Summary
O objectivo é o de produzir uma fístula artério-venosa que é simples e reprodutível. Este método não utiliza suturas ou cola adesiva. Por conseguinte, as amostras podem ser usadas, com a menor quantidade de materiais estranhos para análise.
Abstract
Aspectos técnicos da criação de uma fístula arteriovenosa no rato são discutidos. Sob anestesia geral, uma incisão abdominal é feita, e a aorta ea veia cava inferior (IVC) são expostos. A aorta infra-renal da aorta proximal e distal são dissecados para a colocação de grampo e punção com agulha, respectivamente. É dada especial atenção para evitar a dissecção entre a aorta ea veia cava inferior. Depois de prender a aorta, uma agulha 25 G é usada para perfurar ambas as paredes da aorta para a VCI. O tecido conjuntivo circundante é utilizado para compressão hemostática. Criação bem sucedida da FAV vai mostrar o fluxo de sangue arterial pulsátil no IVC. A confirmação adicional da FAV bem sucedido pode ser conseguido através de ultra-som Doppler de pós-operatório.
Introduction
A opção mais comum escolhido para a terapia de substituição renal em pacientes com doença renal terminal é a hemodiálise. Acesso para hemodiálise é realizada por fístula arteriovenosa (FAV), enxerto artério-venosa, ou a colocação do cateter temporário. Embora AVF são o modo preferido de acesso, AVF ainda estão longe de ser perfeito. Taxas de permeabilidade de um ano primário FAV são apenas 60-65%, com muitas falhas devido a hiperplasia neointimal. A biologia molecular ea fisiologia da formação AVF normal e formação inadequadas permanece mal caracterizado. Como tal, muito se ganha na melhoria dos resultados FAV com o ganho que o acompanha na compreensão da regulação da formação de fístula 1-3.
A exposição de uma veia com o fluxo arterial é vulgarmente estudada no contexto de enxertos de veias, que são modelos directos de desvio cirúrgico. 4, 5 Embora os enxertos de veia e AVF similarmente expor uma veia para um ambiente arterial, há vários di críticorenças entre eles. Primeiro, a resistência do leito de escoamento distal é muito mais baixa no FAV, como a FAV drena para o átrio direito, enquanto que o enxerto de veia drenos para os doentes, muitas vezes pequenas artérias distais, o que resulta num aumento do fluxo sanguíneo e tensão de cisalhamento na FAV. Em segundo lugar, o sangue venoso do membro da FAV pode ser uma mistura de sangue venoso e arterial que conduz a uma menor oxigenação em comparação com o conteúdo puramente arteriais no enxerto de veia. Em terceiro lugar, a veia da FAV não é removida do seu leito, levando à conservação do seu vaso venorum inervação e nervosas, em comparação com a transposição completa do enxerto de veia para o leito arterial. Por último, o número de anastomoses é geralmente de dois em enxertos de veias Considerando uma FAV tipicamente tem apenas um. No presente estudo, nós apresentamos um modelo de rato com fístula aorto-cava que pode ser usado para o estudo da FAV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Os procedimentos de anestesia e pré-operatória
- A indução da anestesia geral
Aprovação pelo Animal Care Institucional e Comitê de uso apropriado é obtido. C57/black camundongos machos, com idade de 10 semanas são anestesiados. Entregar 4% isoflurano com 0,8 L / min de oxigênio a uma caixa de acrílico através de um vaporizador isoflurano e coloque o mouse para dentro. Alternativamente, se preferido pelo cirurgião, a anestesia intraperitoneal pode ser usada. - Preservar a anestesia
Após a confirmação da anestesia pela falta de reação a pitada dedo do pé, o mouse é colocado sobre a mesa de operação em decúbito dorsal com uma máscara de silicone. Isoflurano é reduzida para 2%, para manter o nível de anestesia adequada. - Depilação
Ventral cabelo é removido do pescoço para baixo-ventre usando um removedor de cabelo. Removedor de cabelo é preferido porque o cabelo que fica usando uma máquina de barbear pode interferir com o ultra-som Doppler.
2. Ultrasoun pré-operatóriod
- Objectivos do ultrassom
Exame de ultra-som Doppler é realizado antes da cirurgia AVF, de forma a registrar os resultados de nível básico que podem ser comparados com os resultados pós-operatórios para ver as mudanças anatômicas e fisiológicas. - Os pontos de observação
A veia jugular, supra e infra-renal, veia cava inferior (IVC), e da aorta abdominal são examinados utilizando tanto pulso Doppler e em modo-B. - Medidas
Usando o modo B, o diâmetro de cada vasculatura é medido. Além disso, a velocidade máxima (pico de velocidade sistólica em artérias) e as formas de onda são registados em cada um dos pontos de medição descritos acima.
3. Procedimentos Operativos
- Rato Preparação
Prepare o local da incisão com um anti-séptico tópico e continuar a técnica asséptica apropriada durante a cirurgia, incluindo o uso de uma cortina cirúrgica, luvas e instrumentos esterilizados, etc - Laparotomia
Incisão na linha média abdominal é feita from borda inferior do fígado para um pouco acima do púbis. - A exposição da aorta e veia cava inferior.
Um afastador é inserido e todos os intestinos são puxados para fora da cavidade abdominal para o lado direito e mantida envolta em gaze embebida em soro fisiológico. Dissecar a membrana que liga o retroperitônio e inferior do cólon para visualização completa da aorta e veia cava inferior. Aplicar pressão sobre a bexiga, se é dilatado e fica no caminho. - A exposição do local de punção
O local da punção será entre meia a três quartos da distância da veia renal esquerda para bifurcação aórtica. (Figura 1) Dissecar a margem esquerda da aorta, de modo que possa ser perfurado. Tenha em atenção que a aorta é posicionado a cerca de 45 graus para trás da VCI e deve ser dissecado posteriormente em adição à esquerda. (Figura 2) O ponto mais importante desta cirurgia não é dissecar entre a aorta ea veia cava inferior. Manter longe deles. - A exposição do local de fixação da aorta
Dissecar a aorta infrarenal de tecidos circundantes. Tenha cuidado para não ferir o IVC nas veias renais esquerda e da esquerda com seus afluentes à direita. - Clampeamento da aorta
Prenda a aorta proximal, aplicando clipes de microcirurgia. - A rotação da aorta
Ao agarrar o tecido conjuntivo em torno da aorta, a aorta girar de modo que o punção pode ser feita a partir do lado dorsal ligeiramente da aorta (Figura 2). - Punção da aorta até IVC
Mantendo a aorta numa posição rodada, por meio de punção na aorta aos VCI usando uma agulha 25 G. (Figura 2) Se for bem sucedido, a agulha pode ser visto através da fina parede da VCI. - Hemostasia
Ao puxar os tecidos retroperitoneais, incluindo os músculos, enrole o local da punção da aorta. Não comprimir a aorta contra a CIV, como for o coágulo FAV (Figura 3). - De-pinçamento da aorta
Depois da confirmaçãoda hemostasia primária, de-clamp da aorta. Sangramento adicional pode ocorrer, mas ele pode ser interrompido com mais compressão descrito acima. Ao de-aperto, o sangue arterial pode ser visto fluindo para o IVC, em vez do fluxo sanguíneo venoso escuro. - Encerramento do abdômen
Retorne as entranhas em sua posição natural e fechar o abdômen.
4. Os procedimentos pós-operatórios
- Cuidados pós-operatórios
Após o fechamento do abdômen, isoflurano está parado. Cuidados pós-operatórios, incluindo analgesia e tratamento de feridas é aplicada de acordo com as instruções recomendadas pelo Animal Care Institucional e Comitê de uso. Para analgesia usamos buprenorfina a 0,1 mg / kg intrasmuscularly cada 12 horas durante 24 horas após os procedimentos cirúrgicos. - Ultra-som pós-operatória
No primeiro dia após a operação, de ultra-som Doppler é realizada para confirmar a FAV. Além disso, outras variáveis são medidos para verificar as alterações do pré-operatóriavalores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Depois do treino, a sobrevivência, no primeiro dia pós-operatório é normalmente superior a 95%, no dia pós-operatório 7, a sobrevivência foi de 91,3% As figuras 1 e 2 mostram o local de punção ideal em cortes coronais e transversal,. Colocação do punção local é fundamental para a obtenção de boa sobrevida sem hemorragia excessiva. Óbitos intra-operatórias e as mortes pós-operatórias precoces são normalmente devido à hemorragia. Isto tende a ocorrer com dissecção excessiva entre a aorta ea veia cava inferior, ou a partir de pressão hemostática inadequada. Figura 3 mostra um diagrama esquemático da importância de envolver o local da punção com tecido conjuntivo, antes de aplicar a pressão de hemostasia, permitindo uma boa hemostasia sem compressão do AVF. Em nossa experiência, todos AVF tecnicamente bem-sucedida pode ser confirmado com ultra-som no terceiro dia, uma vez que a FAV é confirmado em duplex para estar presente, da FAV será geralmente estável pelo menos até o dia 28 Figura 4.mostra achados típicos de ultra-som Doppler na formação AVF sucesso. Mudanças nas formas de onda foram observados ao nível da FAV de VCI e para o coração. A taxa de confirmação AVF geral no dia 3 pós-operatória foi de 71,4%.
Figura 1. Diagrama mostrando o local da punção. O local da punção ideal é entre metade e três quartos da distância entre a veia renal esquerda e bifurcação ilíaca. IVC: veia cava inferior.
Figura 2. Diagrama de seção transversal da formação local da FAV. A seta preta denota o local de directivas ena de dissecção para expor a aorta. A seta azul denota o local de punção e direção.
Figura 3. Diagrama mostrando o método de hemostasia fileira superior:. Envolvendo a aorta com tecidos conjuntivos e músculos. Linha de baixo: a aplicação de pressão direta. As chances de fechamento da FAV são elevados com compressão direta.
Figura 4. Achados ultra-sonográficos após a cirurgia. AVF A AVF foi examinado com ultra-som de alta resolução no pós-operatório. As formas de onda abaixo da FAV foram formas de onda venosa típico, enquanto e acima da FAV as formas de onda mostrou sobreposição de fluxo arterial que não estava presente abaixo da FAV. <a href = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50449/50449fig4large.jpg" target = "_blank"> Clique aqui para ver a figura maior.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Há vários relatos que descrevem AVF em ratos, incluindo AVF femoral, 6, 7 carótida para jugular AVF 8 e aorto-cava AVF. 9, 10 O rato é várias vezes maior do que o mouse, permitindo que a cirurgia mais fácil em comparação com o rato o mouse. No entanto, a fim de tirar vantagem das estirpes e variantes genéticas do rato, o processo deverá ser alargado para incluir os modelos de ratinho. Vários relatórios publicados anteriormente introduziu o modelo AVF em ratos, mas esses relatórios têm sido geralmente no contexto de desenvolvimento de um modelo para a insuficiência cardíaca direita, usando agulhas de maior porte 11-13 Guzman relatou uma técnica semelhante à nossa;. No entanto, em Nesse relatório, os autores usaram suturas para fechar a arteriotomia. 13 Nós não usamos suturas para evitar potenciais interferências com posterior extração de proteínas e RNA para análise molecular. Além disso, o fecho da arteriotomia com suturas acarreta um risco de aplicação excessivatensão na fístula que pode levar a hemorragia aguda ou tardia. Em outros relatórios, FAV foram criadas entre as carótidas e veias jugular, utilizando o método de punho 14. Neste estudo, descrevemos um método simples e reprodutível, que pode ser usado nos estudos de si FAV que não dependem de um manguito peri-anastomótico .
Nós criar uma FAV através de punção do rato aorta infra-renal com uma agulha 25 G e estendendo-se o furo através da parede lateral da aorta para a veia cava inferior infra-renal. Durante o desenvolvimento da nossa metodologia atual, temos notado alguns pontos técnicos importantes para melhorar o sucesso técnico e consistência do procedimento:
- O local da punção da aorta é colocado em aorta abdominal distal. Como mostrado na Figura 1, a porção proximal da aorta abdominal infra não é posicionado lado a lado com a VCI, e não há mais do tecido conjuntivo entre os dois vasos, que inibe a estabilização da AVFlevando a sangramento e baixa permeabilidade.
- Não são necessários grampos, distalmente para além do ponto de punção na aorta. Proximal aperto é suficiente para minimizar a pressão sanguínea durante o procedimento. Além disso, os grampos distais iria interferir com a perfuração da aorta.
- Como mostrado na Figura 2, a direcção mais eficiente e fisiológico, por meio de punção para a VCI é da esquerda para a direita traseira ventral. Não fazer isso pode levar a um menor tamanho fístula que leva à maturação mais lenta ou oclusão precoce. Portanto, prefere-se dissecar a porção exterior posterior da aorta e para girar a aorta ligeiramente para a direita, de modo a obter vista directa sobre o local da punção.
- Para a hemostasia, o orifício de entrada da aorta é reparado apenas com compressão usando os tecidos circundantes, e não necessita de reparação de sutura da arteriotomia ou qualquer cola adesiva. A sutura pode puxar a aorta longe da VCI, o que pode conduzir à oclusão da FAV. Cola podedar reforço para a hemostasia, mas também pode interferir durante o exame de ultra-som Doppler, bem como fazer a extração do tecido pós-operatório difícil. Tal como para a compressão, que não aplique uma pressão directa sobre o local da punção para o CIV porque também pode comprimir a fístula assim. Tal como descrito acima e mostrado na Figura 3, que envolva a aorta com os músculos e tecidos conjuntivos circundantes.
Uma potencial limitação deste estudo é que este modelo é feita entre aorta e CIV, navios de grande porte na pequena mouse. Não está claro se este modelo imita a AVF, usado no tratamento clínico de pacientes humanos, ou seja, da FAV feito em pequenas artérias periféricas. Além disso, os animais de controlo para as experiências deve ser realizado com cuidado, e dependem do protocolo experimental. Normalmente usamos operações simuladas de controles, em que realizamos o fechamento imediato laparotomia e sob anestesia geral, sem qualquer puncture em tudo.
Nós descrevemos um protocolo curto em que o operador pode executar AVF em ratos, dentro de 15-20 min. Prevemos que este modelo será útil para estudos de adaptação fístula que pode ser útil para pacientes humanos com doença renal em estágio final, especialmente se usado em conjunto com modelos do rato da doença.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte pelo Instituto Nacional de Saúde concessão R01-HL095498, bem como com os recursos eo uso de instalações do Sistema de Saúde VA Connecticut, West Haven, CT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 770 ultrasound machine | Visualsonics | 20-60 Mhz scan head; RMV-704 | |
| Vascular clamp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5424 | |
| Clamp applying forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 | |
| 25 Gauge Needle | Becton Dickinson | BD PrecisionGlide Needle 25G x 7/8 #305124 |
References
- Allon, M. Current management of vascular access. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 2 (4), 786-800 (2007).
- Dixon, B. S. Why don't fistulas mature? Kidney International. 70 (8), 1413-1422 (2006).
- Roy-Chaudhury, P., Spergel, L. M., Besarab, A., Asif, A., Ravani, P. Biology of arteriovenous fistula failure. Journal of Nephrology. 20 (2), 150-163 (2007).
- Kudo, F. A., Muto, A., et al. Venous identity is lost but arterial identity is not gained during vein graft adaptation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (7), 1562-1571 (2007).
- Muto, A., Yi, T., et al. Eph-B4 prevents venous adaptive remodeling in the adult arterial environment. The Journal of Experimental Medicine. 208 (3), 561-575 (2011).
- Croatt, A. J., Grande, J. P., et al. Characterization of a model of an arteriovenous fistula in the rat: the effect of L-NAME. The American Journal of Pathology. 176 (5), 2530-2541 (2010).
- Misra, S., Fu, A. A., et al. The rat femoral arteriovenous fistula model: increased expression of matrix metalloproteinase-2 and -9 at the venous stenosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 19 (4), 587-594 (2008).
- Kojima, T., Miyachi, S., et al. The relationship between venous hypertension and expression of vascular endothelial growth factor: hemodynamic and immunohistochemical examinations in a rat venous hypertension model. Surgical Neurology. 68 (3), 277-284 (2007).
- Caplice, N. M., Wang, S., et al. Neoangiogenesis and the presence of progenitor cells in the venous limb of an arteriovenous fistula in the rat. American Journal of Physiology Renal Physiology. 293 (2), F470-F475 (2007).
- Nath, K. A., Kanakiriya, S. K., Grande, J. P., Croatt, A. J., Katusic, Z. S. Increased venous proinflammatory gene expression and intimal hyperplasia in an aorto-caval fistula model in the rat. The American Journal of Pathology. 162 (6), 2079-2090 (2003).
- Karram, T., Hoffman, A., et al. Induction of cardiac hypertrophy by a controlled reproducible sutureless aortocaval shunt in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 18 (6), 325-334 (2005).
- Perry, G. J., Mori, T., et al. Genetic variation in angiotensin-converting enzyme does not prevent development of cardiac hypertrophy or upregulation of angiotensin II in response to aortocaval fistula. Circulation. 103 (7), 1012-1016 (2001).
- Guzman, R. J., Krystkowiak, A., Zarins, C. K. Early and sustained medial cell activation after aortocaval fistula creation in mice. The Journal of Surgical Research. 108 (1), 112-121 (2002).
- Castier, Y., Lehoux, S., et al. Characterization of neointima lesions associated with arteriovenous fistulas in a mouse model. Kidney International. 70 (2), 315-320 (2006).
