Summary
Multi-метод визуализации является ценным подход к изучению бактериальной колонизации в малых животных моделях. Этот протокол описывает инфекции мышей с биолюминесцентного
Abstract
Этот протокол описывает шаги, необходимые для контроля продольно биолюминесцентное бактериальной инфекции использованием композитных 3D рассеянный свет томографии с интегрированным μCT (DLIT-μCT) и последующее использование этих данных для создания четырехмерной (4D) фильм инфекции цикла. Разработать фильмы 4D инфекции и для проверки DLIT-μCT визуализации для исследования бактериальной инфекции, используя IVIS Спектр CT, мы использовали инфицирование биолюминесцентными C. rodentium, что приводит к самоограничения колита у мышей. В этом протоколе, мы наметим заражение мышей с биолюминесцентными C. rodentium и неинвазивного мониторинга колонизации ежедневно DLIT-μCT изображений и численности бактерий из фекалий в течение 8 дней.
Использование IVIS Спектр КТ облегчает бесшовных совместного регистрации оптических и μCT сканирований с использованием одной платформы визуализации. Низкой модальности μCT дозы позволяет изображениями мышейв различные моменты времени во время инфекции, предоставление подробной анатомической локализации биолюминесцентных бактериальных очагов в 3D, не вызывая артефакты из полезных излучения. Важно отметить, что 4D фильмы зараженных мышей обеспечивают мощный аналитический инструмент для мониторинга динамики бактериальной колонизации в естественных условиях.
Introduction
Малые животных моделей, в частности тех, которые используют мышей, которые обычно используются для исследования бактериальных патогенез или для проверки стратегии вмешательств на инфекции, такие как антибиотики, пробиотиков, пребиотиков и вакцины 1-7. Основные экспериментальные показания от небольших инфекций животного патогенов, пространственной и временной локализации инфекции и изменений в иммунной реакции зараженного организма. В естественных оптических изображений представляет собой ценный инструмент для исследования инфекционных заболеваний и может быть использовано для контроля нескольких экспериментальные считывания с использованием репортерных генов (люциферазы, флуоресцентные белки, бета-лактамазы, и т.д.), флуоресцентные красители, наночастицы или хемилюминесцентного зондов, направленных на белок, биологических процессов или микроорганизм 6.
Биолюминесценции изображений (BLI) является оптический метод визуализации используется для контроля колонизации мелких животных, таких как мыши и крысы, патогенными бактериРИА 3,6,8,9. Мышей инфицировали рекомбинантными бактерий, экспрессирующих люциферазы, такие, как оперон люкс CDABE от Photorhabdus luminescens. Эти бактерии могут быть обнаружены с помощью их свет производства с использованием CCD основанный в естественных изображений система 3,6,9. Важно отметить, что только метаболически активные микроорганизмы биолюминесцентными (BL), а это означает только жизнеспособные бактериальные клетки обнаруживаются этой методологии 10,11. Использование 2D БЛИ, расположение источника BL выводится из поверхности животного, где сигнал испускается 8. Точная анатомическая локализация очагов BL в естественных условиях должна быть определена через экс анализа естественных органов 3,6,9 В отличие от композитных 3D рассеянный свет томографии (DLIT) могут быть использованы для составления количественного 3D-реконструкция BL Источник 12. DLIT осуществляется путем сбора BL съемка с использованием определен узких полосовых оптических фильтров иВпоследствии ввода их в диффузионной оптической томографии 3D алгоритм реконструкции 1,7,12,13.
В настоящее время, мульти-метода визуализации является единственной методологии доступны, чтобы получить истинный неинвазивной анатомической локализации биолюминесцентного очагов в естественных условиях без необходимости бывший анализ естественных условиях. В последнее время мы использовали комбинацию DLIT совмещались с изображениями μCT оценить Citrobacter rodentium (C. rodentium) колонизации динамику после профилактического лечения с пробиотические бактерии 7. C. rodentium является мышиным конкретного возбудителя кишечных использоваться для моделирования инфицирования человека энтеропатогенных enterhemorrhagic и кишечная палочка 14. C. rodentium инфекция вызывает колит, обычно связанных с мягким потеря веса, диарея, поляризованные Th1 иммунного ответа и различные патологические изменения, в том числе толстой гиперплазии крипт и присоединение и скромный поражения formatiна 14. В дополнение к этому, C. rodentium патогенезе была хорошо изучена благодаря использованию BLI и ее динамика колонизации у мышей C57BL/6J хорошо документированы, что делает эту бактерию идеальным микроорганизмов модель для использования с несколькими метода визуализации 3,4,7.
Этот протокол является первым наметить методика комплексного DLIT-μCT изображений бактериальной инфекции с помощью одной платформы визуализации комплексного, IVIS Спектр CT, и поколение 4D кино показывает истинную динамику этой инфекции неинвазивным.
Protocol
1. Подготовка Мыши
- Покупка или породы достаточно 18-20 г C57BL/6J мышей, необходимых для исследования.
- Если мышей закупается у внешних поставщиков, после транспортом до объекта, приучить мышей в течение 1 недели автоклавного пищи и воды для стабилизации микрофлоры кишечника.
- Взвешивают ухо качеством, и отделить необходимое количество мышей в клетку.
- За день до инфекции, перед выполнением любой анестезии, убедитесь, что имеется достаточно кислорода и изофлурана на время процедуры. При необходимости добавить больше изофлуорана или заменить кислородный баллон. Впоследствии, проверить вес анестетика падальщики, если они получили более 50 г с момента их первого использования, отказаться от них и заменить свежим мусорщиков.
- Обезболить мышей с использованием 3% изофлуорана в XGI-8 анестезии системы и депилировать использованием VEET в течение 7 мин.
- Примечания:
- Капитальный депиляции необходимо, особенно вчерных мышей как меланин в меха значительно ослабляет сигнал биолюминесцентными 3,15.
- Депиляция мышей обычно длится 8-10 дней до мех начинает вырастить. Для выполнения комплексного 4D изображений в течение длительных периодов, удалять волосы мышей, когда это требуется, так что область интересов обнаженной для визуализации сессий.
- Мыши размещены в уровнем безопасности 2 (BSL-2) сдерживание объекта.
2. Бактериальный препарат сотовых
- Подготовьте Лурия Burtani бульон и агаром дополнена канамицину [50 мкг мл-1], необходимые для исследования и хранят при температуре 4 ° С до использования.
- За день до инфекции таять криопробирку С. rodentium штамм ICC180 и сразу же добавить одну cryobead до 15 мл LB бульоне с добавлением канамицина [50 мкг мл -1] и культуры в течение ночи при 220 оборотах в минуту, 37 ° С. В качестве контроля для средних загрязнений, подготовить дополнительныйнезасеянной 15 мл LB бульоне с добавлением канамицина [50 мкг мл-1] и культуры на 220 оборотов в минуту, 37 ° С.
- На следующее утро (~ 16 часов), проверьте контрольную среду по мутности как признак роста бактерий. Если контрольная ясно, передавать ICC180 культуры трубки сокола и центрифуге при 4000 оборотов в минуту. Впоследствии, мыть бактериальных гранул в PBS. Затем ресуспендируют в 1,5 мл PBS (1/10 от первоначального объема LB с канамицином дополнена) и тщательно перемешивают, чтобы создать бактериального инокулята.
- Чтобы убедиться, что ICC180 была культивировали надлежащим образом и биолюминесцентными до заражения мышей, изображения посевного материала в IVIS спектра КТ использованием BLI и автоматической настройки в Живой мастер 4.3.1 изображения, как описано выше 1.
Примечание:- Штамм ICC180 является биолюминесцентного производное дикого типа C. rodentium ICC169 2. Данный бактериальный штамм имеет оперону Lux CDABE включая Kanamycin ген устойчивости вставляется в псевдоген из xylE в хромосоме 2.
- Выполните все бактериальные культивирования с использованием стандартных методов асептики и, если необходимо либо приобрести стерильные расходные материалы / реагентов или автоклавного перед использованием.
- На шаге 2.4, биолюминесценции чтения (п / с / см 2 / ср) может быть использован для оценки количества бактерий до заражения мышей.
3. Заражение мышей с Биолюминесцентный C. rodentium и оценки бактериальной колонизации
- До инфекции, убедитесь, что имеется достаточно кислорода и изофлуран для продолжительности процедуры. При необходимости добавить больше изофлуорана или заменить кислородный баллон. Впоследствии, проверить вес анестетика падальщики, если они получили более 50 г с момента их первого использования, отказаться от них и заменить свежим мусорщиков.
- Обезболить мышей с 3% изофлуорана использованием XGI-8 AnaestheSIA системы обеспечения гуманного сдержанность.
- Смешать бактериального инокулята тщательно и использовать 0,2 мл (приблизительно 5 × 10 9 КОЕ ICC180) в шприц.
- Удалить мышей от наркоза системы по одному и загривок их, крепко держа за кожей шеи с большим и указательным пальцами.
- Нажмите на зонд иглы к небу, на языке, и через пищевод и вводят бактериального инокулята в желудок.
- После перорального введения через зонд мышей, наблюдать за их походки и дыхания признаки бедствия, которая может быть признаком того, что бактериальная посевной был доставлен в легкие. Эвтаназии любой мышей, которые были привиты в легких.
- Желудочный зонд неинфицированных мышей с 200 мкл PBS в качестве средства управления, как описано в пунктах 3.1-3.6.
- Чтобы подтвердить, что желудочный зонд был выполнен правильно, изображения и макет инфицированных инфицированных мышей в IVIS спектра КТ использованием BLI и автоматические установки в гостинойМастер изображения 4.3.1, как описано выше 1.
- Определение количества жизнеспособных бактерий в посевной путем серийного разведения в PBS и определение в трех экземплярах на LB-агар с канамицином [50 мкг мл-1].
- Вычисление количества ICC180 КОЕ / мл путем нахождения разбавления, где есть примерно 5-50 колоний и подсчитывают количество колоний от каждой точки на что разбавление и записывать разбавления, что колонии подсчитывали далее. Впоследствии, вычислить среднее количество КОЕ (из трех мест) и умножить эту величину на коэффициент разбавления 50 (каждое пятно 20 мкл оригинал 1 мл образца) и разбавления колонии подсчитывали на, давая КОЕ / мл.
- Монитор колонизации мышей ежедневно путем сбора фекалии от каждой мыши в предварительно взвешенную пробирку Эппендорфа (взвешивали на тонкий баланс) и разбавленной 1/10 в PBS в расчете на массу образца (0,1 г мл-1).
- Определение количества жизнеспособных бактерийкала путем серийного разведения в PBS и кровянистые выделения в трех экземплярах на LB агар с Канамицин [50 мкг мл -1].
- Вычисление количества жизнеспособных бактерий на грамм фекалий, следуя шагом 3,9, а затем умножить количество КОЕ / мл в фекальных фактор разведения в PBS (шаг 3,10) 0,1 г мл -1 дать КОЕ / г.
- Чтобы определить, что мышам инокулировали с чистым ICC180 культуры и что все колонии биолюминесцентного. Возьмем агаром, полученного на стадии 3.8, оценки морфологии бактериальных колоний либо на глаз или выбрать представителя колонии от пластины и анализируют с помощью световой микроскопии. При необходимости идентификации бактерий может быть выполнена штамм конкретных ПЦР колоний для оценки чистоты культуры. Впоследствии изображение пластин в IVIS спектра КТ использованием BLI как описано в пункте 3.7 и убедитесь, что 100% из колонии на пластине биолюминесцентными.
Примечания:- На шаге 3.4, при вставке иглы через желудочный зонд, Если вы чувствуете сопротивление не заставляют иглы зонда, так как это приводит к посевной пойти в легкие. Вместо этого проблемы, вставить иглу и осторожно попробуйте еще раз.
- Шаг 3.1 не является обязательным и мыши могут быть устными вводили через зонд без анестезии в зависимости от политики социального обеспечения животных институтов.
- Стулья должны быть покрыты из того дня, как они собраны. C. rodentium будет расти, даже если оставляли при 4 ° С в течение ночи в PBS и вызовет количественное КОЕ / г стула, чтобы быть неверным.
4. Ежедневно Композитный 3D диффузного света томографии с μCT томография (DLIT-μCT) зараженных мышей
Благополучие животных соображений: DLIT-μCT включает DLIT оптического изображения интегрированы с быстрым, малых доз радиации μCT сканирования (~ 23 мГр на две мыши сканирования, ~ 53 мГр на одно сканирование мышь) из иммобилизованных животных. Эта доза накапливается с каждым изображений сессии, таким образом, целью является сохранить дозы, как лож насколько это возможно (и всегда значительно ниже LD 50/30), в то же время выполнения исследования. В некоторых случаях, если нет никаких признаков инфекции в обычное сканирование BLI мышей, сканирование μCT можно избежать, для дальнейшей минимизации дозы. Хотя доза настолько низким, насколько это возможно, длительного исследования, если есть озабоченность по поводу радиационного облучения, мыши будет забито при первых признаках вредных симптомов или в конце периода μCT изображений.
- До изображений, инициализировать IVIS спектра КТ и убедитесь, что рентгеновские защитные блокировки работают, и что нагретая этап при правильной температуре (37 ° C) для работы с изображениями. Затем проверить уровень isoflourane в системе анестезии и веса анестетик поглотители. При необходимости добавьте больше изофлуорана и если мусорщики получили более 50 г с момента их первого использования, отказаться от них и заменить свежим мусорщиков.
- Настройка Спектр КТ, так что визуализация параметров, которыезапустить функцию автоматической экспозиции в живых 4.3.1 изображения оптимизированы для работы с изображениями бактериальной люциферазы. Выберите Edit> Preferences> Приобретение и окна автоэкспозиции. Затем выберите> Значения диапазона> Exp. Время (в секундах) и установить> Макс. до 300 секунд. Наконец, выберите> Target граф (минимум)> люминесцентные и установлен в 10 000 пунктам.
- Вставьте одну мышь изображений платформы в спектр КТ и отвеса его в наркоз.
- Включите рентгеновская защитная блокировка и инициализировать IVIS.
- Как только IVIS Спектр КТ была инициализирована, обезболить мышей с 3% изофлуорана использованием XGI-8 анестезии системы обеспечения гуманного сдержанность.
- Чтобы определить, является ли это необходимо для выполнения DLIT-μCT сканирования, прообраз мышей с использованием BLI, как описано выше 1, в одной платформы визуализации мыши. Если надежный сигнал получается мыши подходит для работы с изображениями DLIT. Оставьте наркозом мыши в одну мышь изображений platforм после сканирования BLI готовы к DLIT-μCT.
- Использование изображений мастера в живой образ программного обеспечения 4.3.1 для настройки DLIT-μCT сканирования. Мастер изображения автоматически определяет поле зрения, время экспозиции, диафрагмы и корзины для DLIT и поле зрения, время экспозиции, наборы фильтров и корзины для μCT изображений, чтобы дать лучшее отношение сигнала к шуму. В ответ на вопрос Мастера изображений, включает только 560, 580, 600 и 620 нм фильтра выбросов и выберите одну мышь μCT сканирования. Затем нажмите кнопку>, чтобы начать приобретать изображения.
- Вернуться наркозом мышь в клетку после съемки, удалить изображения одним щелчком платформу от спектра КТ и дезинфекции с использованием 1% Tri-гена. Если необходимо, заменить пеноматериала, что мышь находится на минимизировать риск перекрестного загрязнения между мышами.
- Изображение мышей ежедневно до 8-й день после заражения (PI), используя DLIT-μCT, как описано в пунктах 4.1-4.8, для создания продольных визуализации данных, необходимых для установления 4D Moсоперничают инфекции.
Примечание:- На шаге 4.7, мы рекомендуем использование 560-620 нм излучения фильтры для изображений бактериальной биолюминесценции. Хотя пик бактериальной биолюминесценции составляет около 485 нм, в связи с тканью оптика (значительное ослабление синий / зеленый фотонов мышиной ткани), важно использовать оранжевый / красный фотонов для 3D реконструкции, поскольку они облегчают вычисление сигнала глубины .
- "Auto" настройки экспозиции в живой образ 4.3.1 для DLIT должны быть скорректированы для оптимизации количество фотонов в плен и максимальное время визуализации используется для каждого набора фильтров.
- Необходимо только, чтобы выполнить БЛИ предварительной визуализации описано в пункте 4.6, когда исследователь не уверен, если есть детектируемого биолюминесцентного сигнала, например, при использовании новой модели инфекции.
5. 3D-реконструкция DLIT-μCT визуализации данных
- Открытое 4.3.1 Изображение гостиная программного обеспечения и выберите>; Обзор и откройте папку, содержащую DLIT μCT-файлов.
- Откройте DLIT μCT-файл в браузере изображение гостиная, например C. rodentium день 1 PI, нажав Load.
- В палитре инструментов выберите> топографии поверхности> голой мыши, настроить порог, а затем нажмите> Создать поверхность. Если поверхность реконструкция успешна поверхности дерево будет показано в окне 3D вида.
- Для просмотра подготовленного μCT сканирования в 3D окне, скрыть поверхность контура (Нажмите> 3D оптических инструментов и снимите> Поверхность дисплея Object), или уменьшите непрозрачность поверхности (Нажмите> 3D оптических инструментов и переместите ползунок> непрозрачность бар).
- Для обеспечения подробного анатомической локализации реконструкции 3D DLIT необходимо изменить данные 3D объемный (μCT сканирования), так что только скелет мыши видна и что она имеет оптимальный контраст. Нажмите> 3D инструменты Комплексное и выберите> логарифмическая гистограмма, GRadient освещенность, качество и Denoise. Наконец, регулировать гистограммы ползунок вправо и смотреть 3D объемные данные изменения контраста. Хранить настройки данных, пока только кости, четко видны. При желании изменить цвет для передаточной функции точки на гистограмме.
- Затем выберите> DLIT 3D-реконструкции в палитре инструментов и убедитесь, что только 560, 580, 600 и 620 нм наборы фильтров, которые требуются для работы с изображениями бактериальной люциферазы в естественных условиях, которые были выбраны. Нажмите> Старт. Окно предварительного просмотра данных меню появятся показывающие спектрально фильтруется BL сигналы от мыши, который изображался в 2D. Эти сигналы автоматически пороговой с помощью программного обеспечения, но можно регулировать вручную, если это необходимо с помощью вкладок в нижней части меню. Порог определяет минимальную интенсивность данные (представленные в виде процента от максимального сигнала в изображении), которые будут включены в качестве данных в реконструкции.
- Затем выберите> DLIT 3D-реконструкции в палитре инструментов и убедитесь, что оптические свойства, используемые для реконструкции DLIT являются правильными. Выберите> вкладку Свойства и убедитесь, что настройки для свойства ткани установлен в ткани мыши, спектр источника установлен в бактериях.
- Нажмите кнопку>, чтобы выполнить реконструкцию DLIT реконструкции.
- Для создания DLIT μCT 3D-фильма нажмите> Инструменты> 3D-анимации и выберите> стандартных анимационных> КОО Y-оси и> Общая длительность> 10 сек (25 кадров в секунду). Когда настройки в 3D-анимации правильные прессы> Запись и сохранить DLIT-μCT 3D реконструкции как. AVI файлы, помеченные с точки эксперимента, группа и время в отдельной папке.
Примечание:- Это важно при выполнении 3D реконструкций DLIT-μCT данных для использования с PC гостиная 4.3.1 Изображения и пакет услуг 1 установлен и что компьютер имеет видеокарту предназначен для выполнения приложений Multi-метод визуализации программного обеспечения. Thэто программное обеспечение можно загрузить и GPU спецификации содержатся в информации о выпуске ( http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm ).
- Если DLIT-μCT 3D реконструкции появляются назад после сохранения, ваш компьютер работает под управлением старой версии своего графического драйвера, и это может быть исправлено, скачав обновление с сайта производителя.
- В пункте 5 мы представляем наш предпочтительный параметры формирования 3D-DLIT μCT реконструкций. Тем не менее, Есть несколько точек во время 3D реконструкции, где параметры, которые не обсуждаются в этом протоколе может быть изменена. Для полное руководство по 3D реконструкции пользования жилым 4.3.1 Изображение пожалуйста, обратитесь к руководству по эксплуатации завода-изготовителя.
- Важно, чтобы создать 3D реконструкции с использованием идентичных параметров в нескольких метода визуализации инструмент так, чтобы они сопоставимы. В дополнение кэтого, при создании DLIT-μCT 3D реконструкции, важно, чтобы сделать видео с помощью одинакового количества кадров в секунду, а общая продолжительность (длина), в противном случае синхронность видео 4D не является однородным.
6. Генерация 4D кино С. Инфекция rodentium
- Четкая маркировка всех из DLIT-μCT 3D реконструкции с правильным эксперимент, момент времени и группа в легко доступном папку.
- Создайте новый файл в Windows Live Movie Maker, и вставьте DLIT-μCT реконструкций в хронологическом порядке, начиная с 1 дня PI с помощью инструментов вкладки из папки, полученного на стадии 6.1.
- Добавлять заголовки в начале каждого видео, описывающие временную точку, например День 1 ИП, выбрав соответствующую DLIT μCT-видео, а затем выбрав Главная> добавление надписей. Появится текстовое поле на экране, где соответствующие легенды добавляется. Настроить размер шрифта, стиль, цвет, и обоснования как DesIRED используя идентичные вкладки для Microsoft Word в панели инструментов программного обеспечения. Наконец, переместите заголовок к верхнему левому углу видео.
- Повторите шаг 7,3 для всех DLIT μCT-видео.
- Добавить заголовок страницы, например C. rodentium инфекции 1-8 дни, нажав Главная> Title. Появится текстовое поле на экране, где соответствующее название добавляется в пустой слайд. Настроить размер шрифта, стиль, цвет, и обоснования по желанию используя идентичные вкладки для Microsoft Word в панели инструментов программного обеспечения.
- Сохраните проект как проект Movie Maker * ММП в соответствующую папку с названием фильма. Этот шаг не является необходимым, если вы хотите внести изменения в фильм.
- Сохраните фильм. Файл WMV. Откройте меню Movie Maker> Сохранить фильм> для компьютера.
- Преобразовать файл Movie Maker с помощью файла преобразователя. AVI или другой подходящий тип файла совместимые с компьютером.
Примечания:- Рекомендуется 4D фильмысоздаются на ПК с Windows Live Movie Maker, установлен ( http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker ) и хорошая мультимедийная программа, способная играть. или WMV. AVI форматов.
Representative Results
Заражение мышей C57BL/6J с 5 х 10 9 КОЕ C. rodentium хорошо описана модель бактериальной инфекции и приводит к самоограничения желудочно-кишечной инфекции, которая достигает максимума между 6-8 дней после заражения и длится от 3 до 4 недель 2,14. Инфекция ограничена просвета кишечника в мышиной иммунной системы и, как следствие, бактерии постоянно пролить в кале. Колонизация мышей C. rodentium можно контролировать неинвазивно прямым численности бактерий из фекалий или биолюминесценции изображений 2,3.
Эта рукопись описывает оптимизированный протокол для выполнения 3D и 4D изображений комплексном C. rodentium в мышей для контроля бактериальной нагрузки и локализация во время инфекции. Результаты, представленные на рисунке 1 демонстрируют управления, необходимые для успешной визуализации 4D. До заражения мышей важно для сдерживаниямое, что бактериальный посевной используется биолюминесцентными (рис. 1А), и что после перорального введения через зонд мышь с биолюминесцентными C. rodentium, что сигнал можно наблюдать в желудке животного, а не в легких (фиг.1В) 16.
В дополнение к мониторингу бактериальной колонизации использования биолюминесценции изображений, это хорошая практика для количественного числа бактерий в кале; который используется в качестве косвенного измерения Бактериальная колонизация слизистой оболочки ЖКТ На рисунке 2 показаны типичные бактериальной нагрузки в кале взяты из 8 C57BL6 / J. мышей, которые были инфицированы ~ 5 × 10 9 КОЕ ICC180 и контролироваться в течение 8 дней PI Колонизация увеличивается от 2 день PI до 6-7 день, когда инфекция пика при ~ 5 × 10 10 КОЕ / г, которое в соответствии с предыдущими докладами 2,3,17.
Чтобы подчеркнуть важность ОЦЕНКАTing распространения инфекции в одной мыши, рис 1b и 3, а также видео 1 были получены из того же мыши после C. rodentium инфекции, как описано выше. Ежедневно DLIT-μCT был использован для оценки пространственного распределения биолюминесцентного бактерий в этой мыши, используя скелет в анатомическом ссылки. 3 демонстрирует DLIT-μCT реконструкции мыши C57BL/6J инфицированных ICC180 на три ключевых PI временных точках В День 3 PI небольшие очаги биолюминесцентными можно наблюдать в толстой кишке, которые демонстрируют умеренное увеличение интенсивности биолюминесценции днем +5 PI с небольшими изменениями в пространственном распределении. На 7-й день PI мы наблюдали значительное увеличение биолюминесценции и распространение биолюминесцентного очаги по всей толстой кишки.
Видео 1 представляет собой подборку DLIT 3D-реконструкций μCT от 1-8 дней с PI ICC180 и иллюстрирует C.rodentium в проксимальных желудочно-кишечного тракта между 1-2 дней PI, который распространяется в толстую кишку на 3 день PI От дней 4-6 PI количества бактерий в толстой кишке расширяться, пока не достиг пика в день 7 PI где бактериальные очаги охватывает всю толстую кишку. На 8-й день PI только два различных бактериальных очагов присутствуют в проксимальной и дистальной ободочной кишки. Возможность просмотра полной 3D-реконструкции в каждый момент времени в хронологическом порядке представляет собой мощный инструмент для анализа взаимодействий хозяин возбудителя и легче интерпретировать, чем 3D еще одного набора данных.
Рисунок 1. 2D изображений биолюминесценции) Биолюминесцентный C. rodentium ICC180 инокулята и B) мышей после перорального введения через зонд 200 мкл инокулята. Arrowhead (>) иллюстрирует биолюминесцентными C. rodentium EM> в желудке.
Рисунок 2. С. rodentium колонизации динамику. Количественная C. rodentium колониеобразующих единиц из фекалий в течение 8 дней PI
Рисунок 3. Рассеянный свет томографии-μCT сканирования биолюминесцентных C. rodentium инфекции от одной мыши контролируется на 3 дня, 5 и 7 PI Arrowhead (>) иллюстрирует толстой колонизации. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Видео 1.р :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv "целевых =" _blank "> Нажмите здесь для просмотра ролика. 4D фильм инфекции C. rodentium от одной мыши контролироваться с 1-8 дни PI
Discussion
4D кино бактериальной инфекции представляет собой полезный инструмент для визуализации и интерпретации больших объемов многорежимные данные изображения быстро и легко. Эта техника облегчает подробный анализ того, как инфекция распространяется через индивидуальный мыши и может быть использован для исследования как удаление хоста или бактериальные гены или конкретных стратегий вмешательства эффект бактериальной нагрузки, распределения и локализации во время продольного исследования 7. Эти видео также предоставить полезные учебные пособия и средства распространения информации для общественности.
Есть несколько важных шагов в этом протоколе, которые могут повлиять на качество данных, полученных из DLIT-μCT изображений и возможность компилировать видео 4D инфекции. Наиболее важной частью этого протокола является успешным и однородной инфекции мышей с C. rodentium. Важно, что у мышей, используемых для исследования, в возрасте 18-20 г и что бактеририал посевного свежеприготовленный примерно 5 х 10 9 КОЕ, как описано выше 2,3. До инфекции мышей важно, чтобы проверить, что инокулята биолюминесцентного использованием спектра КТ и один раз инокулята было подготовлено, оно должно непрерывно гомогенизировали перед каждой мыши через желудочный зонд для того, чтобы мыши получают аналогичный инфекционных доз. DLIT-μCT изображений мышей были оптимизированы так, чтобы функция автоматической экспозиции в живых программного обеспечения 4.3.1 Изображение автоматически определяет оптимизированные параметры визуализации для сигнала, который будет значительно выше шум. Тем не менее, функция автоматической экспозиции зависит от пользовательских настроек и параметров, которые должны быть изменены, как описано в процедуре. Неспособность сделать это приведет к плохим изображения с более низким числом фотонов собрано, что не приводит к очевидным прогрессирования инфекции, как Спектр КТ заводские настройки автоэкспозиции запрограммированы для работы с изображениями опухоли, экспрессирующиелюциферазы светляков. Реконструкция осуществляется с использованием 560-620 нм дать лучшее согласование между смоделированных и измеренных данных и, следовательно, являются более надежных данных для включения в реконструкции.
Ограничение на использование DLIT-μCT в том, что ионизирующее излучение из проверки μCT вызывает сублетальных радиационных повреждений, что является кумулятивным над продольное исследование 18. Сублетальные радиационное облучение может ослабить иммунную реакцию, вызывают повреждение ДНК и апоптоз во внутренних органах 19. В конечном счете, совокупный сублетальных радиационное повреждение может привести к смерти, если LD 50/30 за ионизирующим излучением превышении которого от 5 до 7 Гр, в зависимости от штамма мыши и возраста мышей, используемых 18,20,21. Хотя некоторые из молекулярных ущерба от ионизирующего излучения может излечить, так как главным принципом является оценить дозу консервативно, это обычно не учитывается в исследовании планирования. Вместо этого, цель состоит в том, чтобы остаться, насколько белой эти пределы, как это возможно, но достижение цели исследования. Это особенно важно в данном исследовании из-за нормального иммунного ответа на инфекцию, частоту изображений, и тот факт, что трансгенные, иммуно-состоят или сильно зараженные животные могут быть более чувствительны к ионизирующей радиации.
При планировании эксперимента, чтобы генерировать 4D кино инфекции, важно рассмотреть длины эксперимента, количество μCT сканирует требуется в течение этого периода и LD 50/30 для ионизирующего излучения для мыши штамма используется. Другим потенциальным ограничением DLIT-μCT является сила экспрессии репортерного в бактериальный штамм используется, как это повлияет на бактериальный пределы обнаружения и обработки изображений раза. Настоятельно рекомендуется, что исследователи используют подтверждены бактериальных штаммов, которые полностью вирулентных, но оптимизированы для максимального выражения Lux оперона, как показали ранее для BLI2,3.
Одно предостережение к текущим дизайном 4D изображений является то, что каждый фильм состоит из отдельных DLIT-μCT сканирований, которые имеют разные фотона масштабирования. Это может сделать изображения трудности в случае изменений в локализации очага BL, или его интенсивность являются тонкими, или, если таковой имеется интенсивное внимание BL окруженный несколькими слабые очаги. Таким образом, при визуализации продольной, важно сохранить цветовых полос последовательно через моменты времени.
Концепция 4D кино инфекции могут быть применены к любому соответствующую маркировку бактериальным патогеном. Дальнейшее развитие этой техники будет направлена на использование флуоресценции томографии (ФЛИТ), а также DLIT чтобы облегчить исследование реакции хозяина к инфекции с использованием комбинации биолюминесцентного бактериальных патогенов и инъекционные флуоресцентный ближнего инфракрасного зондов для исследования реакции хозяина к инфекции. В дополнение к этому, в этом протоколе мы толькоописывают использование биолюминесцентного бактерии для создания 4D кино инфекции. Тем не менее, в некоторых случаях может возникнуть необходимость в использовании меченных флуоресцентными бактерии, например, с меткой IRFP, так что биолюминесценции репортер может быть использован для исследования хост генетики во время инфекции. Важно отметить, что использование нескольких метода визуализации объединения DLIT / Флит-μCT позволит нам неинвазивно исследовать несколько параметров при бактериальной инфекции, которая внесет значительный вклад в сокращение, изысканность, и замены использования животных в научных исследованиях как это предусмотрено в инициативе NC3R (в http://www.nc3rs.org.uk/ ).
Disclosures
Производство и свободный доступ к этой статье проводится при финансовой поддержке PerkinElmer.
Авторы Кевин P, Фрэнсис, Джефф Меганк и Chaincy Куо являются сотрудниками суппорт-компании PerkinElmer.
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с животными научных процедур Закона 1986 года и был утвержден местным советом по этике.
Acknowledgments
В естественных изображений объекта в Имперском колледже была профинансирована MRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
| Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
| Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
| Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
| Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
| Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
| Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
| 50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
| Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
| 1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
| Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
| Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
| IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
| 6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
| XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
| XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
| Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
| Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 | |
|
|||
References
- Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice. J. Vis. Exp. (48), e2547 (2011).
- Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).
- Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6, 963-972 (2004).
- Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract. Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).
- Fanning, S., et al. Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).
- Collins, J. W., et al. Pre-treatment with Bifidobacterium breve UCC2003 modulates Citrobacter rodentium-induced colonic inflammation and organ specificity of infection. Microbiology. , 10-1099 (2012).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995).
- Hardy, J., et al. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303, 851-853 (2004).
- Szittner, R., Meighen, E. Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium. J. Biol. Chem. 265, 16581-16587 (1990).
- Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J. Antimicrob. Chemother. 67, 404-414 (2012).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J. Biomed. Opt. 12, 024007 (2007).
- Cronin, M., et al. High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting. PLoS One. 7, e30940 (2012).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cell Microbiol. 7, 1697-1706 (2005).
- Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Mol. Imaging Biol. 13, 1114-1123 (2011).
- Wiles, S., Crepin, V. F., Childs, G., Frankel, G., Kerton, A. Use of biophotonic imaging as a training aid for administration of substances in laboratory rodents. Lab Anim. 41, 321-328 (2007).
- Crepin, V. F., et al. Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo. Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).
- Willekens, I., et al. Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol. ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).
- Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. Small-animal X-ray dose from micro-CT. Mol Imaging. 3, 149-158 (2004).
- Sato, F., Sasaki, S., Kawashima, N., Chino, F. Late effects of whole or partial body x-irradiation on mice: life shortening. Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 39, 607-615 (1981).
- Kohn, H. I., Kallman, R. F. The influence of strain on acute x-ray lethality in the mouse. II. Recovery rate studies. Radiat. Res. 6, 329-338 (1957).
