Summary
في هذه الورقة، نحن تصف الإجراء الأمثل لاستخراج وتحليل البروستاجلاندين وغيرها من eicosanoids
Abstract
انواع معينة ايليجانس والناشئة باعتبارها نموذج حيواني قوية لدراسة بيولوجيا الدهون 1-9. البروستاجلاندين هي فئة هامة من eicosanoids، والتي هي إشارات الدهون المشتقة من الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة (PUFAs) 10-14. هذه الجزيئات يشير يصعب الدراسة بسبب وفرة منخفضة وطبيعة رد الفعل. ميزة مميزة البروستاجلاندين هو بنية حلقة السيكلوبنتان تقع داخل العمود الفقري الأحماض الدهنية. في الثدييات، يمكن تشكيل البروستاجلاندين عن طريق انزيمات الأكسدة الحلقية الممرات ومستقلة تعتمد على إنزيم 10،15. C. ايليجانس يجمع مجموعة واسعة من البروستاجلاندين مستقلة عن cyclooxygenases 6،16،17. تم التعرف على فئة كبيرة من البروستاجلاندين F-سلسلة، ولكن دراسة eicosanoids هو في مرحلة مبكرة مع مجالا واسعا لاكتشافات جديدة. نحن هنا وصف الإجراء لاستخراج وتحليل البروستاجلاندين وeicosanoids الأخرى. الدهون مشحونةيتم استخراج S من الثقافات دودة الشامل باستخدام تقنية استخراج السائل السائل وتحليلها من قبل اللوني السائل بالإضافة إلى electrospray التأين بالترادف الطيف الكتلي (LC-ESI-MS/MS). إدراج النظير بالديوتيريوم البروستاجلاندين، مثل PGF 2 α-D 4 كما ينصح معيار الداخلية للتحليل الكمي. رصد رد فعل متعددة أو MRM يمكن استخدامها لقياس ومقارنة أنواع البروستاجلاندين محددة بين الحيوانات البرية من نوع ومتحولة. التحلل بفعل الاصطدام أو MS / MS يمكن استخدامها للحصول على معلومات حول الميزات الهيكلية الهامة. اللوني السائل قياس الطيف الكتلي (LC-MS) بالاشعة مسح لمجموعة وكتلة مختارة، مثل م / ض 315-360 يمكن استخدامها لتقييم التغيرات العالمية في مستويات البروستاجلاندين. نحن نقدم أمثلة على كل التحليلات الثلاثة. وهذه الطرق توفر للباحثين مع مجموعة أدوات لاكتشاف eicosanoids الرواية وترسيم ممراتها الأيضية.
Introduction
البروستاجلاندين (PGS) هي فئة هامة من الهرمونات الدهون التي تم التحقيق فيها على نطاق واسع وتورط في تنظيم الاستنساخ، والحصانة، والتنمية في مجموعة واسعة من الكائنات الحية 12-14. هي مناسبة بشكل مثالي لPGS تحليلات شاملة بيولوجيا الأنظمة لأنها تضم سلسلة من الدهون المستمدة من السلائف الشائعة (ق). الديدان الخيطية C. ايليجانس هي واحدة من الكائنات النموذج الأكثر استخداما لمعالجة المسائل الأساسية في علم الوراثة وبيولوجيا الأنظمة.
لقد أثبتنا أن C. ايليجانس يجمع PGS F-سلسلة دليل أن الحيوانات المنوية القادرة على الحركة إلى البويضات 3،6،16. وقد تم تحديد PGS F-سلسلة المستمدة من PUFAs 20 الكربون مع ثلاثة، أربعة، وخمسة السندات المزدوجة، التي تتألف منها F1، F2، F3 والطبقات، على التوالي 3،16. وقد تم تجميع هذه PGS مستقلة من الانزيمات انزيمات الأكسدة الحلقية، بعد PGF الفراغية 2α 1α وPGF لا تزال شركة جنرال الكتريكnerated. لتحليل نوعي وكمي للC. ايليجانس PGS، LC-MS/MS هو تقنية تحليلية قوية وحساسة. قبل تنفيذ هذا التحليل، فإنه من المهم لتطوير طريقة استخراج الأمثل لأداء العملية التحليلية يعتمد بشكل كبير على جودة استخراج. يمكن اللوني السائل وقياس الطيف الكتلي توفر سوى الشامل المتوقع لتوجيه الاتهام نسبة (م / ض)، وكذلك مرغوب فيه ذروة الشكل والوقت الإبقاء على أيون الوالد PG. التنميط الأيضية من PGS في C. ايليجانس هي مهمة صعبة تتطلب مختلف استراتيجيات اكتساب MS.
LC-MS مسح كامل أو المسح الضوئي (Q1 المسح الضوئي) لديه ميزة ضمان سوف PGS أن معظم ionizable توليد استجابة الطيفي الشامل. في حين يوفر المسح مسح معلومات مفيدة عن التنميط مجموعه PGS فيما يتعلق البرية من نوع ومتحولة C. ايليجانس، والكشف عن PGS قاصر للخطر نظرا لحساسية منخفضة. Nevertheأقل، يمكن أن LC-MS المسح مسح إعطاء نظرة شاملة من PGS ومفيد بشكل خاص لتحليل المسوخ وتوقع أن تؤثر على عملية التمثيل الغذائي للسكان PG كبيرة.
في تحديد المستقلب، يتم تنفيذ تحليل LC-MS/MS المعايير PG تصنيعه كيميائيا أولا للحصول على الأطياف ايون المنتج ومركبات المرجعية. ويمكن مقارنة هذه الأطياف لطيف وهو مستقلب غير معروف. يتم استخدام رصد وضع العديد من رد فعل (MRM) لتعزيز حساسية وخصوصية. ويتم إنجاز تجربة MRM لتحديد أيون / المنتج أيون التحول الشامل الرئيسي للمركب. من خلال معرفة كتلة وهيكل التحاليل الهدف، فمن الممكن التنبؤ التحولات MRM النظرية لكثير من مستقلبات غير معروفة.
طريقة LC-MS/MS الأمثل لالتنميط PGS ايزوميريا في C. ولم ترد أي أنباء ايليجانس. هنا نحن تصف استخراج ونهج متكامل مطياف الكتلة المكونة من LC-MS وLC-MS / MS طرق للكشف عن، والتحديد الكمي، والتحقيق C. ايليجانس PG الأيض. ويمكن تطبيق هذا النهج لeicosanoids الأخرى.
Protocol
البروتوكول كما هو موضح أدناه وينقسم إلى ثلاثة أقسام: الثقافة دودة، واستخراج البروستاجلاندين، وتحليل البروستاجلاندين. كما لاحظت، هناك نقاط متعددة عند عينات يمكن تخزينها مؤقتا في -80 درجة مئوية أو -20 درجة مئوية.
1. ثقافة دودة
نوصي حوالي 6 غرام من الديدان المرحلة المختلطة للLC-MS/MS شاملة. وينبغي أن يوفر ما يكفي من المواد لكشف لا يقل عن ستة حقن منفصلة. لتقدير حجم PGS معروفة من قبل MRM في حقنة واحدة أو اثنتين، 1-2 غرام كافية. تحليل مقتطفات من الثقافات المتزامنة التي تتكون من مرحلة محددة من الممكن أيضا. يمكن زراعتها تصل إلى 4 سلالات مختلفة في نفس الوقت. على سبيل المثال، وهو نوع البرية السيطرة وثلاث سلالات متحولة مختلفة.
- إعداد 65 X-الكبيرة (16 سم) لوحات NGM والبكتيريا المركزة للتغذية التكميلية. استخدام NA22 البكتيريا للبذار. لجعل البكتيريا المركزة للتغذية تكميلية، غروث لا يقل عن أربعة لترات من NA22 في المتوسط LB لل16-24 ساعة. تدور باستمرار، وإزالة طاف، والبكتيريا resuspend في 100 مل من M9 العازلة. قد تكون هناك حاجة 200-400 مل من هذا المحلول البكتيرية المركزة لكل سلالة دودة. تخزينها في 4 درجة مئوية.
- بدء الثقافات دودة على 5 لوحات X-كبير. تنمو الديدان لحوالي 3-4 أجيال حتى لوحات مليئة البالغين حامل. وينبغي أن يضاف البكتيريا المركزة لوحات لمنع المجاعة، حسب الاقتضاء (~ 1 مل / لوحة والسماح جافة تماما قبل إعادة تركيب الغطاء).
- غسل المنحرفين حامل قبالة لوحات مع M9 العازلة وجمع الديدان في 50 مل أنبوب البولي بروبلين المخروطية.
- تسمح المنحرفين حامل لتستقر في القاع (عادة حوالي 3-5 دقائق). إزالة طاف، بما في ذلك البكتيريا، والبيض، والديدان مرحلة اليرقات. resuspend في 15 مل M9 العازلة والمزيج بلطف.
- نقل 200 ميكرولتر من تعليق دودة إلى كل من لوحات NGM المصنفة 60. تفريق الديدان عبر لوحات. إبقاء حل دودة مختلطةجيدا حتى جميع لوحات تم المصنفة للتأكد من أنها تستقبل أعدادا متساوية تقريبا من الديدان.
- تكملة مع البكتيريا المركزة حسب الحاجة (~ 1 ml/plate/12 إلى 24 فترة ساعة) لمنع المجاعة. السماح لوحات في الهواء الجاف قبل استبدال الأغطية. تنمو الديدان لمدة 2-4 أجيال، اعتمادا على العدد الأصلي من الديدان المصنف، أو حتى لوحات مليئة البالغين حامل.
- الحصاد لوحات دودة سلالة واحدة في وقت واحد. غسل الديدان قبالة لوحات مع M9 العازلة وجمع في 50 مل أنابيب البولي بروبلين (على سبيل المثال 6 أنابيب). استخدام M9 العازلة لغسل لوحة، ثم نقل المخزن المؤقت دودة مملوءة إلى لوحة المقبل. بعد غسل وعدد (على سبيل المثال. ال 10) من لوحات، ونقل المخزن المؤقت دودة مملوءة إلى أنبوب مل 50. ملء أنبوب إلى الأعلى مع M9 العازلة. تكرار غسل لبقية لوحات.
- كما من البالغين حامل تترسب في القاع في 5-6 دقائق، وإزالة طاف (~ 35 مل)، ودمجهما في واحد أو اثنين من الأنابيب. ملء أنابيب إلى 50 مل مع الابعش M9 العازلة، واسمحوا الوقوف لمدة 3-5 دقائق، وإزالة طاف مغادرة البالغين حامل. كرر 3 مرات أو حتى طاف هو شفاف.
- باستخدام كبيرة تتحمل ماصة باستير، كما نقل العديد من الديدان ممكن لاثنين من البولي بروبلين 15 مل أنابيب مخروطية. تدور باستمرار في إطار التعاون الإقليمي 1،000 (3،500 دورة في الدقيقة ~ في CentraSL2) لمدة 5 دقائق في جهاز للطرد المركزي السريرية. إزالة طاف وتكرار حتى يتم نقل جميع الديدان ومكعبات في نفس الأنبوب. إزالة أكبر قدر ممكن من طاف والديدان تخزينها في -80 درجة مئوية. أكرر للجميع سلالات.
2. استخراج البروستاجلاندين
يتم عرض الكواشف اللازمة لاستخراج أدناه. تم تعديل الأسلوب من أن من Golovko وميرفي 17 ويشمل استخراج الأسيتون تليها تنقية السائل السائل، مما يعزز LC-MS/MS حساسية. ويستخدم رصاصة خلاط الخالط 5 في الإجراء، على الرغم من أن نتائج مماثلة يمكن الحصول عليها مع الخالط Dounce. hydroxytolue بوتيلوتستخدم NE (BHT) والتبخر تحت النيتروجين (N 2) الغاز لمنع الأكسدة. وينبغي siliconized جميع الأواني الزجاجية (Sigmacote) للحد من الدهون ملزم. استخراج مع المذيبات العضوية يجب أن يؤديها في غطاء الكيميائية.
- وزن 50 مل أنبوب البولي بروبلين المخروطية. نقل ما يقرب من 6.0 غرام من الديدان المجمدة من 15 مل أنبوب مخروطي تخزينها في -80 درجة مئوية من خلال قطع أنبوب بشفرة حلاقة الساخنة القريبة من علامة مل 6.5. ملعقة الميثانول تنظيفها يمكن استخدامها لإزالة المجمدة دودة بيليه من أسفل الأنبوب. من خلال قطع بيليه لاسترداد الجزء السفلي، والديدان اليرقات أقل كثافة والبكتيريا المتبقية من الجزء العلوي من بيليه وتركت وراءها.
- نقل الديدان المجمدة إلى ما قبل وزنه 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. إذا ويجري تجهيز عينات متعددة، واستخدام نفس المبلغ (6.0 غ) من الأنسجة للدراسات المقارنة. وذوبان الديدان إلى عجينة، وإضافة أو إزالة الديدان مع ملعقة للحصول على كتلة تريد. اختياري: إعلاند 1.00 نانوغرام من PGF 2α-D4 القياسية باعتبارها الرقابة الداخلية للكفاءة الاستخراج.
- إضافة 12 مل من الجليد الباردة 02:01 الأسيتون / المالحة مع 0.005٪ BHT إلى تعليق دودة ومزيج جيد من قبل vortexing. الاستغناء عن 1.5 مل من الطين دودة إلى كل من اثني عشر 5 مل أنابيب بلاستيكية قائمة بذاتها لاستخدامها في خلاط رصاصة.
- إضافة 0.7-0.8 مل من 0.5 ملم استقرت قطر سيريا الخرز أكسيد الزركونيوم إلى كل أنبوب 5 مل. إغلاق قبعات بإحكام وتحميل 12 الأنابيب في خلاط رصاصة الخالط 5. تشغيل الخلاط لمدة 3 دقائق على سرعة 8-9 ووضع أنابيب على الجليد. تأكد من إغلاق الأغطية بإحكام جدا أو محتوى قد تمتد إلى. تحقق 10 ميكرولتر من جناسة من أنبوب واحد على شريحة باستخدام المجسام. يجب أن يكون هناك عدد قليل جدا من الديدان سليمة المتبقية. تكرار في نفس السرعة لمدة دقيقة أخرى، إذا لزم الأمر.
- نقل الخليط بالتساوي إلى أربع 10 مل أنابيب زجاجية المخروطية باستخدام 9 "ماصة باستير. تجنب حبات نقل. تغسل حبات من ثلاثة أنابيب sequentially مع 1 مل 1:2 الأسيتون / المالحة التي تحتوي على BHT. كرر لأنابيب أخرى حتى يتم غسلها كل الخرز. نقل الحل المتبقية (~ 4 مل) إلى 10 مل أنابيب الزجاج ووضعها على الجليد.
- أجهزة الطرد المركزي في 10 مل أنابيب زجاجية في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي السريرية في ~ 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة. نقل طاف من كل أنبوب إلى نظيفة 10 مل زجاج أنبوب مخروطي الشكل.
- في غطاء الكيميائية، إضافة حجم مساو من الهكسان لكل 10 مل أنبوب زجاجي. على سبيل المثال، إضافة 3.5 مل الهكسان إلى 3.5 مل الأسيتون / محلول ملحي. دوامة في أقصى سرعة لمدة 30 ثانية.
- أجهزة الطرد المركزي في 10 مل أنابيب زجاجية في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي السريرية في ~ 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل المرحلة العليا التي تحتوي على الدهون الهكسان واتهم محايد.
- يحمض مرحلة انخفاض الرقم الهيدروجيني إلى 3.5 باستخدام 2 M حمض الفورميك (حوالي 100-150 ميكرولتر). اختبار الرقم الهيدروجيني باستخدام شرائح الأس الهيدروجيني.
- إضافة حجم مساو من كلوروفورم لكل أنبوب. دوامة في أقصى سرعة لمدة 30 ثانية وأجهزة الطرد المركزي أنابيب في 4 درجات مئوية طNA الطرد المركزي السريرية في ~ 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة.
- إزالة والتخلص من الطبقه المائيه العليا. إدراج غيض ماصة من خلال أي الطور البيني حليبي المتبقية إلى المرحلة كلوروفورم أقل، وتجنب الطور البيني. جمع المرحلة أقل من كل من 4 أنابيب لنظيفة 15 مل أنبوب زجاجي مخروطي. في احتضان -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة. عند هذه النقطة، يمكن تخزين استخراج في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
- أخذ المقتطف من الثلاجة وتجاهل ما تبقى من حليبي الطبقة العليا مائي، إذا كان موجودا. نقل المرحلة كلوروفورم إلى المسمى تفلون مبطنة ونصف الدرهم قارورة من الزجاج باستخدام الماصة باستور جديدة. في غطاء الكيميائية، يتبخر جزء قابل للذوبان الكلوروفورم إلى جفاف في إطار تدفق لطيف من N 2 الغاز. يمكن تخزين استخراج المجففة في -20 درجة مئوية لمدة تصل الى 2 أسابيع. يظهر مخطط شامل يستخدم لاستخراج PG والتحليل في الشكل 1.
3. تحليل البروستاجلاندين
- إعداد الأوراق الماليةحلول البروستاجلاندين المرجعية الفردية، مثل PGF 2α أو PGF 2 α-D4 (1 ميكروغرام / مل) في الميثانول وتمييع مع الميثانول: الماء (8:2 V / V) للحصول على حل العاملة. إعداد سلسلة من التخفيفات (100، 10، 1، 0.1، 0.01 نانوغرام / مل) لإنشاء منحنى القياسية.
- إضافة 200 ميكرولتر الميثانول: الماء (8:2 V / V) إلى C. المجففة ايليجانس استخراج الدهن (ق) وتخلط جيدا. إذا تم استخراج أقل من 6 غرام من الأنسجة دودة، ينبغي معلق استخراج المجففة في حجم أقل من الميثانول: المحلول المائي.
- إعداد المرحلة المتنقلة تتكون من حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ في الماء [A] والأسيتونتريل التي تحتوي على حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ [B].
- إعداد الاوتوماتيكى في 4 درجات مئوية ووضع قوارير عينة في 70 العد 1.5 مل رف قارورة.
- يوازن التآزر المائية عمود RP-C18 مع حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ في معدل تدفق 0.2 مل / دقيقة لمدة 5 دقائق.
- حقن العينة (20-50 ميكرولتر) في العمود. أداء بداية شطف التدرججي مع 10٪ B وتصل إلى 80٪ B 0-11 دقيقة، 80-100٪ B 11-14 دقيقة، والعودة مرة أخرى إلى 10٪ B في 16 دقيقة. مجموع وقت التشغيل هو 20 دقيقة. وتظهر مرات الاحتفاظ من 13 المعايير الأصيلة في الجدول 1 للإشارة 3.
- يعرض العمود النفايات السائلة في مطياف الكتلة باستخدام واجهة ESI التشغيل في وضع الأيونات السالبة. ويستخدم النيتروجين باعتبارها البخاخات والغاز الستار (CUR = 10). يتم تعيين الغاز الاصطدام، والطاقة الاصطدام، ودرجة الحرارة في 10، -35 فولت و 600 درجة مئوية، على التوالي. يتم تعيين المحتملة Declustering (DP)، الاصطدام الطاقة (CE)، وإمكانية خروج الخلية (CXP) في -90، -35 و -10، على التوالي.
- لاجراء الفحوصات مسح (المسح Q1)، استخدام وضع الأيونات السالبة في النطاق الشامل من م / ض 315-360 لمعظم PGS (الشكل 2). ويمكن تغيير المدى، اعتمادا على كتلة مركب (ق) من الفائدة. استخراج الأيونات من المجموع الحالي ايون (TIC) من LC-MS المخططات الاستشرابية أيون وتحديد ما إذا كان المقتطفالأيونات تيد تتوافق مع أيونات deprotonated أو معقد إضافي، أو إلى أيونات شظية.
- للتجارب MRM، انتقال كتلة m / Z يستخدم 355/311 للكشف عن فئة F1، م / ض يستخدم 353/193 للفئة F2، ويستخدم م / ض 351/193 أو 351/191 للفئة F3 (الشكل 3). يستخدم MRM أيضا للكشف عن معيار الداخلية (على سبيل المثال، م / ض 357/197 لPGF 2α-D4) وتوليد منحنى القياسية. انظر ميرفي وآخرون. للحصول على معلومات إضافية حول التحولات الشامل PG 18.
- لMS / MS التجارب، استخدم م / ض 355 لفئة F1، م / ض 353for فئة F2، وم / ض 351for F3 PGS فئة. C. ايليجانس MS / MS البيانات للPGS F-series هو متاح في الشكل 4 و الجدول 2 3،16. MS / MS البيانات للeicosanoids الثدييات هو متاح في www.lipidmaps.org .
- معالجة البيانات التحليلية باستخدام Analysر البرنامج (النسخة 1.4.2، النظم البيولوجية التطبيقية).
Representative Results
تم تنفيذ إعداد العينات من قبل استخراج السائل السائل مقتبس من Golovko وميرفي 17. وقدمت الانتعاش ممتازة من المعيار الداخلي (PGF 2α-D4). المخطط العام لاستخراج PG من C. ويرد ايليجانس في الشكل 1. تم تحسين ظروف الكروماتوغرافي لتوفير فصل خط الأساس من> 30 المعايير eicosanoid (ويبين الجدول 1 13 المعايير). توفير العمود المائي روبية (250 X 2.0 ملم معرف) مع الماء والأسيتونتريل التي تحتوي على حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ أفضل فصل وحساسية. بالاشعة المسح من النوع البري والدهون 3 مقتطفات متحولة هو مبين في الشكل 2 الصعيدين العالمي وثيقة من الأيونات داخل النطاق الشامل من 315-360 وحدة الكتلة الذرية. الدهون 3 (wa22) المسوخ تفتقر معظم PUFAs 20 الكربون. يتم تمييز فئة PG F3. في الشكل 3، تحليلات MRM لاستخراج البرية من نوع متعددة تظهر الهكسان PG من F1 (الشكل 3A نانوغرام>)، F2 (الشكل 3B)، وF3 (أرقام 3C و 3D) الطبقات. ويمكن الكشف عن فئة F3 مع أي من اثنين التحولات الشامل، م / ض 351/193 أو م / ض 351/191. CePGF2 وتتألف في الغالب من 2α اينانشيومير PGF. CePGF1 من المرجح أن يكون PGF 1α أو اينانشيومير لها. ويبين الشكل 4 التحلل الاصطدام الناجم عن CePGF2 (RT = 11.8) مقارنة PGF2 α معيار (RT = 11.8). اختلافات بسيطة في أيونات المنتج من المرجح بسبب انخفاض وفرة CePGF2 والمركبات المشترك الازاله في استخراج.
الشكل 1. الرسم التخطيطي لC. ايليجانس PGS استخراج وتحليل LC-MS. لاحظ أن الأسيتون / المالحة وكلوروفورم ديهما BHT 0.005٪ لتقليل أكسدة الدهون. الرجوع إلى النص لمزيد من التفاصيل.http://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.
الشكل 2. ويظهر المسح بالاشعة من م / ض 315-360 من النوع البري والدهون 3 (wa22) مقتطفات متحولة. اللوني السائل الوقت الاحتفاظ (RT) في لوحة [A]. الأيونات المستخرجة في RT ترد = 11.3 لمن النوع البري [B] والدهون 3 (wa22) [C] مقتطفات. يتم تمييز فئة PG F3 مع كتلة م / ض 351. القانون الجنائي، اتهاما / ثانية؛ اتحاد المغرب العربي، وحدة الكتلة الذرية.
تينلدى عودتهم 3. تم الكشف عن التحليلات MRM من النوع البري مقتطفات. PGS فئة F1 مع التحول الشامل م / ض 355/311 [A]. لاحظ أن العديد من مركبات مسعور (RT> 14 دقيقة)، والتي من غير المرجح أن يكون PGS، يتم الكشف أيضا مع هذا التحول. تم الكشف عن PGS فئة F2 مع التحول الشامل م / ض 353/193 [B]. تم الكشف عن PGS فئة F3 مع إما التحول الشامل م / ض 351/193 [C] أو م / ض 351/191 [D]. لاحظ أن تحتوي على مقتطفات الهكسان PG متعددة من كل فئة. أرقام تتوافق مع PGS هو مبين في الجدول 2. تركيز CePGF2 هو 1.8 نانوغرام / مل. RT، الوقت الاحتفاظ؛ CPS، التهم / ثانية.
الشكل 4. التحلل الاصطدام الناجم عن موالفة كيميائياesized PGF 2α وCePGF2. سهام في لوحة [A] تشير إلى المنتج أو تجزئة الأيونات المشتركة بين PGF 2α وCePGF2 (RT = 11.8). يتم إنشاء الأيونات المنتج في م / ض 309 و م / ض 193 من المواقع الانقسام المشار إليه (تمييز أ و ب)، تتوافق مع الهياكل المعروضة، وهي سمة من PGS F-سلسلة [B]. القانون الجنائي، والتهم / ثانية. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
| معيار | RT (دقيقة) | [MH] - م / ض | الأيونات مفتاح المنتج في MS / MS | ||||
| 20 هيدروكسي PGE 2 | 9.43 | 367 | 349، 331، 287، 234، 189، 129، 109 | PGF 3 - | 11.26 | 351 | 333، 307، 289، 271، 245، 219، 209، 193، 191، 171، 165، 111 |
| الثرموبوكسان B 2 | 11.66 | 369 | 289، 191، 177، 169، 151 | ||||
| PGF 2 - | 11.80 | 353 | 335، 309، 291، 273، 263، 247، 235، 209، 193، 171، 165، 111 | ||||
| PGF 1 - | 11.79 | 355 | 337، 319311، 301، 293، 275، 265، 237، 211، 195 | ||||
| Lipoxin B 4 | 12.38 | 351 | 201، 191189، 165، 155، 115، 107، 71، 59 | ||||
| PGD 2 | 12.56 | 351 | 315، 271203، 189 | ||||
| 5 (S)، 6 (R) - Lipoxin A 4 | 12.83 | 351 | 235، 217، 189، 144، 135، 115، 99، 59 | ||||
| PGA 2 | 14.02 | 333 | 315، 297، 271، 235، 191، 189، 175، 163، 137، 113، 109 | ||||
| Δ12-PGJ 2 | 14.20 | 333 | 271، 189، 123 | ||||
| الليكوترين B 4 | 14.73 | 335 | 181، 109، 93، 71، 69، 59، 57 | ||||
| 15D-Δ 12،14-PGJ 2 | 16.80 | 315 | 297، 271، 217، 203، 158 | ||||
| 5 (S)-HpETE | 17.88 | 335 | 97، 83، 81، 57 |
الجدول 1. مرات الاحتفاظ والأيونات مفتاح المنتج من 13 معايير eicosanoid من أسلوب LC-MS/MS 3. واستخدمت أكثر من 30 معايير لتطوير برنامج LC-MS/MS. في مرات الاحتفاظ الكروماتوغرافي (RTS) تختلف، حتى بين PGS مشابهة جدا. استثناء هو 2α 1α وPGF PGF. ومع ذلك، هذه هي PGS دالمتميزين من قبل الجماهير بهم أيون الأم ([MH] - م / ض) والتصادم الناجم عن تحلل أطياف (MS / MS).
| فئة البروستاغلاندين | رقم في الشكل (3) | [MH] - م / ض | الأيونات مفتاح المنتج في MS / MS |
| F1 (CePGF1) | 1 | 355 | 319، 301، 311، 293، 275، 265، 237، 223، 211، 195، 157 |
| F1 | 2 | 355 | 311، 301، 293، 275، 265، 211، 195، 167، 157 |
| F2 (CePGF2) | 3 | 353 | 309، 291، 273، 263، 247، 209، 193، 171، 165، 127 |
| F2 | 4 | 353 | 309، 291، 273، 263، 255، 247، 219، 209، 193، 171، 113 |
| F3 | 5 | 351 | 315، 307، 289، 275، 249، 205، 193، 191، 167، 153، 139 |
| F3 | 6 | 351 | 333، 289، 271، 261، 245، 223، 193، 191، 163 |
الجدول 2. تصادم الأيونات التي يسببها المنتج التحلل لعدة C. الكبرى ايليجانس F1، F2، F3 وPGS هو موضح في الشكل 3. لا تظهر MS / MS من الهكسان الأخرى أقل وفرة. هذه البيانات هي من تحليلات متعددة، وربما لا يكون كل الأيونات المنتج واضحة في شوط معين. ونظرا لتعقيد مقتطفات، قد تستمد بعض الأيونات المنتج أقل وفرة من أيون أم أخرى مع الوقت الاحتفاظ مماثلة أو نتيجة من التدخل. الذروة 2 من المرجح عن ستيريو من CePGF1 وذروة 4 من المرجح عن ستيريو من CePGF2. انظر ادموندز، وآخرون (2010) إلى بيانات إضافية 3.
Discussion
نحن تصف الإجراء لاستخراج وتحليل eicosanoid، مع التركيز على PGS F-سلسلة. هناك عدة أجزاء من الإجراء الذي يمكن أن يكون مشكلة. أولا، من المهم جدا أن الثقافات دودة لا يتضورون جوعا، والمجاعة يمكن أن يغير الأيض PG. للتغذية تكميلية، وينصح NA22 البكتيريا بدلا من أكثر شيوعا OP50 البكتيريا بسبب NA22 تصل كثافة أعلى. ومع ذلك، فإن سلالة NA22 يفتقر إلى مقاومة المضادات الحيوية، وأكثر عرضة للتلوث. الثانية، والديدان توليف الهكسان PG الفردية في وفرة منخفض نسبة إلى أنسجة الثدييات. هذا قد يكون راجعا في جزء منه إلى التكرار بين العديد من الهكسان. نوصي حوالي 6 غرام من الأنسجة لتحليل شامل وإشارات أقوى. أقل الأنسجة (1-2 غرام) يمكن استخدامها إذا هو معلق استخراج المجففة في أقل الميثانول: حل المياه لزيادة تركيز PG. ومع ذلك، والحقن 1-2 فقط لا يمكن أن يؤديها. الحد من الكشف عن نظام LC-MS/MS لدينا حوالي 10 خريجPGF 2α / مل. واحد مل من المكتظ الديدان المرحلة المختلطة (حوالي 1 ز) تعطي ما يقرب من 25-50 خريج من CePGF2. ويمكن لنظم قياس الطيف الكتلي أكثر حساسية تقليل كمية الأنسجة دودة المطلوبة للتحليل. الثالث، والاختلافات في PG كفاءة الاستخراج بين عينات يمكن أن يسبب نتائج متغير. لقد وجدنا أن كفاءة الاستخراج هي مشابهة جدا عندما يتم استخراج الأنسجة بشكل متواز. لتحديد الكفاءة، إضافة 1.0 نانوغرام من PGF 2α-D 4 في خطوة التجانس باعتبارها الرقابة الداخلية. MRM باستخدام التحول الشامل M / Z يستخدم 357/197 لقياس PGF 2α-D4 التركيز النسبي إلى 1 نانوغرام / مل حل القياسية. ثم يتم احتساب مبلغ PGF 2α-D 4 المفقود خلال الاستخراج.
المعلمات اللوني والتحولات الشامل ندرج يمكن تغييرها لكشف PGS وeicosanoids الأخرى. على الرغم من الجهد الكبير، ونحن لم تكن قادرة على تحديد D-سلسلة أو E-سرالمنشأ PGS في مقتطفات 17. وعلاوة على ذلك، ونحن لم الكشف عن 8-ISO PGF 2α و 8 ISO PGE 2 التي هي سمة من بيروكسيد مجانا بمبادرة الراديكالية، الذي يولد خليط غير انتقائية من PG الفراغية 19. سواء الديدان تجميع أنواع PG الأخرى غير معروف. تم العثور على Endocannabinoids ومختلف الايبوكسي وهيدروكسي الأيضات من الأراكيدونيك والأحماض الدهني في C. ايليجانس مقتطفات 5،7،20،21. من المستحسن استخدام كل من MRM وMS / MS بالمقارنة مع معايير أصيلة لتقدير وتحديد الهوية، على التوالي. لeicosanoids الرواية، ينبغي الجمع بين هذه التحليلات مع دراسة مقارنة من المسوخ الدهون، والتي تعاني من نقص في بوفا توليف الانزيمات 22، فضلا عن فحص وظيفية، إذا كان ذلك ممكنا. والتحذير لتحليل المسوخ الدهون هو أن كميات دقيقة من PUFAs موجودة في الديدان هي كافية لتخليق PG. على سبيل المثال، والدهون-2 (wa17) المسوختحتوي على كمية صغيرة من D12 النشاط desaturase (~ 5٪ من النوع البري 22) وهذه المسوخ ما زالت تنتج PGS 6. الدهون 3 (wa22) والدهون 4 (WA14) المسوخ تفشل في تجميع PGS المستمدة من الأراكيدونيك والأحماض الدهني 16 . ونحن أيضا قد وجدت أن المسوخ الدهون تعويض عن فقدان الطبقات بوفا بنسبة تصل التنظيم التوليف PG من الطبقات المتبقية. على سبيل المثال، فشل الدهون 3 (wa22) المسوخ لتجميع معظم PGS المستمدة من PUFAs 20 الكربون. بدلا من ذلك، فإنها تظهر ليصل تنظيم PGS الرواية المستمدة من الكربون 18 PUFAs 16. حتى الآن، ونحن لم تتعرف على C. ايليجانس السلالة التي تعاني من عجز تماما في التركيب PG. فمن الممكن أن PGS ضرورية لنمو أو تنمية.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر الايض UAB المستهدفة ومختبر البروتيوميات، والتي تمت بدعم في جزء من الجلد مركز بحوث أمراض UAB (P30 AR050948 إلى C. Elmets)، ومركز جامعة كاليفورنيا سان دييغو UAB-اوبراين الحادة الكلى الإصابة (P30 DK079337 إلى A. أغاروال ) ومركز صحة الرئة UAB (R01 HL114439، R01 HL110950 إلى JE بلالوك). وكان الدعم لمطياف الكتلة من NCRR المشتركة الأجهزة منحة (S10 RR19261 إلى S. بارنز). كما نشكر راي مور لتقديم الدعم التقني. C. وقدمت سلالات ايليجانس من قبل مركز علم الوراثة انواع معينة، والذي يتم تمويله من قبل المعاهد الوطنية للصحة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01GM085105 إلى MAM، بما في ذلك الملحق الإداري الأذربيجانية).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||
| REAGENTS | |||||||||||||||||
| X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
| E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
| Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
| Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
| Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
| Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
| Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
| 10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| 15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
| Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
| EQUIPMENT | |||||||||||||||||
| CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
| Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
| Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
| SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
| SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
| Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
| API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||
References
- Watts, J. L. Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans. Trends Endocrinol. Metab. 20, 58-65 (2009).
- Marza, E., Lesa, G. M. Polyunsaturated fatty acids and neurotransmission in Caenorhabditis elegans. Biochem. Soc. Trans. 34, 77-80 (2006).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
- Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26 (3), 554-566 (2012).
- Kosel, M., et al. Eicosanoid formation by a cytochrome P450 isoform expressed in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Biochem. J. 435, 689-700 (2011).
- Kubagawa, H. M., et al. Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo. Nat Cell Biol. 8, 1143-1148 (2006).
- Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473, 226-229 (2011).
- Gerisch, B., et al. A bile acid-like steroid modulates Caenorhabditis elegans lifespan through nuclear receptor signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5014-5019 (2007).
- Edison, A. S. Caenorhabditis elegans pheromones regulate multiple complex behaviors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 378-388 (2009).
- Funk, C. D. Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology. Science. 294, 1871-1875 (2001).
- Wang, D., Dubois, R. N.
- Cha, Y. I., Solnica-Krezel, L., DuBois, R. N. Fishing for prostanoids: deciphering the developmental functions of cyclooxygenase-derived prostaglandins. Dev. Biol. 289, 263-272 (2006).
- Hata, A. N., Breyer, R. M. Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: multiple roles in inflammation and immune modulation. Pharmacol. Ther. 103, 147-166 (2004).
- Sugimoto, Y., Narumiya, S., Ichikawa, A. Distribution and function of prostanoid receptors: studies from knockout mice. Prog. Lipid Res. 39, 289-314 (2000).
- Basu, S. Isoprostanes: novel bioactive products of lipid peroxidation. Free Radic. Res. 38, 105-122 (2004).
- Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. A heterogenous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the C. elegans reproductive tract. PLoS Genetics. 9 (1), e1003271 (2013).
- Golovko, M. Y., Murphy, E. J. An improved LC-MS/MS procedure for brain prostanoid analysis using brain fixation with head-focused microwave irradiation and liquid-liquid extraction. J. Lipid Res. 49, 893-902 (2008).
- Murphy, R. C., et al. Electrospray ionization and tandem mass spectrometry of eicosanoids. Anal. Biochem. 346, 1-42 (2005).
- Milne, G. L., Yin, H., Morrow, J. D.
- Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chem. Biodivers. 5, 2431-2441 (2008).
- Kulas, J., Schmidt, C., Rothe, M., Schunck, W. H., Menzel, R. Cytochrome P450-dependent metabolism of eicosapentaenoic acid in the nematode Caenorhabditis elegans. Arch. Biochem. Biophys. 472, 65-75 (2008).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
