante o dia é apresentada na Figura 2. LORR foi medida a seis pontos de tempo durante o 2o dia de DD em Canton-S e a 50% LORR foi determinada para cada ponto de tempo. A análise mostrou um efeito significativo da hora do dia (ANOVA: F 5,45 = 7.39, p <0,001, N = 6-10 por tempo ponto). O teste LSD Fisher mostrou diferenças significativas entre CT1 vs CT5, CT5 vs CT13, CT5 vs CT17, CT5 vs CT 21, CT9 vs CT13, CT9 vs CT17 e CT9 vs CT 21. Este resultado é consistente com os nossos resultados publicados anteriormente 1.
Diferenças entre o tipo selvagem e moscas mutantes.
O segundo exemplo utiliza séries temporais para mostrar diferenças na Lorr e sedação entre moscas do tipo selvagem Canton-S e flis portadores de uma mutação de perda de função branco (w 1118) no mesmo fundo genético (Figura 3). A mutação w 1118 é de particular interesse para os pesquisadores de Drosophila como linhagens transgênicas são muitas vezes criados usando essas moscas e muitas linhas de mutantes para genes do relógio circadiano também têm a mutação w 1118. Os resultados são apresentados como uma série de tempo (Figura 3), com os dados apresentados para cada 5 min durante todo o período de exposição. As observações estão limitados a 60 minutos para evitar os efeitos da rápida acumulação de tolerância 22-24. Os w 1118 mutantes exibir significativamente reduzida sensibilidade Lorr em resposta a vapor de etanol do que a Canton-S (ANOVA entre sujeitos F 1,10 = 57,12, p <0,001, N = 6). Diferenças de significância (a = 0,001) foram encontrados neste experimento a partir de 20 min por 60 min (Figura 3A 1118 e w Canton-S também foram encontradas na taxa de sedação (ANOVA entre sujeitos F 1,10 = 137,301, p <0,001, N = 6). No ensaio de sedação, diferenças significativas (a = 0,001) foram encontrados em minutos 50, 55 e 60 (Figura 3B). Para além da ausência de pigmentos de rastreio nos olhos, as w 1.118 mutantes também reduziram os níveis de serotonina, dopamina e histamina 25,26. Estas alterações nos níveis de aminas biogénicas pode explicar a alteração da sensibilidade de etanol nas w 1.118 mutantes 27,28. Assim, controlando o nível de expressão em branco dos genótipos testados pode ser essencial para uma avaliação precisa da sensibilidade etanol.
Modulação circadiana da sedação.
No terceiro exemplo, medimos o percentual de Canton-S voa tranqüilod depois de um determinado período de tempo para determinar se há um efeito circadiano do álcool sobre sedação (Figura 4). Comparou-se a percentagem de moscas sedados em 40 min (30% de vapor de álcool) em CT 5 e 17 e os resultados mostram que há um número significativamente menor moscas sedados durante o dia, em comparação com a exposição de álcool durante a noite (ANOVA: F = 1,20 6,21, p = 0,022, N = 10 (CT5) & 12 (CT17)). As moscas não alcançou a marca de sedação 50% em uma hora como as observações foram feitas sob nossas condições padrão Lorr, a fim de fazer uma comparação direta possível. Observações para além da hora são problemáticas devido ao acúmulo de tolerância rápida 22-24. Nesta experiência, menos do que 25% das moscas em qualquer ponto de tempo circadiano foram sedados em 40 min, o que indica que há uma diferença na sensibilidade a sedação da borda dianteira entre esses grupos. A coleta de dados neste momento no início de sedação é um indicando útilião que existem diferenças, no entanto, a capacidade de determinar o efeito do tratamento sobre a forma da distribuição de respostas de sedação é limitada. Para determinar se há diferenças em toda a distribuição da sedação, uma concentração de etanol superior deve ser usado para assegurar uma taxa mais rápida da sedação.
Figura 1. O Flybar para medir a sensibilidade de álcool e sedação em moscas de fruta.
.. Figura 2 exemplo representativas mostrando modulação circadiano significativa na sensibilidade do álcool durante o dia (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p <0,001, N = 6-10 por ponto de tempo; diferenças significativas entre CT5 vs CT1, CT13, CT17, CT21 e CT13 e CT9 vs, CT17, CT21 e).
Figura 3. Efeitos do álcool sobre as respostas comportamentais são significativamente diferentes entre o tipo selvagem Canton-S moscas e os brancos 1118 moscas mutantes de perda de função. A) moscas Canton-S mostram aumentou significativamente a sensibilidade ao álcool, medida pelo Lorr comparação com voa com o mesmo fundo genético portador da mutação branca (ANOVA entre sujeitos F 1,10 = 57,12, p <0,001, N = 6). B) Canton-S moscas são mais suscetíveis ao álcool sedação do que w 1118 mutantes (ANOVA entre sujeitos F 1,10 = 137,301, p <0,001, n = 6). *p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
. Figura 4 Dados representativos comparando a porcentagem de Canton-S moscas sedado a 40 min entre CT 5 e CT 17 do tipo selvagem moscas demonstrar significativamente maior aumento da sedação inicial no CT 17 em relação ao CT 5 (ANOVA:. F 1,20 = 6,21, p = 0,022, N = 10 (CT5) & 12 (CT17)).
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Discussion
Os custos de abuso de álcool e alcoolismo para a sociedade é enorme, tanto em termos de custos humanos e econômicos 30,31 29. Drosophila como modelo oferece um sistema rápido e versátil para examinar rapidamente as respostas comportamentais de um grande número de indivíduos e, como tal, tem sido amplamente utilizado tanto para álcool 5,7,32-34 e pesquisa circadiano 35-37.
Aqui, descrevemos um protocolo simples para a administração controlada de vapor de álcool às moscas adultas em condições circadianos.
Moscas cultivadas sob condições padronizadas são expostos ao vapor de álcool por 1 hora durante o qual o número de moscas que perderam o seu reflexo de endireitamento são marcados a cada 5 min. O protocolo aqui descrito é otimizado para experimentos circadianos por causa das exigências adicionais para arrastamento e habitação em condições constantes. Várias etapas podem ser simplificaçãoed para estudos genéricos, removendo esses passos que são essenciais para os experimentos circadianos, como o armazenamento no escuro por pelo menos um dia ou fazendo os experimentos sob condições de iluminação vermelha. Este protocolo pode também ser usado para expor grande número de moscas de uma forma controlada para concentrações variadas de álcool para as análises bioquímicas ou moleculares subsequentes. Para consistência com outros experimentos comportamentais Drosophila como a aprendizagem e observações de memória, medição de respostas comportamentais em dim condições de luz vermelha pode ser desejada mesmo para experiências não-circadianos.
Variação entre repetições independentes do experimento pode obscurecer pequenas diferenças entre mutantes ou estirpes transgênicos ou entre momentos circadianos. Por conseguinte, recomenda-se que as amostras de teste de várias estirpes ou pontos de tempo em simultâneo circadianos (ver os exemplos), de modo que "réplica" pode ser adicionado como uma variável aleatória, a fim de eliminar oefeito da variação entre réplicas.
Sensibilidade para álcool varia entre estirpes. Percentagens de álcool (a porcentagem de fluxo de ar borbulhando através do álcool) precisam ser ajustados em conformidade. Como pode ser visto na Figura 3, as moscas possuindo a mutação branco são menos susceptíveis aos efeitos da exposição do álcool do que o tipo selvagem Canton-S voa. Para a análise de linhas que transportam a mutação de branco, que pode ser desejável para aumentar a percentagem de álcool até que as moscas são expostos de forma a realizar o ensaio comportamental no mesmo intervalo de tempo de outras experiências, como uma exposição mais longa de álcool pode resultar na tolerância rápida desenvolvimento. Para mutantes extremamente sensíveis e para as experiências nas quais é necessária para diminuir a percentagem de álcool utilizado, como o observado para as moscas contendo uma mutação no gene amarelo, o fluxo de ar pode ter que ser aumentado para calibrar o álcool saturado com precisão o fluxo de ar. Pequenos aumentos ou dezembroreases (± 10%) no total de fluxo de ar (faixa de fluxo de ar funcional de 900-1,100 ml / min para 4 frascos de observação) não parecem afetar negativamente as moscas.
Observações para além de 1 hora deve ser evitado sempre que possível devido ao potencial de acúmulo de tolerância rápida em moscas 22-24 que afeta sensibilidade ao álcool. Em vez disso, determinar a porcentagem de álcool para cada estirpe, que resulta em um valor aproximado de 50% Lorr por 30-40 min. Se for necessária a comparação de várias linhagens independentes, escolher um único percentual de álcool que funciona para todas as estirpes.
Este protocolo depende fortemente as observações comportamentais, de forma estrita adesão a um protocolo padronizado é essencial para evitar deriva em observações comportamentais ao longo do tempo. Se possível, as observações comportamentais deve ser realizada de modo que o observador é cego ao ponto de genótipo ou tempo de ser testado. A fim de detectar viés potencial com base nesses e outros fatores desconhecidos,é aconselhável para analisar os dados sobre um curso de tempo e para verificar que as observações permanecem dentro da mesma gama ao longo da série experimental.
O Flybar set-up oferece certas vantagens sobre outros métodos de administração de álcool para moscas, principalmente para pesquisadores de graduação ou estudos circadianos sobre os efeitos negativos do etanol. Um dispositivo alternativo para medir o efeito do álcool sobre o controlo do motor de moscas é a inebriometer, uma coluna vertical no qual o vapor de etanol é circulado através do aumento das chicanas e a perda de controlo da postura ou a sensibilidade da mosca pode ser medido através da determinação do tempo que leva a cair para o fundo da coluna de 38,39. O inebriometer fornece uma leitura automática de controle de perda de postura e provou valiosa para a pesquisa de álcool em Drosophila 9,22,39,40, mas este paradigma comportamental exige um equipamento relativamente caro, o espaço para o aparelho, e o tempo para calibrare otimizar condições. Assim, o inebriometer pode não ser adequado para muitos laboratórios de ensino de graduação com orçamentos ou espaço limitado, ou para os pesquisadores realizam ensaios circadianos. Um outro método de entrega de álcool para as moscas e medindo sedação envolve a colocação de uma pequena quantidade de álcool líquido sobre um material absorvente, quer na parte superior ou na parte inferior de um recipiente e, em seguida, permitindo que o álcool para vaporizar, com tempo de 41,42. À medida que a concentração de vapor de álcool aumenta com o tempo, as respostas comportamentais podem ser avaliadas. Embora este método de entrega é fácil de set-up, a quantidade de vapor de álcool para que as moscas são expostos varia com o tempo e condições. Por questões experimentais em que as diferenças são avaliadas em taxas iniciais de sensibilidade ou sedação, tais como a modulação circadiano, é desejável ter um nível constante de vapor de álcool entregue para as moscas. Além disso, a exposição de um grande número de moscas para uma quantidade constante do álcool exposure, como é realizada com a flybar, é desejável para o cumprimento exacto dos ensaios celulares e bioquímicos a jusante. Outro método de entrega do álcool às moscas comuns na pesquisa de álcool no início Drosophila envolvida misturar o álcool na comida como ele foi preparado. Enquanto este método é fácil e requer pouco set-up, que é mais adequada para a exposição crônica do álcool ao longo de dias, como a concentração de álcool mudanças com o tempo.
, Métodos automatizados mais sofisticados também estão disponíveis para avaliar as respostas locomotoras de moscas da exposição ao álcool, incluindo a gravação de vídeo e atividade de software de análise de imagem 7,43. Estes são particularmente poderosa para avaliar os efeitos, hiper-ativando positivos do etanol. No entanto, estes métodos automatizados pode ser proibitivamente caro para projetos de pesquisa de graduação ou de laboratórios de ensino e não pode ser perfeitamente concebidos para a análise de um grande número de moscas sob condições circadianoções (por exemplo, captura de vídeo em ambientes escuros requer equilibrada e difundir iluminação infravermelho e câmeras sensíveis infravermelhas). Acreditamos que o Flybar fornece uma set-up, o método de custo-eficiente sistema de entrega fácil para o álcool e a avaliação das respostas comportamentais ao álcool que é bem adequado para uma variedade de condições e projetos de laboratório.
MODIFICAÇÕES Protocolo:
O protocolo descrito acima tem como objetivo analisar o efeito da exposição ao álcool na perda-de-alinhamento-Reflex num contexto circadiano. No entanto, o protocolo pode ser facilmente modificado para acomodar outros tipos de experiências de álcool.
Examinando a resposta ao álcool em 12 horas-12 horas claro-escuro (LD; Zeitgeber Tempo) condições: Manter moscas menos de 12 horas: 12 horas ciclo LD até o experimento. Transfira as moscas para o escuro, aproximadamente 1 hora antes do experimento realizado durante a fase de luz (ZT 1, 5E 9) do dia. Isto irá assegurar que o efeito agudo da luz não é confundir os resultados.
Examinando a resposta ao álcool sob condições de luz constante: moscas cultura sob condições de luz constante resulta na interrupção do seu relógio circadiano 18-21 e respostas arrítmicos a exposição ao álcool 1. As moscas podem ser transferidas para o escuro, aproximadamente 1 hora antes da experiência de modo a que as moscas são testadas sob as mesmas condições como as moscas mantidas em condições de LD ou DD.
Sedação: moscas que estão sedados pode ser separada da Lorr voa porque moscas permanecem imóveis no fundo do frasco, enquanto Lorr voa ainda vai movimentar as asas, cabeça e pernas. Moscas que exibem Lorr ainda responder com movimentos sutis quando o frasco é perturbado. Sedação de moscas é determinado pela contagem do número de moscas permanecendo imóvel depois de um firme tap para o frasco. Além disso, a laminagem do frasco pode ser usado para determinar se as moscas individuais ainda mantêm a sua reflex agarrar.
Recuperação: O ensaio comportamental pode ser estendido através da medição de recuperação como um parâmetro adicional de resposta de álcool. Interrompa a exposição ao álcool e continuar a fazer observações sobre o Lorr cada 5 min. Continuar o fluxo de ar humidificado por meio dos frascos durante períodos de recuperação.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
O financiamento para esta pesquisa foi fornecido por um programa em Neurociências Prêmio da Florida State University College of Medicine e apoio do Departamento de Ciências Biológicas da FSU. Financiamento adicional foi fornecida por um Grant-in-Aid do Fundo de Investigação do Álcool Bebidas Fabricante.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y-connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature air regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature air regulator mounting bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini flashlights with red filters | Mag-light |
References
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