Summary
במאמר זה, אנו מתארים הליך אופטימלי להפקת וניתוח של פרוסטגלנדינים ואחרים מeicosanoids
Abstract
elegans Caenorhabditis מתגלה כמודל חיה רב עוצמה כדי לחקור את הביולוגיה של שומני 1-9. פרוסטגלנדינים הם מעמד חשוב של eicosanoids, שהם אותות שומנים שמקורם בחומצות שומן רב בלתי רוויות (PUFAs) 10-14. מולקולות האיתות הללו הן קשים ללמוד בגלל השפע הנמוך שלהם והאופי תגובתי. התכונה האופיינית של פרוסטגלנדינים היא מבנה טבעת cyclopentane ממוקם בתוך עמוד השדרה חומצות השומן. ביונקים, יכולים להיווצר באמצעות פרוסטגלנדינים cyclooxygenase מסלולים ועצמאיים 10,15 אנזים התלויים. ג elegans מסנתז מגוון רחב של פרוסטגלנדינים עצמאיים של cyclooxygenases 6,16,17. מעמד גדול של פרוסטגלנדינים F-Series זוהה, אבל המחקר של eicosanoids הוא בשלב מוקדם עם מספיק מקום לגילויים חדשים. כאן אנו מתארים הליך להפקת וניתוח של פרוסטגלנדינים וeicosanoids אחרים. שומנים טעוניםים מופק מתרבויות תולעת ההמוניות באמצעות טכניקת מיצוי נוזלית נוזלית ונותח על ידי כרומטוגרפיה נוזלית מצמידים את electrospray יינון טנדם ספקטרומטריית המסה (LC-ESI-MS/MS). הכללתו של אנלוגים deuterated של פרוסטגלנדינים, כגון PGF 2 α-D 4 כסטנדרט פנימי מומלץ לניתוח כמותי. ניטור תגובה מרובה או MRM יכול לשמש כדי לכמת ולהשוות סוגי פרוסטגלנדין ספציפיים בין חיות בר מסוג והמוטציה. פירוק מושרה מהתנגשות או MS / MS יכול לשמש כדי לקבל מידע על תכונות מבניות חשובות. כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית מסה (LC-MS) סריקות סקר של טווח מסה שנבחר, כגון מ '/ z 315-360 ניתן להשתמש כדי להעריך את השינויים הגלובליים ברמות פרוסטגלנדין. אנו מספקים דוגמאות לכל שלושת הניתוחים. שיטות אלה יספקו לחוקרים עם כלים לגילוי eicosanoids רומן והתוויית המסלולים מטבוליים שלהם.
Introduction
פרוסטגלנדינים (PGS) הם מעמד חשוב של הורמוני שומנים שנחקרו בהרחבה ומעורבת בויסות רבייה, חסינות, ופיתוח במגוון רחב של אורגניזמים 12-14. PGs מתאים בצורה אידיאלית לניתוחי ביולוגיה מערכות מקיפים משום שהם מהווים סדרה של שומנים שמקורם מבשר נפוצה (ים). נמטודות ג elegans הוא אחד מיצורי המודל הנפוץ ביותר כדי לענות על שאלות בסיסיות בגנטיקה וביולוגיה של מערכות.
אנחנו הוכחנו כי ג elegans מסנתז PGs F-Series שמדריך ניעתי זרע לביציות 3,6,16. PGs F-Series נגזר מPUFAs 20 פחמן עם שלוש, ארבע, וחמישה קשרים כפולים, הכוללים את F1, F2, F3 וכיתות, בהתאמה זוהה 3,16. PGs אלה מסונתזים עצמאי של אנזימי cyclooxygenase, עדיין stereoisomers 2α 1α וPGF PGF עדיין generated. עבור ניתוחים איכותיים וכמותיים של ג elegans PGs, LC-MS/MS הוא טכניקה אנליטית חזקה ורגישה. לפני ביצוע ניתוח זה, חשוב לפתח שיטת חילוץ אופטימלית בגלל ביצועים של התהליך האנליטי תלויים בכבדות על איכות התמצית. כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה יכולות רק לספק המונית צפוי לחייב את היחס (מ '/ z), כמו גם את הצורה רצויה לשיא וזמן שמירה של יון הורה PG. פרופיל מטבולי של PGs בג elegans הוא משימה מאתגרת הדורשת אסטרטגיות רכישת MS שונות.
סריקת סריקה או סקר מלאה LC-MS (סריקת Q1) יש את היתרון של הבטחת PGs ionizable ביותר יגרור תגובת ספקטרומטריה. תוך סריקת הסקר מספקת מידע שימושי על פרופיל כולל של PGs ביחס לפראי סוג ומוטצית ג elegans, גילוי של PGs קטין נפגעת בשל רגישות נמוכה. Nevertheפחות, סריקת סקר LC-MS יכולה לתת ראיה גלובלית של PGS ושימושי במיוחד לניתוח חזו מוטציות משפיעים על חילוף חומרים של אוכלוסיית PG גדולה.
יש להציג התעודה מזהה המטבוליט, ניתוח LC-MS/MS של תקני PG מסונתזים כימי מבוצע ראשון לקבל ספקטרום יון המוצר שלהם כתרכובות התייחסות. ספקטרום אלה יכולים להיות בהשוואה לספקטרום של המטבוליט לא ידוע. ניטור מצב תגובה מרובה (MRM) משמש לרגישות וסגוליות משופרים. ניסוי MRM מושגת על ידי ציון המעבר המוני יון יון / מוצר האב של מתחם. אם ידע את המסה והמבנה של analytes היעד, ניתן לחזות מעברי MRM תיאורטיים למטבוליטים רבים לא ידועים.
שיטת LC-MS/MS מותאמת לפרופיל PGs isomeric בג elegans לא דווח. כאן אנו מתארים חילוץ וגישת ספקטרומטריית מסה משולבת בהיקף של LC-MS וLC-שיטות MS / MS לאיתור, כימות, וחוקר ג מטבוליטים PG elegans. גישה זו יכולה להיות מיושמת על eicosanoids אחר.
Protocol
הפרוטוקול כפי שיתואר להלן מחולק לשלושה חלקים: תרבות תולעת, חילוץ פרוסטגלנדין, וניתוח פרוסטגלנדין. כאמור, יש מספר רב של נקודות, כאשר דגימות ניתן לאחסן באופן זמני ב -80 ° C או -20 ° C.
1. תרבות תולעת
אנו ממליצים כ -6 גרם של תולעים בשלב מעורבים לLC-MS/MS המקיף. זה אמור לספק מספיק חומר לגילוי לפחות שש זריקות נפרדות. לכימות של PGs הידוע על ידי MRM בזריקה אחת או שתיים, 1-2 גרם מספיקים. ניתוח של תמציות מתרבויות מסונכרנות בהיקף של שלב מסוים הוא גם אפשרי. ניתן לגדל עד 4 זנים שונים בו זמנית. לדוגמה, סוג בר שליטה ושלושה זנים מוטנטים שונים.
- הכן 65 צלחות NGM-X גדולים (16 ס"מ) וחיידקים מרוכזים להאכלה משלימה. השתמש NA22 חיידקים לזריעה. כדי להפוך את החיידקים מרוכזים להזנה משלימה, Groלפחות ארבעה ליטרים של w NA22 במדיום LB ל16-24 שעות. ספין למטה, להסיר את supernatant, resuspend וחיידקים ל -100 מ"ל של חיץ M9. 200 עד 400 מ"ל של תמיסת חיידקים מרוכזת זו עשויה להידרש לכל זן תולעת. חנות ב 4 ° C.
- התחל תרבויות תולעת על 5 צלחות ה-X גדולים. תולעים לגדול לכ -3 עד 4 דורות עד שצלחות מלאים במבוגרים הרה להולדת. יש להוסיף לחיידקים מרוכזים צלחות כדי למנוע רעב, במידת צורך (~ מ"ל / 1 צלחת ולתת להתייבש לחלוטין לפני חזרת המכסה).
- שטוף הרמפרודיטים הרה להולדת מצלחות עם חיץ M9 ולאסוף את התולעים בצינור פוליפרופילן חרוטי 50 מ"ל.
- לאפשר הרמפרודיטים הרה להולדת להתיישב לתחתית (בדרך כלל כ 3-5 דקות). הסר supernatant, כולל חיידקים, ביצים, ותולעי שלב זחל. Resuspend ב15 מיליליטר חיץ M9 ולערבב בעדינות.
- העברת 200 μl של השעיה תולעת לכל אחד מ60 צלחות NGM זרע. לפזר תולעים בצלחות. שמור על פתרון תולעת מעורבתגם עד שכל הצלחות היו זורעים על מנת להבטיח שהם מקבלים מספרים שווים של תולעים.
- להשלים עם חיידקים מרוכזים לפי צורך (~ 24 ml/plate/12 לתקופת שעה 1) כדי למנוע רעב. לאפשר צלחות לייבוש באוויר לפני החלפת מכסים. לגדול תולעים במשך 2-4 דורות, בהתאם למספר המקורי של תולעי זרע, או עד צלחות מלאים במבוגרים הרה להולדת.
- צלחות תולעת קציר זן אחד בכל פעם. לשטוף את תולעי הצלחות עם חיץ M9 ולאסוף בצינורות 50 מ"ל פוליפרופילן (למשל 6 צינורות). השתמש חיץ M9 לשטוף את צלחת, ולאחר מכן להעביר את המאגר מלא תולעת לצלחת הבאה. לאחר שטיפת מספר (לדוגמה. ה -10) של צלחות, להעביר את המאגר מלא לתולעת צינור 50 מ"ל. מלא את הצינור לחלק העליון עם חיץ M9. חזור על לשטוף לשאר צלחות.
- כמו המבוגרים הרה להולדת ליישב לתחתית ב5-6 דקות, להסיר את supernatant (~ 35 מ"ל) ולאחד לתוך צינורות אחד או שניים. ממלא את הצינורות ל 50 מ"ל עם frאש M9 החיץ, לתת לעמוד במשך 3-5 דקות, ולהסיר מבוגרים הרה להולדת עוזבים supernatant. חזור 3 פעמים או עד supernatant הוא שקוף.
- באמצעות משעמם פיפטה פסטר גדולה, העברה כתולעים רבים ככל האפשר לשני צינורות חרוטי 15 מ"ל פוליפרופילן. ספין למטה ב 1000 RCF (~ 3,500 סל"ד בCentraSL2) במשך 5 דקות בצנטריפוגה קלינית. הסר supernatant וחזור עד שכל התולעים ומועברים pelleted באותו הצינור. להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר ותולעים בחנות ב -80 ° C. חזור על פעולה עבור כל הזנים.
2. הפקת פרוסטגלנדין
החומרים הכימיים הדרושים לחילוץ מוצגים להלן. השיטה היא שונה מזה של Golovko ומרפי 17 וכוללת מיצוי אצטון ואחריו טיהור נוזלית נוזלית, אשר משפרת את רגישות LC-MS/MS. Bullet בלנדר 5 homogenizer משמש בהליך, אם כי ניתן להשיג תוצאות דומות עם homogenizer Dounce. hydroxytolue Butylatedנה (BHT) ואידוי תחת חנקן (N 2) גז נמצא בשימוש כדי למנוע חמצון. כל כלי הזכוכית יש siliconized (Sigmacote) כדי להפחית מחייב שומנים בדם. מיצוי עם ממסים אורגניים יש לבצע במנדף כימי.
- שוקל צינור פוליפרופילן חרוטי 50 מ"ל. העבר כ 6.0 גרם של תולעים קפואים מצינור חרוטי 15 מ"ל מאוחסן ב -80 ° C על ידי חיתוך דרך הצינור עם סכין גילוח חם ליד סימן מיליליטר 6.5. מרית מתנול לניקוי יכולה לשמש כדי להסיר את תולעת גלולה קפוא מהחלק התחתון של הצינור. על ידי חיתוך באמצעות גלולה כדי לאחזר את החלק התחתון, תולעי זחל פחות צפופים ושיירי חיידקים מהחלק העליון של גלולה נשארים מאחור.
- העבר את התולעים קפואים לצינור חרוטי 50 מ"ל נשקל מראש. אם דוגמאות רבות נמצאים בעיבוד, משתמש באותה הכמות (6.0 גר ') של רקמה למחקרים השוואתיים. כהפשרת תולעים לעיסה, להוסיף או להסיר תולעים עם המרית כדי להשיג מסה הרצויה. אופציונלי: מודעהng ד 1.00 של PGF 2α-D4 סטנדרטי כמו בקרה פנימית ליעילות שאיבה.
- הוסף 12 מ"ל של 2:1 קר כקרח אצטון / מלוח עם BHT 0.005% להשעית התולעת ומערבבת היטב על ידי vortexing. לוותר על 1.5 מ"ל של תרחיף תולעת לכל אחד מעשרה 5 צינורות פלסטיק עצמי עומדים מ"ל לשימוש בבלנדר Bullet.
- הוסף 0.7-0.8 מ"ל של 0.5 מ"מ הקוטר ceria התייצב חרוזים זירקוניום אוקסיד לכל צינור 5 מ"ל. סגור את המכסים היטב ולטעון את 12 צינורות לתוך homogenizer Bullet בלנדר 5. הפעל את הבלנדר במשך 3 דקות במהירות 8-9 ומקום הצינורות על קרח. הקפד לסגור את המכסים באופן הדוק מאוד או התוכן עלול להישפך החוצה. בדקו 10 μl של homogenate מצינור אחד בשקופית באמצעות stereoscope. לא צריך להיות מעט מאוד תולעים שלמים שנותרו. חזור באותה המהירות עוד דקה, במידת צורך.
- באופן שווה להעביר את homogenates לארבעה 10 צינורות זכוכית חרוטי מ"ל באמצעות "פיפטה פסטר 9. הימנע מהעברת חרוזים. שטוף את החרוזים משלושה צינורות sequentially עם 1 מ"ל של אצטון 01:02 / BHT המכיל תמיסת מלח. חזור על פעולה עבור צינורות אחרים עד שכל חרוזים נשטפים. מעבירים את הפתרון הנותר (~ 4 מ"ל) ל 10 מ"ל צינורות הזכוכית ולמקם אותם על קרח.
- צנטריפוגה 10 מ"ל צינורות זכוכית על 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה קלינית ב ~ 1000 XG במשך 10 דקות. מעבירים את supernatant מצינור לצינור 10 מיליליטר חרוטי זכוכית נקי.
- במנדף כימי, מוסיף נפח שווה של הקסאן לכל שפופרת זכוכית 10 מ"ל. לדוגמה, הוסף הקסאן מ"ל 3.5 מ"ל לאצטון / תמיסת מלח 3.5. מערבולת במהירות המרבית למשך 30 שניות.
- צנטריפוגה 10 מ"ל צינורות זכוכית על 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה קלינית ב ~ 1000 XG במשך 10 דקות. מחק את השלב העליון המכיל הקסאן ושומנים טעונים ניטראלי.
- להפוך לחומצת השלב נמוך יותר ל-pH 3.5 באמצעות 2 חומצה פורמית ז (כ 100 - 150 μl). pH בדיקה באמצעות רצועות pH.
- הוסף נפח שווה של כלורופורם לצינור אחד. מערבולת במהירות המרבית למשך 30 שניות וצנטריפוגה הצינורות ב 4 ° C אניצנטריפוגות קליניות נה ב ~ 1000 XG במשך 10 דקות.
- להסיר ולסלק את השלב העליון המימית. הכנס קצה פיפטה דרך כל שלבי ביניים חלביים שיורי לשלב כלורופורם הנמוך, הימנעות ביניים. לאסוף את השלב נמוך יותר מכל אחד 4 הצינורות לצינור זכוכית חרוטי נקי 15 מ"ל. דגירה ב -20 ° C במשך לפחות 24 שעות. בשלב זה, ניתן לאחסן את התמצית ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.
- קח את התמצית מהמקפיא וזורקים את השכבה העליונה המימית החלבית שנותרה, אם הוא קיים. מעבירים את שלב כלורופורם לבקבוקון זכוכית ½-דראם כותרת טפלון מרופד באמצעות pipet חדש פסטר. במנדף כימי, תתאדה חלק קטן המסיס בכלורופורם ליובש מתחת לזרימה עדינה של גז N 2. ניתן לאחסן התמצית מיובשת ב -20 ° C עד 2 שבועות. תכנית כוללת המשמשת להפקה וניתוח PG מוצגת באיור 1.
3. ניתוח פרוסטגלנדין
- הכן את מנייתפתרונות של פרוסטגלנדינים התייחסות בודדים, כגון PGF 2α או PGF 2 α-D4 (1 מיקרוגרם / מ"ל) במתנול ולדלל עם מתנול: מים (08:02 V / V) כדי להשיג פתרון עובד. הכן סדרה של דילולים (100, 10, 1, 0.1, 0.01 ng / ml) כדי ליצור עקומה סטנדרטית.
- הוסף 200 מתנול μl: מים (08:02 V / V) לג המיובש תמצית elegans שומנים (ים) ומערבבים היטב. אם פחות מ -6 גרם של רקמת תולעת היה שחולץ, התמצית מיובשת יש resuspended בפחות נפח של מתנול: פתרון מים.
- הכן את השלב הנייד בהיקף של 0.1% חומצה פורמית במים [] ואצטוניטריל המכיל חומצה פורמית 0.1% [B].
- הגדרת autosampler על 4 מעלות צלזיוס ומניח את הבקבוקונים מדגם במעמד בקבוקון 1.5 מ"ל 70-ספירה.
- לאזן את עמודת RP-C18 סינרגיה הידרו עם חומצה פורמית 0.1% בקצב זרימה של 0.2 מ"ל / דקה במשך כ -5 דקות.
- הזרק המדגם (20-50 μl) לעמודה. לבצע שיפוע elution התחלהing עם 10% ב 'והולך עד 80% B מ 0-11 דק', ב '80-100% 11-14 דקות, וחוזר חזרה ל10% ב' ב 16 דקות. סה"כ זמן הריצה הוא 20 דקות. זמני השמירה של 13 תקנים אותנטיים מוצגים בטבלה מס '1 לעיון 3.
- להציג את עמודת השפכים לספקטרומטר המסה באמצעות הפעלה ממשק ESI במצב היונים השלילי. חנקן משמש כnebulizer וגז וילון (נוכ = 10). התנגשות הגז, האנרגיה התנגשות, והטמפרטורה נקבעים בגיל 10, ו-35 eV 600 מעלות צלזיוס, בהתאמה. פוטנציאל Declustering (DP), התנגשות אנרגיה (CE), ופוטנציאל יציאת תא (CXP) נקבעים ב-90, -35 ו -10, בהתאמה.
- עבור סריקות סקר (סריקות רבעון 1), השתמש במצב יון שלילי בטווח המסה של m / z 315-360 עבור רוב PGs (איור 2). ניתן לשנות את הטווח, בהתאם למסה של המתחם (ים) של עניין. לחלץ יונים מיון נוכחי כולל (עוית) של chromatograms יון LC-MS ולקבוע אם extracיוני טד מתאים ליוני deprotonated או adduct, או ליונים שברים.
- על ניסויים של MRM, מעבר המוני מ '/ z 355/311 משמש כדי לזהות את מעמד F1, מ' / z 353/193 משמש לכיתת F2 ו'/ z 351/193 או 351/191 משמש לכיתת F3 (איור 3). MRM משמש גם כדי לזהות את התקן הפנימי (לדוגמה, מ '/ z 357/197 לPGF 2α-D4) ועל מנת ליצור את העקומה הסטנדרטית. ראה מרפי et al. לקבלת מידע נוסף על מעברים המוניים PG 18.
- עבור ניסויי MS / MS, השתמש מ '/ z 355 לכיתת F1, F2 כיתת 353for מ' / z, וPGs מ '/ z 351for F3 ייצוגית. ג נתוני elegans MS / MS לPGs F-Series זמין באיור 4 וטבלה 2 3,16. נתונים MS / MS לeicosanoids יונקים זמין בwww.lipidmaps.org.
- לעבד את נתוני האנליטיות באמצעות analysתוכנה לא (גרסת 1.4.2, יישומי Biosystems).
Representative Results
הכנת מדגם בוצעה על ידי שאיבת נוזל נוזל מותאמת Golovko ומרפי 17. היא סיפק התאוששות מצוינת של התקן הפנימי (PGF 2α-D4). התכנית הכללית להפקת PG מג elegans מוצג באיור 1. תנאים כרומטוגרפי היו מותאמים כדי לספק הפרדה בסיסית של> 30 תקני eicosanoid (טבלה 1 מציגה 13 תקנים). טור הידרו-RP (250 x 2.0 מ"מ id) עם מים ואצטוניטריל המכילים חומצה פורמית 0.1% סיפק את ההפרדה ואת הרגישות הטובה ביותר. סריקות סקר של תמציות מוטציה wild-type ושומן 3 שמוצג ב2 רמות גלובליות מסמכי דמותו של יונים בטווח המסה של 315-360 יחידות מסה אטומיות. שומן 3 (wa22) מוטנטים חסרים PUFAs ביותר של 20 פחמן. כיתת PG F3 מודגשת. באיור 3, ניתוחי MRM של תמצית פראי סוג להראות איזומרים PG מרובים של F1 (איור 3 א ng>), F2 (איור 3), וF3 (האיורים 3C ו3D) כיתות. כיתת F3 יכולה להיות מזוהות עם אחד משני מעברים המוניים, מ '/ z 351/193 או מ' / z 351/191. CePGF2 מורכב בעיקר מenantiomer 2α PGF. CePGF1 צפוי להיות PGF 1α או enantiomer. איור 4 מראה את הפירוק מושרה התנגשות של CePGF2 (RT = 11.8), בהשוואה לPGF2 α הסטנדרטי (RT = 11.8). הבדלים קלים ביוני המוצר צפויים בשל שפע CePGF2 נמוך ותרכובות שיתוף משחררי בתמצית.
איור 1. תרשים סכמטי של ג elegans PGs חילוץ וניתוחי LC-MS. שים לב שאצטון / מלוח וכלורופורם יש גם BHT 0.005% כדי למזער את חמצון שומנים בדם. מתייחס לטקסט לקבלת פרטים נוספים.http://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. סריקות סקר מ '/ z 315-360 של תמציות מוטציה wild-type ושומן 3 (wa22). זמן שמירת כרומטוגרפיה נוזלי (RT) מוצגת בלוח []. יונים שחולצו ב RT = 11.3 מוצגים לטבע מסוג [b] ושומן 3 (wa22) ג [] תמציות. כיתת PG F3 עם מסת m / z 351 מודגשת. CPS, ספירות / sec; האמו, יחידת מסה אטומית.
תאנהיור 3. ניתוחי MRM של תמציות wild-type. PGS כיתת F1 מזוהים עם מעבר המוני מ '/ z 355/311 [א]. שים לב שמספר תרכובות הידרופוביות (RT> 14 דק '), שאינן צפויים להיות PGs, גם מזוהות עם המעבר הזה. PGs כיתת F2 מזוהים עם מעבר המוני מ '/ z 353/193 [ב']. PGs כיתת F3 מזוהים גם עם מעבר המוני מ '/ z 351/193 [ג] או מ' / z 351/191 [ד]. שים לב שהתמציות מכילות איזומרים PG מרובים של כל כיתה. מספרים מתאים לPGs מוצג בטבלה 2. הריכוז של CePGF2 הוא 1.8 ng / ml. RT, זמן שמירה; CPS, ספירות / sec.
איור 4. פירוק מושרה מהתנגשות של סינטיסייזר כימיesized PGF 2α וCePGF2. חיצים בפנל [] מצביע יוני מוצר או פיצול משותף בין PGF 2α וCePGF2 (RT = 11.8). את יוני המוצר במ '/ z 309 ו'/ z 193 נוצרים מביקוע אתרים המצוינים (מסומן A ו-B), המתאימים למבנים שמוצגים, ואופייניים לPGs F-Series [B]. CPS, ספירות / שני. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
| סטנדרטי | RT (דקות) | [MH] - מ '/ z | יוני מוצר עיקריים ב-MS / MS | ||||
| 20-הידרוקסי PGE 2 | 9.43 | 367 | 349, 331, 287, 234, 189, 129, 109 | PGF 3 - | 11.26 | 351 | 333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111 |
| Thromboxane ב '2 | 11.66 | 369 | 289, 191, 177, 169, 151 | ||||
| PGF 2 - | 11.80 | 353 | 335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111 | ||||
| 1 PGF - | 11.79 | 355 | 337, 319,311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195 | ||||
| Lipoxin B 4 | 12.38 | 351 | 201, 191,189, 165, 155, 115, 107, 71, 59 | ||||
| PGD 2 | 12.56 | 351 | 315, 271,203, 189 | ||||
| 5 (S), 6 (R) - Lipoxin 4 | 12.83 | 351 | 235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59 | ||||
| PGA 2 | 14.02 | 333 | 315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109 | ||||
| Δ12-PGJ 2 | 14.20 | 333 | 271, 189, 123 | ||||
| Leukotriene B 4 | 14.73 | 335 | 181, 109, 93, 71, 69, 59, 57 | ||||
| 15d-Δ 12,14-PGJ 2 | 16.80 | 315 | 297, 271, 217, 203, 158 | ||||
| 5 (S)-HpETE | 17.88 | 335 | 97, 83, 81, 57 |
טבלת מס '1. פעמים שייר ויונים מוצרים עיקריים של 13 תקני eicosanoid משיטת LC-MS/MS 3. למעלה מ -30 תקנים שמשו לפיתוח תכנית LC-MS/MS. זמני שמירת chromatographic (RTS) שונים, גם בקרב PGs דומה מאוד. יוצא מן הכלל הוא 2α 1α וPGF PGF. עם זאת, אלה הם PGs דistinguished ידי המוניהם הוריים יון ([MH] - מ '/ z) והתנגשות המושרה ספקטרום פירוק (MS / MS).
| כיתת פרוסטגלנדין | מס באיור 3 | [MH] - מ '/ z | יוני מוצר עיקריים ב-MS / MS |
| F1 (CePGF1) | 1 | 355 | 319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157 |
| F1 | 2 | 355 | 311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157 |
| F2 (CePGF2) | 3 | 353 | 309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127 |
| F2 | 4 | 353 | 309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113 |
| F3 | 5 | 351 | 315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139 |
| F3 | 6 | 351 | 333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163 |
טבלת 2. יוני מוצר פירוק מושרה מהתנגשות עבור מספר ג הגדול elegans F1, F2, F3 וPGs מוצגים באיור 3. MS / MS של איזומרים פחות שפע אחרים אינם מוצג. נתונים אלה הם מן הניתוחים מרובים וכל יוני המוצר לא יכולים להיות גלויים לעין בטווח נתון. בהתחשב במורכבות של התמציות, יוני מוצר פחות שפע מסוימים יכולים לנבוע מיון הורה אחר עם זמן שמירה דומה או כתוצאה מהפרעה. שיא 2 סביר stereoisomer של CePGF1 והשיא 4 עשוי stereoisomer של CePGF2. ראה אדמונדס, et al. (2010) עבור נתונים נוספים 3.
Discussion
אנו מתארים הליך להפקה וניתוח eicosanoid, תוך התמקדות בPGs F-Series. ישנם כמה חלקים של ההליך שיכול להיות בעייתי. ראשית, זה קריטי, כי תרבויות התולעת לא לגווע ברעב, כמו רעב יכול לשנות את חילוף החומרים PG. להזנה משלימה, NA22 חיידקים מומלצים במקום OP50 חיידקים יותר נפוצה בגלל NA22 מגיע צפיפות גבוהה יותר. עם זאת, מתח NA22 חסר עמידות לאנטיביוטיקה והוא רגיש יותר לזיהום. שנית, תולעים לסנתז איזומרים PG בודדים בשפע נמוך יחסית לרקמות יונקים. זה יכול להיות בגלל בחלקו ליתירות בין איזומרים רבים. אנו ממליצים על 6 גרם של רקמה לניתוח מקיף ואותות חזקים יותר. רקמה פחות (1-2 גרם) יכולה לשמש אם התמצית מיובשת היא resuspended בפחות מתנול: פתרון מים כדי להגדיל את ריכוז PG. עם זאת, יכולות להתבצע רק 01:59 זריקות. גבול הגילוי של מערכת LC-MS/MS שלנו הוא כ -10 PGPGF 2α / מ"ל. מ"ל אחד של תולעים בשלבים מעורבים בצפיפות (כ 1 ז) מניב בערך 25-50 PG של CePGF2. מערכות ספקטרומטריית מסה יותר רגישות יכולות להפחית את כמות רקמת תולעת נדרשת לניתוח. שלישית, הבדלים ביעילות שאיבת PG בין דגימות יכולים לגרום לתוצאות משתנות. מצאנו כי יעילות שאיבה דומה מאוד כאשר רקמות המחולצות במקביל. כדי לקבוע את היעילות, להוסיף 1.0 ננוגרם של PGF 2α-D 4 בצעד homogenization כבקרה פנימית. MRM באמצעות מעבר המוני מ '/ z 357/197 משמש למדידת ריכוז PGF 2α-D4 יחסית לng 1 / מיליליטר פתרון סטנדרטי. כמות PGF 2α-D 4 איבד במהלך החילוץ ולאחר מכן מחושבת.
ניתן לשנות את פרמטרי כרומטוגרפיה והמעברים המוניים שכוללים לזהות PGS וeicosanoids אחרים. למרות מאמצים רבים, לא הצליחו לזהות D-סדרה או E-series PGS בתמציות 17. יתר על כן, יש לנו לא זוהה 8-ISO PGF 2α ו8-ISO PGE 2 שאופייניים לחמצון רדיקלי ביוזמת חופשי, אשר יוצר תערובת לא סלקטיבי של PG stereoisomers 19. בין אם תולעים לסנתז סוגי PG אחרים אינו ידוע. Endocannabinoids מטבוליטים אפוקסי והידרוקסי שונים של הארכידונית וחומצות eicosapentaenoic כבר נמצאו בג elegans מחלץ 5,7,20,21. אנו ממליצים על השימוש בשני MRM ו-MS / MS בהשוואה לסטנדרטים אותנטיים לכימות וזיהוי, בהתאמה. לeicosanoids הרומן, צריכים להיות בשילוב עם ניתוחים אלה מחקר השוואתי של מוטציות שומן, שהם חסרים PUFA סינתזה 22 אנזימים, כמו גם assay פונקציונלי, במידת האפשר. אזהרה לניתוח מוטציות שומן היא שהכמויות זעירות של PUFAs בהווה בתולעים מספיקות לסינתזת PG. לדוגמה, בשומן (2 wa17) מוטנטיםיש כמות קטנה של פעילות desaturase D12 (~ 5% מהסוג בר 22) ומוטציות אלה עדיין מייצרים 6 PGs. שומן 3 (wa22) ושומן-4 (wa14) מוטנטים מצליח לסנתז PGs נגזר מהארכידונית וחומצות eicosapentaenoic 16 . אנחנו גם מצאנו כי מוטציות שומן לפצות על האובדן של כיתות PUFA בשיעור של עד ויסות סינתזת PG מכיתות שנותרו. לדוגמה, בשומן 3 (wa22) מוטנטים מצליח לסנתז רוב PGs נגזר מPUFAs 20 פחמן. במקום זאת, הם מופיעים למעלה להסדיר PGs הרומן נגזר מ18 פחמן PUFAs 16. נכון להיום, יש לנו לא זיהינו את ג elegans זן שהוא חסר לחלוטין בסינתזת PG. יתכן כי PGs חיוני לצמיחה או התפתחות.
Disclosures
יש החוקרים אין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
אנו מודים לmetabolomics UAB ממוקד ומעבדת פרוטאומיקה, אשר כבר נתמך בחלקו על ידי המרכז לחקר מחלות עור UAB (P30 AR050948 לג Elmets), מרכז UAB-UCSD אובריאן אקוטי בכליות הפציעה (P30 DK079337 לא Agarwal ) והמרכז לבריאות ריאות UAB (R01 HL114439, R01 HL110950 לי"א Blalock). תמיכה בספקטרומטר המסה הייתה מNCRR משותף מכשור מענק (S10 RR19261 ס 'ארנס). אנו מודים גם ריי מור לקבלת תמיכה טכנית. ג זני elegans נמסרו על ידי המרכז לגנטיקה Caenorhabditis, אשר ממומן על ידי המכון הלאומי לבריאות. עבודה זו נתמכה על ידי NIH (R01GM085105 לMAM, כולל תוספת מנהלית ערה).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||
| REAGENTS | |||||||||||||||||
| X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
| E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
| Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
| Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
| Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
| Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
| Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
| 10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| 15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
| Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
| EQUIPMENT | |||||||||||||||||
| CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
| Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
| Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
| SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
| SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
| Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
| API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||
References
- Watts, J. L. Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans. Trends Endocrinol. Metab. 20, 58-65 (2009).
- Marza, E., Lesa, G. M. Polyunsaturated fatty acids and neurotransmission in Caenorhabditis elegans. Biochem. Soc. Trans. 34, 77-80 (2006).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
- Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26 (3), 554-566 (2012).
- Kosel, M., et al. Eicosanoid formation by a cytochrome P450 isoform expressed in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Biochem. J. 435, 689-700 (2011).
- Kubagawa, H. M., et al. Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo. Nat Cell Biol. 8, 1143-1148 (2006).
- Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473, 226-229 (2011).
- Gerisch, B., et al. A bile acid-like steroid modulates Caenorhabditis elegans lifespan through nuclear receptor signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5014-5019 (2007).
- Edison, A. S. Caenorhabditis elegans pheromones regulate multiple complex behaviors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 378-388 (2009).
- Funk, C. D. Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology. Science. 294, 1871-1875 (2001).
- Wang, D., Dubois, R. N.
- Cha, Y. I., Solnica-Krezel, L., DuBois, R. N. Fishing for prostanoids: deciphering the developmental functions of cyclooxygenase-derived prostaglandins. Dev. Biol. 289, 263-272 (2006).
- Hata, A. N., Breyer, R. M. Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: multiple roles in inflammation and immune modulation. Pharmacol. Ther. 103, 147-166 (2004).
- Sugimoto, Y., Narumiya, S., Ichikawa, A. Distribution and function of prostanoid receptors: studies from knockout mice. Prog. Lipid Res. 39, 289-314 (2000).
- Basu, S. Isoprostanes: novel bioactive products of lipid peroxidation. Free Radic. Res. 38, 105-122 (2004).
- Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. A heterogenous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the C. elegans reproductive tract. PLoS Genetics. 9 (1), e1003271 (2013).
- Golovko, M. Y., Murphy, E. J. An improved LC-MS/MS procedure for brain prostanoid analysis using brain fixation with head-focused microwave irradiation and liquid-liquid extraction. J. Lipid Res. 49, 893-902 (2008).
- Murphy, R. C., et al. Electrospray ionization and tandem mass spectrometry of eicosanoids. Anal. Biochem. 346, 1-42 (2005).
- Milne, G. L., Yin, H., Morrow, J. D.
- Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chem. Biodivers. 5, 2431-2441 (2008).
- Kulas, J., Schmidt, C., Rothe, M., Schunck, W. H., Menzel, R. Cytochrome P450-dependent metabolism of eicosapentaenoic acid in the nematode Caenorhabditis elegans. Arch. Biochem. Biophys. 472, 65-75 (2008).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
