Summary
I dette papir, beskriver vi en optimeret metode til ekstraktion og analyse af prostaglandiner og andre eicosanoider fra
Abstract
Caenorhabditis elegans fremstår som en stærk dyremodel til at studere biologi lipider 1-9. Prostaglandiner er en vigtig klasse af eicosanoider, der er lipid signaler afledt fra polyumættede fedtsyrer (PUFA) 10-14. Disse signalmolekyler er svært at studere på grund af deres lave forekomst og reaktiv art. Det karakteristiske træk ved prostaglandiner er en cyclopentanring struktur placeret i fedtsyre rygrad. I pattedyr kan prostaglandiner dannes gennem cyclooxygenase enzym-afhængige og-uafhængige veje 10,15. C. elegans syntetiserer en bred vifte af prostaglandiner uafhængig af cyclooxygenaser 6,16,17. En stor klasse af F-serien prostaglandiner er blevet identificeret, men studiet af eicosanoider er på et tidligt stadium med rigelig plads til nye opdagelser. Her beskriver vi en metode til ekstraktion og analyse af prostaglandiner og andre eicosanoider. Charged lipids er udvundet fra masse orm kulturer ved hjælp af en væske-væske-ekstraktion teknik og analyseret ved væskekromatografi koblet til elektrospray ionisering tandem massespektrometri (LC-ESI-MS/MS). Inddragelsen af deutererede analoger af prostaglandiner, såsom PGF 2 α-d4 som en intern standard anbefales til kvantitativ analyse. Multiple reaktion overvågning eller MRM kan anvendes til at kvantificere og sammenligne specifikke prostaglandin typer mellem vildtype-og mutant dyr. Collision-induceret nedbrydning eller MS / MS kan bruges til at indhente oplysninger om vigtige strukturelle træk. Væskekromatografi massespektrometri (LC-MS) undersøgelse scanninger af et valgt masseinterval, såsom m / z 315-360 kan bruges til at evaluere globale ændringer i prostaglandin niveauer. Vi giver eksempler på alle tre analyser. Disse metoder vil give forskerne et værktøjssæt til at opdage nye eicosanoider og afgrænse deres metaboliske veje.
Introduction
Prostaglandiner (PG), er en vigtig klasse af lipid hormoner, der er blevet grundigt undersøgt og impliceret i reguleringen reproduktion, immunitet, og udvikling i en bred vifte af organismer 12-14. PG'er er velegnet til omfattende systemer biologi analyser, fordi de består af en række af lipider afledt fra en fælles forstadium (r). Nematoden C. elegans er en af de mest udbredte modelorganismer til at løse fundamentale spørgsmål i genetik og systembiologi.
Vi har påvist, at C. elegans syntetiserer F-serien PG at guide bevægelige sædceller til oocytter 3,6,16. F-serien PG'er afledt fra 20-carbon PUFA'er med tre, fire og fem dobbeltbindinger, der omfatter F1, F2 og F3 respektive klasser er blevet identificeret 3,16. Disse PG'er syntetiseres uafhængigt af cyclooxygenaseenzymer, men PGF 1α og PGF 2α stereoisomerer er stadig genereres. For kvalitative og kvantitative analyser af C. elegans PG, LC-MS/MS er en kraftfuld og følsom analytisk teknik. Før du udfører denne analyse er det vigtigt at udvikle en optimeret udvinding metode, fordi udførelsen af den analytiske proces afhænger i høj grad af, at ekstraktet kvalitet. Væskekromatografi massespektrometri kan kun give forventede masse-til-ladningsforhold (m / z), samt ønskelige topform og retentionstid PG moderion. Metabolisk profilering af PG i C. elegans er en udfordrende opgave, der kræver forskellige MS opkøbsstrategier.
LC-MS fuld scanning eller syn scanning (Q1 scanning) har den fordel, at de ioniserbare PG'er vil generere en massespektrometrisk reaktion. Mens undersøgelsen scanningen giver nyttige oplysninger om den samlede profilering af PG med hensyn til vild-type og mutant C. elegans, detektion af mindre PG er kompromitteret på grund af lav følsomhed. Ikke destomindre, kan LC-MS undersøgelse scanning giver et samlet overblik over PG'er og er særligt velegnet til analyse af mutanter forudsagt at påvirke metabolismen af en stor PG befolkning.
I metabolit identifikation er LC-MS/MS analyse af kemisk fremstillede PG-standarder først udføres for at opnå deres produkt ion spektre som referencestoffer. Disse spektre kan sammenlignes med det spektrum af en ukendt metabolit. Multiple reaktion overvågning (MRM) tilstand anvendes til forbedret følsomhed og specificitet. En MRM eksperiment udføres ved at specificere moderionen / produkt ion masse overgang af en forbindelse. Ved at kende masse og strukturen af målanalytter, er det muligt at forudsige teoretiske MRM overgange for mange ukendte metabolitter.
En optimeret LC-MS/MS metode til profilering isomere PG i C. elegans er ikke blevet rapporteret. Her beskriver vi et udtræk og integreret massespektrometri tilgang, der består af LC-MS og LC-MS / MS-metoder til påvisning, kvantificering og efterforskningen C. elegans PG metabolitter. Denne fremgangsmåde kan anvendes på andre eicosanoider.
Protocol
Protokollen som beskrevet nedenfor er opdelt i tre sektioner: orm kultur, prostaglandin udvinding, og prostaglandin analyse. Som bemærket, er der flere punkter, hvor prøver kan midlertidigt opbevares ved -80 ° C eller -20 ° C.
1.. Worm Culture
Vi anbefaler ca 6 g blandede fase orme for omfattende LC-MS/MS. Dette bør give nok materiale til påvisning mindst seks separate injektioner. Til kvantificering af kendte PG'er ved MRM i en enkelt injektion eller to, er 1-2 g tilstrækkelige. Analyse af ekstrakter fra synkroniserede kulturer bestående af en bestemt fase er også mulig. Op til 4 forskellige stammer kan dyrkes samtidigt. For eksempel. En vildtype kontrol og tre forskellige mutantstammer
- Forbered 65 X-Large (16 cm) NGM plader og koncentrerede bakterier til supplerende fodring. Brug NA22 bakterier til såning. For at gøre koncentrerede bakterier for supplerende fodring, grow mindst fire liter NA22 i LB-medium til 16-24 timer. Spin ned, supernatanten fjernes, og resuspender bakterier i 100 ml M9 buffer. 200 og 400 ml af denne koncentrerede bakteriel løsning kan være nødvendig for hver orm stamme. Opbevares ved 4 ° C.
- Start orm kulturer på 5 X-store plader. Grow orme i ca 3-4 generationer indtil pladerne er fulde af drægtige voksne. Koncentrerede bakterier bør føjes til plader til at forhindre sult, som det er nødvendigt (~ 1 ml / plade og lad tørre fuldstændigt, inden batteriet låget).
- Vask drægtige hermafroditter fra plader med M9-puffer og indsamle orme i en 50 ml konisk polypropylenrør.
- Tillad drægtige hermafroditter at afregne til bunden (normalt omkring 3-5 minutter). Fjern supernatanten, herunder bakterier, æg og larvestadiet orme. Resuspender i 15 ml M9-puffer og forsigtigt blandes.
- Overfør 200 ul orm suspension til hver af 60 podede NGM plader. Disperse orme over pladerne. Hold orm opløsning blandetgodt, indtil alle plader er blevet seedet til at sikre, at de modtager omtrent samme antal orme.
- Supplér med koncentrerede bakterier efter behov (~ 1 ml/plate/12 til 24 timers periode) for at forhindre sult. Tillad plader til at lufttørre, før du udskifter låg. Grow orme til 2-4 generationer, afhængigt af det oprindelige antal podede orme, eller indtil pladerne er fulde af drægtige voksne.
- Harvest orm pladerne én stamme ad gangen. Vask orme fra pladerne med M9 buffer og saml det i 50 ml polypropylen rør (fx 6 rør). Brug M9 buffer til at vaske en plade, derefter overføre ormen fyldt buffer til næste plade. Efter vask et nummer (f.eks. 10.), af plader, overføre ormen fyldt buffer til 50 ml rør. Fyld røret til toppen med M9-puffer. Gentag vask for resten af pladerne.
- Da de drægtige voksne afregne til bunden i 5-6 min, supernatanten fjernes (~ 35 ml) og konsolidere i én eller to rør. Fyld rørene til 50 ml med frESH M9 buffer, lad stå i 3-5 min, og fjerne supernatanten forlader drægtige voksne. Gentages 3 gange, eller indtil supernatanten er gennemsigtig.
- Ved hjælp af en stor boring Pasteur pipette så mange orme som muligt til to 15 ml polypropylen koniske rør. Spin ned ved 1.000 rcf (~ 3.500 rpm i CentraSL2) i 5 minutter i en klinisk centrifuge. Fjern supernatanten og gentag indtil alle orme overføres og pelleteret i det samme rør. Fjern så meget supernatanten som muligt og opbevare orme ved -80 ° C. Gentag for alle stammer.
2.. Prostaglandin Extraction
De nødvendige reagenser til ekstraktion er vist nedenfor. Fremgangsmåden er modificeret i forhold Golovko og Murphy 17 og omfatter acetoneekstraktion fulgt af væske-væske rensning, som forbedrer LC-MS/MS følsomhed. En Bullet Blender 5 homogenisator anvendes i proceduren, skønt lignende resultater kan opnås med en Dounce homogenisator. Butyleret hydroxytoluene (BHT) og inddampning under nitrogen (N2) gas anvendes til at forhindre oxidation. Alle glasvarer skal silikonebehandlet (Sigmacote) for at reducere lipid binding. Ekstraktion med organiske opløsningsmidler bør udføres i et kemisk stinkskab.
- Afvejes en 50 ml polypropylen konisk rør. Overfør ca 6,0 g frosne orme fra 15 ml konisk rør lagret ved -80 ° C ved at skære gennem røret med en varm barberblad nær 6,5 ml mærket. En methanol-renset spatel kan anvendes til at fjerne frosne orm pellet fra bunden af røret. Ved at skære gennem pelleten for at hente den nedre del, mindre tætte larve orme og resterende bakterier fra toppen af pelleten er efterladt.
- Overfør de frosne orme til pre-vejede 50 ml konisk rør. Hvis flere prøver bliver behandlet, skal du bruge den samme mængde (6,0 g), væv for komparative undersøgelser. Da orme tø til en pasta, tilføje eller fjerne orme med spatel at opnå den ønskede masse. Valgfrit: add 1,00 ng PGF 2α-d4 standard som en intern kontrol til ekstraktion effektivitet.
- Tilføj 12 ml iskold 02:01 acetone / saltvand med 0,005% BHT til ormen suspension og bland godt ved vortex. Dispensér 1,5 ml af ormen opslæmningen til hver af tolv 5 ml selvstændige plastrør til brug i Bullet Blender.
- Tilføj 0,7-0,8 ml af 0,5 mm diameter Ceria stabiliseret zirconiumoxidperler til hver 5 ml rør. Luk caps stramt og indlæse de 12 rør i Bullet Blender 5 homogenisator. Kør blender i 3 minutter ved hastighed 8-9 og placere rørene på is. Sørg for at lukke hætterne meget stramt eller indholdet, kan løbe ud. Tjek 10 pi homogenat fra et glas på et dias ved hjælp af en stereoscope. Der bør være meget få intakte orme tilbage. Gentag med samme hastighed i et minut, hvis det er nødvendigt.
- Jævnt overføre homogenaterne til fire 10 ml koniske rør med en 9 "Pasteur-pipette. Undgå at overføre perler. Vask perlerne fra tre rør sequentially med 1 ml 1:2 acetone / saltvand indeholdende BHT. Gentag for andre rør, indtil alle perlerne vaskes. Overfør den resterende opløsning (~ 4 ml) til 10 ml glasrør og placere dem på is.
- Centrifuger 10 ml glasrør ved 4 ° C i en klinisk centrifuge ved ~ 1.000 xg i 10 min. Overfør supernatanten fra hvert rør til en ren 10 ml glas konisk rør.
- I en kemisk hætte, tilsættes et lige volumen af hexan til hver 10 ml reagensglas. For eksempel tilsættes 3,5 ml hexan til 3,5 ml acetone / saltopløsning. Vortex ved maksimal hastighed i 30 sek.
- Centrifuger 10 ml glasrør ved 4 ° C i en klinisk centrifuge ved ~ 1.000 xg i 10 min. Kassér den øvre fase indeholdende hexan og neutralt ladede lipider.
- Forsurer nedre fase til pH 3,5 under anvendelse af 2 M myresyre (ca. 100-150 ul). Testen pH hjælp pH strimler.
- Tilføj et lige så stort volumen chloroform til hvert rør. Vortex ved maksimal hastighed i 30 sekunder og centrifugeres rørene ved 4 ° C ina klinisk centrifuge ved ~ 1.000 xg i 10 min.
- Fjern og kassér den øverste vandige fase. Sæt en pipettespids gennem enhver resterende mælkeagtige interfase til den nedre chloroformfase, undgår interfasen. Saml den nedre fase fra hver af de 4 rør til en ren 15 ml konisk reagensglas. Inkuber ved -20 ° C i mindst 24 timer. På dette tidspunkt kan ekstrakten opbevares ved -20 ° C i op til to uger.
- Tag uddrag ud af fryseren, og kassér den resterende mælkeagtige vandige toplag, hvis til stede. Overfør chloroform fase til en mærket Teflon-foret ½-Dram hætteglas med en ny Pasteur-pipette. I en kemisk hætte fordampe chloroform fraktion til tørhed under en svag strøm af N2-gas. Den tørrede ekstrakt kan opbevares ved -20 ° C i op til 2 uger. En samlet ordning, der anvendes til PG ekstraktion og analyse er vist i figur 1..
3.. Prostaglandin Analysis
- Forbered lageropløsninger af individuelle referencemængder prostaglandiner, såsom PGF 2α eller PGF 2 α-d4 (1 ug / ml) i methanol og fortyndes med methanol: vand (8:2 v / v) til opnåelse af en brugsopløsning. Forbered en række fortyndinger (100, 10, 1, 0,1, 0,01 ng / ml) til at generere en standardkurve.
- Tilsæt 200 pi methanol: vand (8:2 v / v) til den tørrede C. elegans lipidekstrakt (r) og blandes grundigt. Hvis mindre end 6 g orm væv blev ekstraheret, bør den tørrede ekstrakt resuspenderet i mindre volumen af methanol: vand opløsning.
- Forbered mobil fase bestående af 0,1% myresyre i vand [A] og acetonitril indeholdende 0,1% myresyre [B].
- Opstil autosampler ved 4 ° C og placere prøvehætteglas i en 70-count 1,5 ml hætteglas rack.
- Ækvilibrere Synergy hydro RP-C18-søjle med 0,1% myresyre ved en strømningshastighed på 0,2 ml / min i ca 5 min.
- Prøven sprøjtes (20-50 ul) i kolonnen. Udfør gradienteluering starteArbejde med 10% B og går op til 80% B 0-11 min, 80-100% B 11-14 minutter og vender tilbage til 10% B på 16 min. Den samlede køretid er 20 min. Retentionstiderne af 13 autentiske standarder er vist i tabel 1 som reference 3.
- Introducere søjleeffluenten i massespektrometret ved hjælp af en ESI-interface, der opererer i negativ ion-mode. Anvendes nitrogen som en forstøver og gardin gas (CUR = 10). Kollisionen gas, kollision energi, og temperaturen er sat til 10, -35 eV og 600 ° C, hhv. Declustering potentiale (DP), kollision energi (CE) og celle exit potentiale (CXP) er indstillet til -90, -35 og -10, hhv.
- Til undersøgelsen scanninger (Q1 scanninger), bruge negativ ion-mode i massen vifte af m / z 315-360 for de fleste PG'er (figur 2). Intervallet kan ændres, afhængigt af massen af forbindelsen (erne) af interesse. Uddrag ioner fra total ion strøm (TIC) i LC-MS ion kromatogrammer og afgøre, om udvindingted ioner svarer til deprotonerede eller adduktet ioner eller fragment-ioner.
- For MRM eksperimenter, m / z masse overgang 355/311 anvendes til at detektere F1 klasse, m / z 353/193 anvendes til F2 klasse, og m / z 351/193 eller 351/191 anvendes til F3 klasse (Figur 3). MRM også anvendes til at detektere den interne standard (for eksempel, m / z 357/197 for PGF 2α-d4) og at generere standardkurven. Se Murphy et al. For yderligere oplysninger om PG masse overgange 18..
- For MS / MS eksperimenter, brug m / z 355 for F1 klasse, m / z 353for F2 klasse og m / z 351for F3 klasse PG. C. elegans MS / MS-data for F-serien PG'er fås i figur 4 og tabel 2 3,16. MS / MS data for pattedyr eicosanoider er tilgængelig på www.lipidmaps.org .
- Behandl de analytiske data ved hjælp af Analyst-software (version 1.4.2, Applied Biosystems).
Representative Results
Prøveforberedelse blev udført ved væske-væske ekstraktion tilpasset fra Golovko og Murphy 17.. Det gav fremragende genopretning af den interne standard (PGF 2α-d4). Den generelle ordning for PG udsugning fra C. elegans er vist i figur 1.. Kromatografiske betingelser var optimeret til at give baseline adskillelse af> 30 eicosanoid standarder (Tabel 1 viser 13 standarder). En Hydro-RP-søjle (250 x 2,0 mm id) med vand og acetonitril indeholdende 0,1% myresyre forudsat den bedste separation og følsomhed. Survey scanninger af vildtype og fedt-3 mutant ekstrakter vist i figur 2. dokument globale niveauer af ioner inden massen området 315-360 atommasseenheder. Fedt-3 (wa22) mutanter mangler højst 20-carbon PUFA. En F3-klasse PG er fremhævet. I figur 3 viser MRM analyser af en vildtype ekstrakt multiple PG isomerer af F1 (figur 3A ng>), F2 (figur 3B), og F3 (figur 3C og 3D) klasser. F3 klasse kan detekteres med enten af to masse overgange, m / z 351/193 eller m / z 351/191. CePGF2 overvejende består af PGF 2α enantiomeren. CePGF1 er sandsynligvis PGF 1α eller dens enantiomer. Figur 4 viser kollision-induceret nedbrydning af CePGF2 (RT = 11,8) sammenlignet med PGF2 α standarden (RT = 11,8). Mindre forskelle i produkt ioner sandsynligvis på grund af lav CePGF2 overflod og co-eluering af forbindelser i ekstraktet.
Figur 1. Skematisk diagram af C. elegans PS ekstraktion og LC-MS analyser. Bemærk at acetone / saltvand og chloroform begge har 0,005% BHT for at minimere lipidoxidation. Der henvises til teksten for flere detaljer.http://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.
Figur 2. Survey scanninger af m / z 315-360 af vildtype og fedt-3 (wa22) mutant ekstrakter. Væskekromatografi retentionstiden (RT) er vist i panelet [A]. Udtrukne ioner ved RT = 11.3 er vist for vildtype [B] og fedt-3 (wa22) [C] ekstrakter. En F3-klasse PG med masse m / z 351 er fremhævet. CPS tæller / sek, AMU atommasse enhed.
FigUre 3.. MRM analyser af vildtype ekstrakter. F1 klasse PG'er detekteres med mass overgang m / z 355/311 [A]. Bemærk, at flere hydrofobe forbindelser (RT> 14 min), der sandsynligvis ikke vil være PGS også påvises med denne overgang. F2 klasse PG'er detekteres med mass overgang m / z 353/193 [B]. F3 klasse PG'er detekteres med enten masse overgang m / z 351/193 [C] eller m / z 351/191 [D]. Bemærk, at ekstrakterne indeholde flere PG isomerer af hver klasse. Tal svarer til PG'er i tabel 2 viste. Koncentrationen af CePGF2 er 1,8 ng / ml. RT, opholdstid, CPS tællinger / sek.
Figur 4.. Collision-induceret nedbrydning af kemisk synthesized PGF 2α og CePGF2. pile i panelet [A] indikerer produkt eller fragmentering ioner deles mellem PGF 2α og CePGF2 (RT = 11,8). De produkt ioner ved m / z 309 og m / z 193 genereres fra indikerede spaltningssteder (fremhævet a og b), svarer til de viste strukturer, og er karakteristisk for F-serien PG'er [B]. CPS tæller / sek. Klik her for at se større figur .
| Standard | RT (min) | [MH] - m / z | Vigtige produkt ioner i MS / MS | ||||
| 20-hydroxy-PGE2 | 9.43 | 367 | 349 331, 287, 234, 189, 129, 109 | PGF 3 - | 11.26 | 351 | 333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111 |
| Thromboxan B 2 | 11,66 | 369 | 289, 191, 177, 169, 151 | ||||
| PGF 2 - | 11,80 | 353 | 335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111 | ||||
| PGF 1 - | 11,79 | 355 | 337, 319.311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195 | ||||
| Lipoxin B 4 | 12.38 | 351 | 201 191.189, 165, 155, 115, 107, 71, 59 | ||||
| PGD 2 | 12.56 | 351 | 315 271.203, 189 | ||||
| 5 (S), 6 (R) - lipoxin A 4 | 12.83 | 351 | 235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59 | ||||
| PGA 2 | 14.02 | 333 | 315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109 | ||||
| Δ12-PGJ 2 | 14.20 | 333 | 271, 189, 123 | ||||
| Leukotrien 4 | 14.73 | 335 | 181, 109, 93, 71, 69, 59, 57 | ||||
| 15d-Δ 12,14-PGJ 2 | 16,80 | 315 | 297 271, 217, 203, 158 | ||||
| 5 (S)-HPETE | 17.88 | 335 | 97, 83, 81, 57, |
Tabel 1. Retentionstider og vigtigste produktgrupper ioner af 13 eicosanoid standarder fra den LC-MS/MS metode 3. Mere end 30 standarder blev anvendt til at udvikle LC-MS/MS program. De kromatografiske retentionstider (RTS) er forskellige, selv blandt meget ens PG. En undtagelse er PGF 1α og PGF 2α. Desto mindre er disse PG'er er distinguished deres moderionen masse ([MH] - m / z) og kollision-induceret nedbrydning spektre (MS / MS).
| Prostaglandin klasse | No i figur 3 | [MH] - m / z | Vigtige produkt ioner i MS / MS |
| F1 (CePGF1) | 1 | 355 | 319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157 |
| F1 | 2 | 355 | 311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157 |
| F2 (CePGF2) | 3 | 353 | 309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127 |
| F2 | 4 | 353 | 309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113 |
| F3 | 5 | 351 | 315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 1.91, 167, 153, 139 |
| F3 | 6 | 351 | 333 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163 |
Tabel 2. Collision-inducerede nedbrydningsprodukt ioner for flere større C. elegans F1, F2 og F3 PG'er vist i figur 3. MS / MS af andre mindre rigelige isomerer er ikke vist. Disse data er fra flere analyser, og ikke alle produkt-ioner kan være synlige i en given løb. I betragtning af kompleksiteten af ekstrakterne, kan nogle mindre rigelige produkt ioner stammer fra en anden forælder ion med lignende retentionstid eller resultat af interferens. Top 2 er sandsynligvis en stereoisomer af CePGF1 og top 4 er sandsynligvis en stereoisomer af CePGF2. Se Edmonds, et al. (2010) for yderligere data 3.
Discussion
Vi beskriver en procedure for eicosanoid ekstraktion og analyse med fokus på F-serien PG. Der er flere dele af den procedure, der kan være problematisk. Det første er det afgørende, at ormen kulturer ikke sulte, da sult kan ændre PG stofskifte. For supplerende fodring er NA22 bakterier anbefales i stedet for de mere almindeligt anvendte OP50 bakterier, fordi NA22 når højere tæthed. Imidlertid NA22 stamme mangler antibiotikaresistens og er mere modtagelige for forurening. For det andet, orme syntetisere enkelte PG isomerer i lav tæthed i forhold til pattedyrsvæv. Dette kan til dels skyldes redundans blandt de mange isomerer. Vi anbefaler omkring 6 g væv for omfattende analyse og stærkere signaler. Mindre væv (1-2 g) kan anvendes, hvis det tørrede ekstrakt resuspenderes i mindre methanol: vand opløsning for at øge PG koncentration. Dog kan kun en eller to injektioner skal udføres. Detektionsgrænsen for vores LC-MS/MS system er omkring 10 pgPGF 2α / ml. En ml tætpakkede blandede fase orme (ca. 1 g) giver ca 25-50 pg CePGF2. Mere følsomme massespektrometri systemer kan reducere mængden af orm væv til analyse. For det tredje kan forskelle i PG udsugningseffektivitet blandt prøverne forårsage variable resultater. Vi har fundet, at udsugningseffektivitet er meget ens, når væv ekstraheres parallelt. At bestemme effektiviteten, tilsættes 1,0 ng PGF 2α-d4 ved homogeniseringstrinnet som en intern kontrol. MRM hjælp masse overgang m / z 357/197 anvendes til at måle PGF 2α-d4 koncentration i forhold til en 1 ng / ml standardopløsning. Mængden af PGF 2α-d4 tabt under ekstraktionen beregnes derefter.
Kromatografien parametre og masse overgange vi inddrager kan ændres til at spore andre PG og eicosanoider. Trods betydelige indsats, har vi ikke været i stand til at identificere D-serie eller E-Sererne PGS i ekstrakterne 17. Desuden har vi ikke fundet 8-iso PGF 2α og 8-iso PGE2 som er karakteristiske for fri radikal-initieret peroxidation, som genererer et ikke-selektivt blanding af PG stereoisomerer 19.. Hvorvidt orme syntetisere andre PG typer er ikke kendt. Endocannabinoids og forskellige epoxy-og hydroxy metabolitter af arachidonsyre og eicosapentaensyrer er blevet fundet i C. elegans udvinder 5,7,20,21. Vi anbefaler brug af både MRM og MS / MS i forhold til autentiske standarder for kvantificering og identifikation, hhv. For nye eicosanoider, bør disse analyser kombineres med en sammenlignende undersøgelse af fedt mutanter, der er mangelfulde i PUFA syntese enzymer 22, samt et funktionelt assay, hvis det er muligt. En advarsel til analyse af fedt mutanter er, at små mængder af PUFA stede i orme er tilstrækkelige til PG syntese. For eksempel fedt-2 (wa17) mutanterhar en lille mængde af D12 desaturaseaktivitet (~ 5% af vildtype 22) og disse mutanter stadig producere PG'er 6.. fedt-3 (wa22) og fedt-4 (WA14) mutanter undlader at syntetisere PG'er afledt af arachidonsyre og eicosapentaensyrer 16 . Vi har også fundet, at fedt mutanter kompensere for tabet af PUFA klasser ved opregulering PG syntese ud fra de resterende klasser. For eksempel, undlader fedt-3 (wa22) mutanter til at syntetisere de fleste PS stammer fra 20-carbon PUFA. I stedet synes de at opregulere roman PG stammer fra 18-carbon flerumættede fedtsyrer 16. Til dato har vi ikke identificeret en C. elegans stamme, der er fuldstændigt mangelfuld i PG syntese. Det er muligt, at PG'er er afgørende for vækst eller udvikling.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker UAB Målrettede Metabolomics og Proteomics Laboratory, som er blevet støttet delvist af UAB Skin Disease Research Center (P30 AR050948 til C. Elmets), UAB-UCSD O'Brien akut nyreskade Center (P30 DK079337 til A. Agarwal ) og UAB Lung Health Center (R01 HL114439, R01 HL110950 til JE Blalock). Støtte til massespektrometer var fra en NCRR Shared Instrumentation tilskud (S10 RR19261 til S. Barnes). Vi takker også Ray Moore for teknisk support. C. elegans stammer blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center, som er finansieret af NIH. Dette arbejde blev støttet af NIH (R01GM085105 til MAM, herunder en ARRA administrativ supplement).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||
| REAGENTS | |||||||||||||||||
| X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
| E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
| Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
| Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
| Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
| Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
| Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
| 10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| 15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
| Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
| EQUIPMENT | |||||||||||||||||
| CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
| Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
| Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
| SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
| SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
| Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
| API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||
References
- Watts, J. L. Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans. Trends Endocrinol. Metab. 20, 58-65 (2009).
- Marza, E., Lesa, G. M. Polyunsaturated fatty acids and neurotransmission in Caenorhabditis elegans. Biochem. Soc. Trans. 34, 77-80 (2006).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
- Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26 (3), 554-566 (2012).
- Kosel, M., et al. Eicosanoid formation by a cytochrome P450 isoform expressed in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Biochem. J. 435, 689-700 (2011).
- Kubagawa, H. M., et al. Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo. Nat Cell Biol. 8, 1143-1148 (2006).
- Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473, 226-229 (2011).
- Gerisch, B., et al. A bile acid-like steroid modulates Caenorhabditis elegans lifespan through nuclear receptor signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5014-5019 (2007).
- Edison, A. S. Caenorhabditis elegans pheromones regulate multiple complex behaviors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 378-388 (2009).
- Funk, C. D. Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology. Science. 294, 1871-1875 (2001).
- Wang, D., Dubois, R. N.
- Cha, Y. I., Solnica-Krezel, L., DuBois, R. N. Fishing for prostanoids: deciphering the developmental functions of cyclooxygenase-derived prostaglandins. Dev. Biol. 289, 263-272 (2006).
- Hata, A. N., Breyer, R. M. Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: multiple roles in inflammation and immune modulation. Pharmacol. Ther. 103, 147-166 (2004).
- Sugimoto, Y., Narumiya, S., Ichikawa, A. Distribution and function of prostanoid receptors: studies from knockout mice. Prog. Lipid Res. 39, 289-314 (2000).
- Basu, S. Isoprostanes: novel bioactive products of lipid peroxidation. Free Radic. Res. 38, 105-122 (2004).
- Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. A heterogenous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the C. elegans reproductive tract. PLoS Genetics. 9 (1), e1003271 (2013).
- Golovko, M. Y., Murphy, E. J. An improved LC-MS/MS procedure for brain prostanoid analysis using brain fixation with head-focused microwave irradiation and liquid-liquid extraction. J. Lipid Res. 49, 893-902 (2008).
- Murphy, R. C., et al. Electrospray ionization and tandem mass spectrometry of eicosanoids. Anal. Biochem. 346, 1-42 (2005).
- Milne, G. L., Yin, H., Morrow, J. D.
- Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chem. Biodivers. 5, 2431-2441 (2008).
- Kulas, J., Schmidt, C., Rothe, M., Schunck, W. H., Menzel, R. Cytochrome P450-dependent metabolism of eicosapentaenoic acid in the nematode Caenorhabditis elegans. Arch. Biochem. Biophys. 472, 65-75 (2008).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
