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Immunology and Infection

के 4D multimodality इमेजिंग Published: August 13, 2013 doi: 10.3791/50450
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1MRC Centre for Molecular Bacteriology and Infection, Division of Cell & Molecular Biology, Imperial College London, 2Preclinical Imaging, Caliper- A PerkinElmer Company

Summary

बहु - साधन इमेजिंग छोटे पशु मॉडल में बैक्टीरियल उपनिवेशवाद के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण है. इस प्रोटोकॉल bioluminescent साथ चूहों के संक्रमण की रूपरेखा

Abstract

इस प्रोटोकॉल अनुलंबीय संक्रमण चक्र के एक चार आयामी (4D) फिल्म उत्पन्न करने के लिए एकीकृत μCT (DLIT-μCT) के साथ समग्र 3 डी प्रकाश फैलाना इमेजिंग टोमोग्राफी और इस डेटा के बाद के उपयोग का उपयोग कर एक bioluminescent बैक्टीरिया के संक्रमण पर नजर रखने के लिए आवश्यक कदम की रूपरेखा. 4D संक्रमण फिल्मों को विकसित करने के लिए और एक IVIS स्पेक्ट्रम सीटी का उपयोग कर बैक्टीरियल संक्रमण के अध्ययन के लिए DLIT-μCT इमेजिंग मान्य करने के लिए, हम bioluminescent सी. के साथ संक्रमण का इस्तेमाल किया चूहों में खुद को सीमित कोलाइटिस का कारण बनता है जो rodentium,. इस प्रोटोकॉल में, हम bioluminescent सी. के साथ चूहों के संक्रमण की रूपरेखा तैयार rodentium और दैनिक DLIT-μCT इमेजिंग और 8 दिन के लिए मल से बैक्टीरिया शुमार द्वारा उपनिवेशन की गैर इनवेसिव निगरानी.

IVIS स्पेक्ट्रम सीटी का उपयोग एक ही इमेजिंग मंच का उपयोग ऑप्टिकल और μCT स्कैन की सहज सह पंजीकरण की सुविधा. कम खुराक μCT साधन चूहों की इमेजिंग सक्षम बनाता हैसंचयी विकिरण से कलाकृतियों के कारण के बिना 3 डी में bioluminescent बैक्टीरिया foci के विस्तृत संरचनात्मक स्थानीयकरण उपलब्ध कराने के संक्रमण के दौरान कई बार अंक पर बंद हुए. महत्वपूर्ण बात है, संक्रमित चूहों की 4D फिल्मों विवो में बैक्टीरियल बसाना गतिशीलता पर नजर रखने के लिए एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरण प्रदान करते हैं.

Introduction

छोटे पशु मॉडल, विशेष रूप से उन लोगों के उपयोग के चूहों में, नियमित रूप से बैक्टीरियल रोगजनन जांच करने के लिए या इस तरह की एंटीबायोटिक दवाओं, प्रोबायोटिक्स, prebiotics और टीकों 1-7 के रूप में संक्रमण, के लिए हस्तक्षेप रणनीतियों का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जाता है. छोटे जानवर संक्रमण से मुख्य प्रयोगात्मक readouts. रोगज़नक़ लोड, संक्रमण के स्थानिक और लौकिक स्थानीयकरण, और संक्रमित जीव की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में परिवर्तन कर रहे हैं विवो ऑप्टिकल इमेजिंग में संक्रामक रोग अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है और कई निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पत्रकार जीन के उपयोग (luciferase, फ्लोरोसेंट प्रोटीन, बीटा lactamase, आदि) के माध्यम से प्रायोगिक readouts, फ्लोरोसेंट रंजक, नैनोकणों या chemiluminescent जांच एक प्रोटीन, जैविक प्रक्रिया, या सूक्ष्मजीव 6 को निशाना बनाया.

Bioluminescence इमेजिंग (BLI) रोगजनक bacte से, इस तरह के चूहों और चूहों के रूप में छोटे जानवर के औपनिवेशीकरण की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल एक ऑप्टिकल इमेजिंग साधन हैरिया 3,6,8,9. चूहे एक ऐसी Photorhabdus luminescens से लक्स CDABE ओपेरोन के रूप में, luciferase. ये बैक्टीरिया तो vivo इमेजिंग प्रणाली 3,6,9 में स्थित एक सीसीडी का उपयोग कर अपने प्रकाश उत्पादन के माध्यम से पता लगाया जा सकता है व्यक्त पुनः संयोजक बैक्टीरिया से संक्रमित हैं. महत्वपूर्ण बात है, केवल metabolically सक्रिय सूक्ष्म जीवों केवल व्यवहार्य बैक्टीरियल कोशिकाओं को इस पद्धति को 10,11 से पता चला रहे हैं, जिसका अर्थ है bioluminescent (बीएल) हैं. 2 डी BLI, बीएल स्रोत के स्थान का उपयोग संकेत 8 उत्सर्जित होता है जहां जानवर की सतह से inferred है. vivo में बीएल foci के सटीक संरचनात्मक स्थानीयकरण विपरीत अंगों 3,6,9 के पूर्व vivo विश्लेषण के माध्यम से निर्धारित किया गया है, समग्र 3 डी प्रकाश फैलाना इमेजिंग टोमोग्राफी (DLIT) बीएल की एक मात्रात्मक 3D पुनर्निर्माण संकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है स्रोत 12. DLIT लिया बीएल छवियों को इकट्ठा करके किया जाता है परिभाषित संकीर्ण बैंड पास ऑप्टिकल फिल्टर का उपयोग औरबाद में एक फैलाना ऑप्टिकल टोमोग्राफी 3D पुनर्निर्माण एल्गोरिथ्म 1,7,12,13 में उन्हें inputting.

वर्तमान में, बहु - साधन इमेजिंग पूर्व vivo विश्लेषण के लिए आवश्यकता के बिना इन विवो में bioluminescent foci के सच्चे गैर इनवेसिव संरचनात्मक स्थानीयकरण पाने के लिए ही उपलब्ध पद्धति है. हाल ही में, हम DLIT का एक संयोजन एक प्रोबायोटिक जीवाणु 7 के साथ रोगनिरोधी इलाज के बाद Citrobacter rodentium (सी. rodentium) बसाना गतिशीलता का मूल्यांकन करने के μCT इमेजिंग के साथ सह पंजीकृत इस्तेमाल किया. सी. rodentium enteropathogenic और enterhemorrhagic Escherichia कोलाई 14 मॉडल के साथ मानव संक्रमण के लिए इस्तेमाल एक murine विशिष्ट आंतों का रोगज़नक़ है. सी. rodentium संक्रमण आम तौर पर हल्के वजन घटाने, दस्त, ध्रुवीकृत Th1 प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और colonic तहखाना हाइपरप्लासिया सहित और संलग्न विशिष्ट रोग परिवर्तन, और शर्मीला घाव formati के साथ जुड़े कोलाइटिस, का कारण बनता है14. इस, सी. के अलावा rodentium रोगजनन अच्छी तरह से इस जीवाणु बहु - साधन इमेजिंग 3,4,7 के साथ प्रयोग के लिए एक आदर्श मॉडल सूक्ष्मजीव कर रही है, अच्छी तरह से प्रलेखित रहे हैं C57BL/6J चूहों में BLI और उसके बसाना गतिशीलता का उपयोग कर अध्ययन किया गया है.

इस प्रोटोकॉल एक एकल multimodality इमेजिंग मंच, IVIS स्पेक्ट्रम सीटी, और गैर invasively इस संक्रमण का सच गतिशीलता दिखा एक 4D फिल्म की पीढ़ी का उपयोग कर एक जीवाणु संक्रमण का एकीकृत DLIT-μCT इमेजिंग के लिए एक पद्धति की रूपरेखा तैयार करने के लिए पहली बार है.

Protocol

1. चूहे तैयारी

  1. अध्ययन के लिए आवश्यक 18-20 ग्राम C57BL/6J चूहों खरीद या पर्याप्त नस्ल.
  2. चूहों के एक बाहरी आपूर्तिकर्ता से खरीदे जाते हैं, तो सुविधा के लिए परिवहन के बाद पेट microbiota को स्थिर करने autoclaved भोजन और पानी पर 1 हफ्ते के लिए चूहों आदत डालना.
  3. , कान पायदान वजन, और पिंजरे प्रति चूहों की संख्या अलग है.
  4. संक्रमण के लिए पहले दिन, किसी भी संज्ञाहरण प्रदर्शन से पहले, प्रक्रिया की अवधि के लिए पर्याप्त ऑक्सीजन और isoflurane है कि वहाँ की जाँच करें. यदि आवश्यक हो, अधिक isofluorane जोड़ने या ऑक्सीजन सिलेंडर की जगह. इसके बाद, वे अपने पहले प्रयोग के बाद से 50 से अधिक ग्राम अर्जित किया है, संवेदनाहारी मैला ढोने वालों के वजन की जांच उन्हें त्यागने और ताजा मैला ढोने वालों के साथ बदलें.
  5. 7 मिनट के लिए VEET उपयोग कर XGI -8 अनेस्थेसिया प्रणाली और बाल हटाना में 3% isofluorane उपयोग कर चतनाशून्य करना चूहों.
  6. नोट:
    • पूरी तरह से बाल उड़ाना, विशेष रूप में आवश्यक हैफर में मेलेनिन के रूप में काले चूहों काफी bioluminescent संकेत 3,15 attenuates.
    • फर regrow को शुरू होने से पहले चूहों के depilation आमतौर पर 8-10 दिन तक रहता है. रुचि के क्षेत्र इमेजिंग सत्र के लिए नग्न है ताकि जरूरत पड़ने पर लंबी अवधि में 4D multimodality इमेजिंग प्रदर्शन, चूहों बाल हटाना.
    • चूहे एक जैवसुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल 2) नियंत्रण सुविधा में रखे जाते हैं.

2. बैक्टीरियल सेल तैयार

  1. पर्याप्त kanamycin [50 ग्राम मिलीलीटर -1] के साथ पूरक Luria Burtani शोरबा और अगर प्लेट आवश्यक डिग्री सेल्सियस तक 4 में अध्ययन और दुकान के लिए आवश्यक तैयारी.
  2. संक्रमण से पहले दिन सी. के एक cryovial गल rodentium तनाव ICC180 और तुरंत kanamycin [50 ग्राम मिलीलीटर -1] 220 rpm पर रातोंरात और संस्कृति, 37 डिग्री सेल्सियस के साथ पूरक एक cryobead से 15 मिलीलीटर लेग शोरबा जोड़ें मध्यम संदूषण के लिए एक नियंत्रण के रूप में, एक अतिरिक्त तैयारkanamycin [50 ग्राम मिलीलीटर -1] 220 आरपीएम, 37 और संस्कृति डिग्री सेल्सियस के साथ पूरक uninoculated 15 मिलीलीटर लेग शोरबा
  3. अगली सुबह (~ 16 घंटा), बैक्टीरिया विकास की निशानी के रूप में गंदगी के लिए मध्यम नियंत्रण की जाँच करें. नियंत्रण स्पष्ट है, एक बाज़ ट्यूब ICC180 संस्कृति हस्तांतरण और 4000 rpm पर अपकेंद्रित्र. बाद में, पीबीएस में बैक्टीरियल गोली धोने. फिर 1.5 मिलीलीटर पीबीएस (kanamycin के साथ पूरक पौंड का मूल मात्रा के 1/10 वें) में resuspend और बैक्टीरियल inoculum बनाने के लिए मिश्रण अच्छी तरह से.
  4. ICC180 ठीक सुसंस्कृत और छवि पहले से 1 वर्णित के रूप में रहने छवि 4.3.1 जादूगर में BLI और ऑटो सेटिंग का उपयोग IVIS स्पेक्ट्रम सीटी में inoculum, पहले चूहों के संक्रमण को bioluminescent है किया गया है सत्यापित करने के लिए.
    ध्यान दें:
    • तनाव ICC180 जंगली प्रकार सी. के एक bioluminescent व्युत्पन्न है rodentium ICC169 2. यह बैक्टीरियल तनाव एक कश्मीर सहित लक्स CDABE ओपेरोन हैanamycin प्रतिरोध जीन गुणसूत्र 2 में xyle की एक pseudogene में डाला.
    • मानक सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर सभी बैक्टीरिया के संवर्धन के लिए बाहर ले जाने के लिए और यदि आवश्यक हो तो बाँझ उपभोग्य / अभिकर्मकों खरीद या उपयोग करने से पहले आटोक्लेव.
    • 2.4 चरण में, bioluminescence पढ़ने (पी / एस / 2 सेमी / sr) चूहों के संक्रमण से पहले बैक्टीरियल संख्या का अनुमान किया जा सकता है.

3. Bioluminescent सी. के साथ चूहे का संक्रमण rodentium और बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण का आकलन

  1. संक्रमण से पहले, प्रक्रिया की अवधि के लिए पर्याप्त ऑक्सीजन और isoflurane है कि वहाँ की जाँच करें. यदि आवश्यक हो, अधिक isofluorane जोड़ने या ऑक्सीजन सिलेंडर की जगह. इसके बाद, वे अपने पहले प्रयोग के बाद से 50 से अधिक ग्राम अर्जित किया है, संवेदनाहारी मैला ढोने वालों के वजन की जांच उन्हें त्यागने और ताजा मैला ढोने वालों के साथ बदलें.
  2. एक XGI -8 Anaesthe का उपयोग कर 3% isofluorane साथ चतनाशून्य करना चूहोंSIA सिस्टम मानवीय संयम प्रदान करने के लिए.
  3. अच्छी तरह से बैक्टीरियल inoculum मिक्स और सिरिंज में 0.2 मिलीलीटर (लगभग 5 x 10 9 cfu ICC180) आकर्षित.
  4. मजबूती से अपने अंगूठे और तर्जनी के साथ गर्दन के पीछे त्वचा लोभी द्वारा एक समय और कूड़ा उन पर संज्ञाहरण प्रणाली एक से चूहों को निकाल दें.
  5. जीभ पर, और घुटकी नीचे, मुँह की छत की ओर नलिका - पोषण सुई पुश और पेट में बैक्टीरियल inoculum इंजेक्षन.
  6. चूहों के मौखिक नलिका - पोषण के बाद, बैक्टीरियल inoculum के फेफड़ों में वितरित किया गया है कि एक संकेत हो सकता है, जो संकट के संकेत के लिए उनकी चाल और सांस लेने की निगरानी. फेफड़ों में टीका दिया गया है कि किसी भी चूहों euthanize.
  7. एक वाहन पर नियंत्रण के रूप में 200 μl पीबीएस के साथ नलिका - पोषण असंक्रमित चूहों के रूप में कदम 3.1-3.6 में वर्णित है.
  8. मौखिक नलिका - पोषण सही ढंग से प्रदर्शन किया गया था कि पुष्टि करने के लिए, IVIS स्पेक्ट्रम सीटी में छवि संक्रमित और नकली संक्रमित चूहों रहने में BLI और ऑटो सेटिंग का उपयोगछवि 4.3.1 जादूगर के रूप में पहले से 1 का वर्णन किया.
  9. पीबीएस में धारावाहिक कमजोर पड़ने से inoculum में व्यवहार्य जीवाणुओं की संख्या का निर्धारण करें और kanamycin के साथ पूरक अगर लेग पर तीन प्रतियों में खोलना [50 ग्राम मिलीलीटर -1].
  10. वहाँ लगभग 5-50 कालोनियों कर रहे हैं और कहा कि कमजोर पड़ने पर हर जगह से कालोनियों की संख्या गिनती और कालोनियों पर गिना रहे थे कि कमजोर पड़ने रिकॉर्ड जहां एक कमजोर पड़ने खोजने के द्वारा ICC180 CFU / एमएल की संख्या की गणना. बाद में, CFU का मतलब संख्या (तीन स्थानों से) की गणना और कमजोर पड़ने कारक 50 (प्रत्येक स्थान मूल 1 मिलीलीटर नमूने के 20 μl है) और कालोनियों CFU / एमएल दे, पर गिना रहे थे कमजोर पड़ने से इस मूल्य गुणा.
  11. एक पूर्व तौला Eppendorf ट्यूब (एक अच्छा संतुलन पर तौला) में प्रत्येक माउस से मल इकट्ठा करके दैनिक चूहों का औपनिवेशीकरण मॉनिटर और नमूने के वजन (0.1 ग्राम मिलीलीटर -1) पर आधारित पीबीएस में 1/10 पतला.
  12. में व्यवहार्य जीवाणुओं की संख्या का निर्धारणपीबीएस में धारावाहिक कमजोर पड़ने से और अगर लेग पर तीन प्रतियों में खोलना मल kanamycin के साथ पूरक [50 ग्राम मिलीलीटर -1].
  13. कदम 3.9 का पालन करते हुए मल के प्रति ग्राम व्यवहार्य जीवाणुओं की संख्या की गणना करें, तो CFU / छ देने के लिए 0.1 ग्राम मिलीलीटर -1 की पीबीएस में मल कमजोर पड़ने कारक (कदम 3.10) द्वारा CFU / एमएल की संख्या गुणा.
  14. चूहों एक शुद्ध ICC180 संस्कृति के साथ टीका और कहा कि गया है कि निर्धारित करने के लिए कालोनियों के सभी bioluminescent हैं. चरण 3.8 से अगर प्लेट ले लो, आंख से या तो बैक्टीरियल कॉलोनी आकारिकी का आकलन या थाली से एक प्रतिनिधि कॉलोनी लेने और प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण. यदि आवश्यक हो, बैक्टीरियल पहचान संस्कृति पवित्रता का आकलन करने के लिए तनाव विशिष्ट कॉलोनी पीसीआर द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है. बाद में, छवि BLI का उपयोग कर IVIS स्पेक्ट्रम सीटी में प्लेटों के रूप में कदम 3.7 में वर्णित और थाली पर कालोनियों की 100% bioluminescent हैं कि जांच ले.
    नोट:
    • नलिका - पोषण सुई डालने जब कदम 3.4, में, आप यह फेफड़ों में जाने के लिए inoculum का कारण बनता है के रूप में प्रतिरोध, नलिका - पोषण सुई बल नहीं लग रहा है. इसके बजाय, सुई फिर से डालें और धीरे पुन: प्रयास करें.
    • 3.1 चरण वैकल्पिक है और चूहों संज्ञाहरण संस्थानों पशु कल्याण नीति के आधार पर बिना gavaged मौखिक हो सकता है.
    • मल वे एकत्र कर रहे हैं उस दिन बाहर चढ़ाया जाना चाहिए. सी. rodentium 4 पीबीएस में डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर छोड़ दिया और गलत CFU / छ मल की मात्रा का ठहराव के कारण होगा, भले ही बड़ा हो जाएगा.

4. संक्रमित चूहे की μCT इमेजिंग के साथ दैनिक कम्पोजिट 3 डी फैलाना लाइट इमेजिंग टोमोग्राफी (DLIT-μCT)

पशु कल्याण के विचार: DLIT-μCT एक स्थिर जानवर की एक तेजी से, कम विकिरण खुराक μCT स्कैन (एक दो माउस स्कैन के लिए ~ 23 MGY, ~ एक माउस स्कैन के लिए 53 MGY) के साथ एकीकृत DLIT ऑप्टिकल इमेजिंग शामिल है. इस खुराक प्रत्येक इमेजिंग सत्र के साथ जम जाता है, ताकि उद्देश्य खुराक लो के रूप में रखना हैसंभव के रूप में w (और हमेशा अच्छी तरह से एलडी 50/30 से नीचे) अभी भी अध्ययन पूरा करते हुए. चूहों के एक पारंपरिक BLI स्कैन में संक्रमण के कोई संकेत नहीं है तो कुछ मामलों में, μCT स्कैन आगे खुराक कम करने के लिए टाला जा सकता है. विकिरण जोखिम के बारे में कोई चिंता नहीं है अगर खुराक लंबे समय तक अध्ययन में, संभव के रूप में कम के रूप में रखा जाता है, भले ही चूहों हानिकारक लक्षणों का पहला संकेत पर या μCT इमेजिंग अवधि के अंत में मारी गईं किया जाएगा.

  1. इमेजिंग के लिए पहले, IVIS स्पेक्ट्रम सीटी हस्ताक्षर करना और एक्स - रे सुरक्षा इंटरलॉक काम कर रहा है और गर्म चरण इमेजिंग के लिए सही तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) पर है कि कर रहे हैं कि जांच ले. बाद में, संज्ञाहरण प्रणाली और संवेदनाहारी मैला ढोने वालों के वजन में isoflourane के स्तर की जाँच करें. यदि आवश्यक हो, अधिक isofluorane जोड़ने और मैला ढोने वालों को अपने पहले प्रयोग के बाद से 50 से अधिक ग्राम अर्जित किया है, तो उन्हें त्यागने और ताजा मैला ढोने वालों के साथ बदलें.
  2. स्पेक्ट्रम सीटी सेट अप ताकि इमेजिंग मापदंडों कि किलिविंग छवि 4.3.1 में स्वत: जोखिम सुविधा इमेजिंग बैक्टीरियल luciferase के लिए अनुकूलित कर रहे हैं चलाते हैं. संपादित करें> वरीयताएँ> अधिग्रहण और ऑटो एक्सपोजर विंडो. फिर> सीमा मान> एक्स का चयन करें. समय (सेकंड) और> अधिकतम निर्धारित किया है. 300s के लिए. अंत में,> टारगेट गणना (न्यूनतम)> Luminescent चयन और 10,000 गिनती के लिए निर्धारित किया है.
  3. स्पेक्ट्रम सीटी में एक माउस इमेजिंग मंच डालें और साहुल यह संज्ञाहरण में.
  4. एक्स - रे सुरक्षा गूंथ पर स्विच और IVIS को प्रारंभ.
  5. IVIS स्पेक्ट्रम सीटी initialized किया गया है, मानवीय संयम प्रदान करने के लिए एक XGI -8 अनेस्थेसिया प्रणाली का उपयोग कर 3% isofluorane साथ चूहों चतनाशून्य करना.
  6. यह एक DLIT-μCT स्कैन, BLI का उपयोग कर चूहों के रूप में एक माउस इमेजिंग मंच में, पहले से 1 वर्णित पूर्व छवि प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है कि यह निर्धारित करने के लिए. एक मजबूत संकेत प्राप्त होता है, तो माउस DLIT इमेजिंग के लिए उपयुक्त है. एक माउस इमेजिंग platfor में anesthetized माउस छोड़ दोDLIT-μCT लिए BLI स्कैन के बाद तैयार हूँ.
  7. करने के लिए सेट अप DLIT-μCT स्कैन लिविंग छवि सॉफ्टवेयर 4.3.1 में इमेजिंग विज़ार्ड का उपयोग करें. इमेजिंग जादूगर स्वतः FOV, शोर अनुपात करने के लिए सबसे अच्छा संकेत देने के लिए μCT इमेजिंग के लिए DLIT और FOV, जोखिम समय, फिल्टर सेट और binning के लिए जोखिम समय, एफ बंद करो और binning निर्धारित करता है. इमेजिंग जादूगर द्वारा जब संकेत दिया है, केवल 560, 580, 600, और 620 एनएम उत्सर्जन फिल्टर में शामिल हैं और एक माउस μCT स्कैन का चयन करें. तो फिर क्लिक करें> इमेजिंग शुरू करने के लिए मोल.
  8. इमेजिंग के बाद अपने पिंजरे को anesthetized माउस लौटें, स्पेक्ट्रम सीटी से एक माउस इमेजिंग मंच हटाने और 1% त्रिकोणीय जीन का उपयोग कर कीटाणुरहित. यदि आवश्यक हो, माउस चूहों के बीच पार संक्रमण के जोखिम को कम करने पर तैनात है कि फोम पैड की जगह.
  9. ऊपर एक 4D मो बनाने के लिए आवश्यक अनुदैर्ध्य इमेजिंग डेटा उत्पन्न करने के लिए कदम के रूप में 4.1-4.8 में वर्णित DLIT-μCT, का उपयोग करते हुए 8 दिन बाद संक्रमण (पीआई) के लिए दैनिक छवि चूहोंसंक्रमण की होड़.
    ध्यान दें:
    • कदम 4.7 में, हम छवि बैक्टीरियल bioluminescence को 560-620 एनएम उत्सर्जन फिल्टर के उपयोग की सलाह देते हैं. बैक्टीरियल bioluminescence के शिखर ऊतक प्रकाशिकी (murine ऊतकों से नीला / हरी फोटॉनों की महत्वपूर्ण क्षीणन) के कारण 485 एनएम, चारों ओर है, यह वे संकेत गहराई की गणना की सुविधा के रूप में 3 डी पुनर्निर्माण के लिए लाल / नारंगी फोटॉनों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है .
    • DLIT के लिए लिविंग छवि 4.3.1 में 'ऑटो' प्रदर्शन सेटिंग्स पर कब्जा कर लिया फोटॉनों की राशि और एक फिल्टर सेट के लिए इस्तेमाल अधिकतम इमेजिंग समय का अनुकूलन करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है.
    • यह उदाहरण के लिए एक detectable bioluminescent संकेत, अगर वहाँ शोधकर्ता यकीन नहीं है जब एक नए संक्रमण मॉडल का उपयोग करते समय BLI पूर्व इमेजिंग कदम 4.6 में वर्णित प्रदर्शन करने के लिए ही आवश्यक है.

5. DLIT-μCT इमेजिंग डेटा के 3D पुनर्निर्माण

  1. ओपन लिविंग छवि सॉफ्टवेयर 4.3.1 और चुनें>; DLIT-μCT फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर ब्राउज़ करें और खोलें.
  2. उदाहरण सी. के लिए, लिविंग छवि ब्राउज़र में DLIT-μCT फ़ाइल खोलें लोड क्लिक करके rodentium दिन 1 पीआई.
  3. उपकरण पट्टी में चुनिंदा> सतह स्थलाकृति> नंगा माउस, क्लिक करें फिर सीमा समायोजित, और> सतह उत्पन्न करें. सतह पुनर्निर्माण सफल होता है एक सतह रूपरेखा 3 डी दृश्य विंडो में प्रदर्शित किया जाएगा.
  4. 3 डी दृश्य खिड़की में गाया μCT स्कैन देखने के लिए, (> 3 डी ऑप्टिकल उपकरण और अचयनित> प्रदर्शन भूतल वस्तु पर क्लिक करें) सतह रूपरेखा छुपाने के लिए, या (> 3 डी ऑप्टिकल उपकरण क्लिक करें और> अस्पष्टता स्लाइडर पट्टी को समायोजित) सतह अस्पष्टता को कम.
  5. 3 डी DLIT पुनर्निर्माण की विस्तृत संरचनात्मक स्थानीयकरण यह तो केवल माउस के कंकाल दिख रहा है और यह अधिकतम विपरीत है कि 3 डी बड़ा डेटा (μCT स्कैन) को बदलने के लिए आवश्यक है प्रदान करने के लिए. > 3 डी multimodality उपकरण और चुनिंदा> लघुगणक हिस्टोग्राम, जी क्लिक करेंradient रोशनी, गुणवत्ता और Denoise. अंत में, सही करने के लिए हिस्टोग्राम स्लाइडर को समायोजित करने और 3 डी बड़ा डेटा परिवर्तन विपरीत घड़ी. केवल हड्डियों को स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं जब तक डेटा एडजस्ट रखें. अगर वांछित, हिस्टोग्राम पर हस्तांतरण समारोह अंक के लिए रंग बदल जाते हैं.
  6. अगला का चयन करें> DLIT 3 डी उपकरण पट्टी में पुनर्निर्माण और केवल 560, 580, 600, और 620 एनएम vivo में इमेजिंग बैक्टीरियल luciferase के लिए आवश्यक हैं जो फिल्टर सेट, चयनित किया गया है कि यह सुनिश्चित कर लें. क्लिक करें> शुरू करें. डेटा पूर्वावलोकन विंडो मेनू अब 2 डी में उतारी थी कि माउस से प्रेतसंबंधी फ़िल्टर्ड बीएल संकेत दिखा दिखाई देगा. इन संकेतों को स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर द्वारा thresholded कर रहे हैं, लेकिन मेनू के तल पर टैब का उपयोग कर यदि आवश्यक मैन्युअल रूप से समायोजित किया जा सकता है. सीमा पुनर्निर्माण में डेटा के रूप में शामिल किया जाएगा, जो कम से कम डेटा तीव्रता (छवि में अधिकतम संकेत के प्रतिशत के रूप में प्रतिनिधित्व) को निर्धारित करता है.
  7. अगला का चयन करें> डीएल 3 डी उपकरण पट्टी में पुनर्निर्माण और DLIT पुनर्निर्माण के लिए इस्तेमाल ऑप्टिकल गुण सही हैं की जाँच करें. > गुण टैब का चयन करें और ऊतक गुण के लिए सेटिंग्स माउस ऊतक के लिए सेट है, सुनिश्चित करें कि स्रोत स्पेक्ट्रम बैक्टीरिया को तैयार है.
  8. क्लिक करें> DLIT पुनर्निर्माण प्रदर्शन करने के लिए फिर से संगठित.
  9. DLIT-μCT 3 डी फिल्म क्लिक उत्पन्न करने के लिए> उपकरण> 3 डी एनीमेशन और चुनें> पूर्व निर्धारित एनिमेशन> सीसीडब्ल्यू शाफ़्ट और> कुल अवधि> 10 सेकंड (प्रति सेकंड 25 फ्रेम). 3 डी एनीमेशन के लिए सेटिंग्स सही प्रेस> रिकॉर्ड कर रहे हैं और के रूप में DLIT-μCT 3 डी पुनर्निर्माण बचाने के एक बार. एक अलग फ़ोल्डर में प्रयोग, समूह और समय बिंदु के साथ लेबल AVI फ़ाइलें.
    ध्यान दें:
    • लिविंग छवि 4.3.1 और स्थापित सेवा पैकेज 1 के साथ और पीसी मल्टी साधन इमेजिंग सॉफ्टवेयर चलाने के लिए उपयुक्त एक ग्राफिक्स कार्ड है कि एक पीसी का उपयोग करने के लिए DLIT-μCT डेटा के 3D पुनर्निर्माण करते समय यह महत्वपूर्ण है. गुसॉफ्टवेयर डाउनलोड किया जा सकता है, और GPU विनिर्देशों रिलीज नोट्स (में निहित हैं http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm ).
    • DLIT-μCT 3 डी पुनर्निर्माण को बचाया जा रहा है के बाद पीछे की ओर दिखाई देते हैं, तो आपके कंप्यूटर इसके ग्राफिक्स चालक का पुराना संस्करण चल रहा है और यह 'निर्माताओं की वेबसाइट से एक अद्यतन डाउनलोड करने से सुधारा जा सकता है.
    • चरण 5 में, हम 3 डी DLIT-μCT पुनर्निर्माण पैदा करने के लिए हमारे पसंदीदा सेटिंग्स उपस्थित थे. हालांकि, इस प्रोटोकॉल में चर्चा नहीं कर रहे हैं कि मापदंडों को संशोधित किया जा सकता है, जहां 3 डी पुनर्निर्माण के दौरान कई बातें हैं. लिविंग छवि 4.3.1 का प्रयोग करके 3D पुनर्निर्माण के लिए एक व्यापक गाइड के लिए 'निर्माताओं अनुदेश मैनुअल को देखें.
    • यह वे तुलना कर रहे हैं ताकि बहु - साधन इमेजिंग उपकरण में समान सेटिंग्स का उपयोग कर 3 डी पुनर्निर्माण बनाने के लिए महत्वपूर्ण है. के अलावाइस DLIT-μCT 3 डी पुनर्निर्माण बनाते समय, यह दूसरा और कुल अवधि प्रति फ्रेम की एक ही नंबर (लंबाई), अन्यथा 4D वीडियो के समय समरूप नहीं है का उपयोग वीडियो बनाने के लिए महत्वपूर्ण है.

6. सी. के एक 4D मूवी की पीढ़ी rodentium संक्रमण

  1. जाहिर है एक आसानी से सुलभ फ़ोल्डर में सही प्रयोग, समय बिंदु और समूह के साथ DLIT-μCT 3 डी पुनर्निर्माण के सभी लेबल.
  2. विंडोज लाइव मूवी मेकर में एक नई फ़ाइल बनाएँ और कदम 6.1 में तैयार फ़ोल्डर से उपकरण टैब का उपयोग करते हुए दिन 1 पीआई से कालानुक्रमिक क्रम में DLIT-μCT पुनर्निर्माण डालें.
  3. उचित DLIT-μCT वीडियो का चयन और फिर घर का चयन करके उदाहरण के दिन 1 पीआई के लिए, समय बिंदु का वर्णन हर वीडियो की शुरुआत करने के लिए कैप्शन जोड़ें> कैप्शन जोड़ें. एक पाठ बॉक्स उपयुक्त कथा जोड़ा जाता है जहां स्क्रीन पर दिखाई देता है. देस के रूप में फ़ॉन्ट आकार, शैली, रंग, और औचित्य को समायोजित करेंसॉफ्टवेयर उपकरण पट्टी में माइक्रोसॉफ्ट वर्ड के समान टैब का उपयोग ired. अंत में, वीडियो के शीर्ष बाएँ हाथ कोने में शीर्षक चाल.
  4. DLIT-μCT वीडियो सभी के लिए कदम 7.3 दोहराएँ.
  5. एक शीर्षक पृष्ठ जोड़ें, के लिए उदाहरण सी. होम क्लिक करके 1-8 rodentium संक्रमण दिनों> शीर्षक. एक पाठ बॉक्स उपयुक्त शीर्षक एक रिक्त स्लाइड में जोड़ा जाता है जहां स्क्रीन पर दिखाई देता है. फ़ॉन्ट आकार, शैली, रंग, और सॉफ्टवेयर उपकरण पट्टी में माइक्रोसॉफ्ट वर्ड के समान टैब का उपयोग कर के रूप में वांछित औचित्य समायोजित करें.
  6. एक फिल्म निर्माता परियोजना फिल्म के शीर्षक के साथ एक उचित फ़ोल्डर में * एमएमपी के रूप में इस परियोजना को बचाओ. आप फिल्म में संशोधन करना चाहते हैं यह कदम जरूरी है.
  7. एक. Wmv फ़ाइल के रूप में फिल्म को बचाओ. फिल्म निर्माता मेनू पर क्लिक करें> कंप्यूटर के लिए फिल्म> सहेजें.
  8. . AVI या आपके कंप्यूटर के साथ संगत अन्य उपयुक्त फ़ाइल टाइप करने के लिए एक फ़ाइल कनवर्टर का उपयोग कर फिल्म निर्माता फ़ाइल में कनवर्ट करें.
    नोट:
    • यह सिफारिश की है कि 4D फिल्मेंWindows स्थापित लाइव मूवी मेकर के साथ (एक पीसी पर उत्पन्न कर रहे हैं http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker ) और. wmv खेलने में सक्षम एक अच्छा मल्टी मीडिया कार्यक्रम या. AVI फ़ाइलें प्रकार.

Representative Results

5 एक्स 9 10 CFU सी. साथ C57BL/6J चूहों का संक्रमण rodentium एक अच्छी तरह से वर्णित बैक्टीरियल संक्रमण मॉडल और एक खुद को सीमित गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल संक्रमण में परिणाम है कि दिन में 6-8 के बाद संक्रमण के बीच और 3 से 4 सप्ताह 2,14 के बीच रहता चोटियों. संक्रमण murine प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा आंतों लुमेन तक ही सीमित है और एक परिणाम के रूप में, बैक्टीरिया लगातार मल में बहा रहे हैं. सी. द्वारा चूहों के औपनिवेशीकरण rodentium मल, या bioluminescence इमेजिंग 2,3 से सीधे बैक्टीरियल शुमार द्वारा गैर invasively नजर रखी जा सकती है.

यह पांडुलिपि 3 डी और सी के 4D multimodality इमेजिंग प्रदर्शन के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल की रूपरेखा संक्रमण के दौरान जीवाणु लोड और स्थानीयकरण पर नजर रखने के लिए चूहों के भीतर rodentium. चित्रा 1 में प्रस्तुत परिणामों सफल 4D इमेजिंग के लिए आवश्यक हैं कि नियंत्रण प्रदर्शित करता है. पहले चूहों के संक्रमण के लिए यह रोक करने के लिए आवश्यक हैइस्तेमाल किया बैक्टीरियल inoculum bioluminescent (चित्रा 1 ए) है कि मेरा और उस bioluminescent सी. के साथ एक माउस की मौखिक नलिका - पोषण का पालन संकेत जानवर के पेट में नहीं है और फेफड़ों (चित्रा 1 बी) 16 में मनाया जा सकता है कि rodentium,.

Bioluminescence इमेजिंग का उपयोग कर बैक्टीरियल उपनिवेशवाद की निगरानी के अलावा, यह मल में बैक्टीरियल संख्या यों के लिए अच्छा अभ्यास है, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल mucosa के जीवाणु उपनिवेशवाद का एक अप्रत्यक्ष माप के रूप में प्रयोग किया जाता है जो चित्रा 2 C57BL6 / जम्मू, 8 से लिया मल में विशिष्ट जीवाणु लोड दर्शाता है. ~ 5 एक्स 9 10 CFU ICC180 से संक्रमित हैं और दिन में 6-7 तक दिन 2 गड़बड़ी से 8 दिन पीआई औपनिवेशीकरण वृद्धि के लिए नजर रखी गई है कि चूहों जहां ~ 5 में संक्रमण चोटियों 10 x 10 CFU / छ, पिछली रिपोर्टों 2,3,17 के साथ कतार में है.

Evalua के महत्व पर जोरटिंग एक माउस, आंकड़े -1 बी और 3 के साथ ही वीडियो 1 में संक्रमण के प्रसार को सी. पीछा कर एक ही माउस से उत्पन्न किया गया है जैसा कि ऊपर वर्णित rodentium संक्रमण,. दैनिक DLIT-μCT एक संरचनात्मक संदर्भ के रूप में कंकाल का उपयोग कर, यह माउस के भीतर bioluminescent बैक्टीरिया के स्थानिक वितरण का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. चित्रा 3 में 3 महत्वपूर्ण समय अंक गड़बड़ी पर ICC180 से संक्रमित एक C57BL/6J माउस का DLIT-μCT पुनर्निर्माण दर्शाता दिन 3 पीआई छोटे bioluminescent foci के स्थानिक वितरण में थोड़ा परिवर्तन के साथ दिन 5 पीआई द्वारा bioluminescence तीव्रता में एक उदारवादी वृद्धि दिखा रहे हैं, जो पेट में मनाया जा सकता है. दिन 7 पीआई में हम bioluminescence में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई है और पूरे पेट के पार bioluminescent foci के प्रसार को मनाया.

वीडियो 1 ICC180 साथ दिन 1-8 गड़बड़ी से 3 डी DLIT-μCT पुनर्निर्माण का एक संकलन है और सी. दिखाता हैदिन में पेट के लिए दिनों से पेट में 4-6 पीआई बैक्टीरियल संख्या दिन पर बैक्टीरियल foci के पूरे बृहदान्त्र को शामिल किया गया है, जहां 7 पीआई बढ़ता जा तक का विस्तार 3 पीआई फैलता है जो दिन 1-2 पीआई के बीच समीपस्थ जठरांत्र पथ के भीतर rodentium. सुबह 8 पीआई में केवल दो अलग जीवाणु foci के प्रॉक्सिमल और बाहर पेट में मौजूद हैं. कालानुक्रमिक क्रम में हर समय बिंदु पर पूर्ण 3 डी पुनर्निर्माण को देखने की क्षमता मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है और एक ही डाटासेट की अभी भी एक 3 डी से व्याख्या करने के लिए आसान है.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक की 2D bioluminescence इमेजिंग) Bioluminescent सी. inoculum के 200 μl के साथ मौखिक नलिका - पोषण का पालन rodentium ICC180 inoculum और बी) एक माउस. Arrowhead (>) bioluminescent सी. दिखाता है rodentium उन्हें> पेट में.

चित्रा 2

चित्रा 2. सी. rodentium बसाना गतिशीलता. सी की मात्रा rodentium कॉलोनी 8 दिनों पीआई के लिए मल से इकाइयों के गठन

चित्रा 3
चित्रा 3. Bioluminescent सी. के विसरित प्रकाश इमेजिंग टोमोग्राफी-μCT स्कैन दिन 3, 5 और 7 पीआई Arrowhead (>) पर नजर रखी एक माउस से rodentium संक्रमण colonic बसाना दिखाता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

वीडियो 1.पी :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv "लक्ष्य =" _blank "> वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें. एक माउस से सी. rodentium संक्रमण की 4D फिल्म दिनों 1-8 गड़बड़ी से निगरानी

Discussion

बैक्टीरिया के संक्रमण की 4D फिल्म बहु - साधन इमेजिंग डेटा की बड़ी मात्रा में जल्दी और आसानी से कल्पना और व्याख्या करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है. इस तकनीक का एक संक्रमण एक व्यक्ति माउस के माध्यम से फैलता है कैसे की विस्तृत विश्लेषण की सुविधा और जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे मेजबान या बैक्टीरिया के जीन या एक अनुदैर्ध्य अध्ययन 7 के दौरान विशेष रूप से हस्तक्षेप रणनीतियों प्रभाव जीवाणु लोड, वितरण, और स्थानीयकरण का विलोपन. इन वीडियो में भी उपयोगी शिक्षण सहायक सामग्री और जनता के लिए सूचना का प्रसार करने का एक साधन प्रदान करते हैं.

DLIT-μCT इमेजिंग और संक्रमण का एक 4D वीडियो संकलन करने की क्षमता से प्राप्त आंकड़ों की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है कि इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा सी. के साथ चूहों के सफल और समरूप संक्रमण है rodentium. यह अध्ययन के लिए इस्तेमाल चूहों 18-20 ग्राम के बीच है और कर रहे हैं कि जरूरी है कि bacteरियाल inoculums हौसले से तैयार किया है और लगभग 5 x 10 9 CFU, जैसा कि पहले 2,3 वर्णित हैं. पहले चूहों के संक्रमण के लिए यह inoculum स्पेक्ट्रम सीटी का उपयोग करते हुए और एक बार inoculum तैयार किया गया है bioluminescent है कि जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है प्रत्येक माउस चूहों इसी तरह की संक्रामक खुराक प्राप्त सुनिश्चित करना है कि gavaged है, इससे पहले कि यह लगातार homogenized किया जाना चाहिए. चूहों के DLIT-μCT इमेजिंग लिविंग छवि 4.3.1 सॉफ्टवेयर में ऑटो जोखिम समारोह स्वचालित रूप से अच्छी तरह से शोर से ऊपर होने के लिए संकेत के लिए अनुकूलित इमेजिंग मापदंडों का निर्धारण करता है ताकि अनुकूलित किया गया है. हालांकि, ऑटो जोखिम समारोह प्रक्रिया में वर्णित के रूप में परिवर्तित करने की आवश्यकता है जो उपयोगकर्ता परिभाषित सेटिंग्स और मापदंडों पर निर्भर करता है. यह करने में विफलता autoexposure के लिए स्पेक्ट्रम सीटी का कारखाना सेटिंग्स इमेजिंग ट्यूमर व्यक्त करने के लिए प्रोग्राम किया जाता है के रूप में, संक्रमण में एक स्पष्ट प्रगति में परिणाम नहीं है कि एकत्र फोटॉनों की कम संख्या के साथ गरीब छवियों में परिणाम होगाजुगनू luciferase. पुनर्निर्माण 560-620 एनएम इसलिए, पुनर्निर्माण में शामिल करने के लिए और अधिक विश्वसनीय आंकड़े हैं, नकली और मापा डेटा के बीच सबसे अच्छा समझौता देने के लिए और उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया.

DLIT-μCT का उपयोग करने के लिए एक सीमा μCT स्कैन से कि विकिरण एक अनुदैर्ध्य अध्ययन 18 से अधिक संचयी है कि उप घातक विकिरण नुकसान का कारण बनता है. उप घातक विकिरण जोखिम डीएनए की क्षति, और आंतरिक अंगों 19 में apoptosis कारण, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को कमजोर कर सकते हैं. विकिरण के लिए एलडी 50/30 चूहों के माउस तनाव और उम्र के आधार पर 5 से 7 Gy के बीच 18,20,21 प्रयोग किया जाता है, जो आगे बढ़ जाता है तो अंततः, संचयी उप घातक विकिरण क्षति मौत का कारण बन सकता है. व्यापक सिद्धांत परंपरागत खुराक का अनुमान है क्योंकि विकिरण से आणविक नुकसान के कुछ, ठीक कर सकता है, यह आम तौर पर अध्ययन की योजना बनाने के लिए जिम्मेदार नहीं है. इसके बजाय, उद्देश्य अब तक बेल के रूप में रहने के लिए हैसंभव के रूप में ओउ इन सीमाओं को अभी भी अध्ययन के लक्ष्यों को पूरा करते हुए. इस वजह से संक्रमण के लिए सामान्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के इस अध्ययन में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, इमेजिंग, और ट्रांसजेनिक, जानवरों इम्युनो शामिल थे, या भारी संक्रमित तथ्य यह है कि आवृत्ति विकिरण के लिए अतिसंवेदनशील हो सकता है.

संक्रमण के एक 4D फिल्म उत्पन्न करने के लिए प्रयोग की योजना बना रहा है, यह प्रयोग की लंबाई पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है, μCT की संख्या में इस्तेमाल किया जा रहा है माउस तनाव के लिए विकिरण के लिए इस अवधि के दौरान आवश्यक स्कैन और एलडी 50/30. इस बैक्टीरिया का पता लगाने सीमा और इमेजिंग बार प्रभावित करेगा DLIT-μCT के लिए एक और संभावित सीमा, इस्तेमाल किया जा रहा बैक्टीरियल तनाव के भीतर संवाददाता अभिव्यक्ति की शक्ति है. BLI के लिए पहले से प्रदर्शन के रूप में यह अत्यधिक है, शोधकर्ताओं ने पूरी तरह से ज़हरीले हैं कि जीवाणु उपभेदों मान्य उपयोग की सिफारिश की है, लेकिन अधिक से अधिक लक्स ओपेरोन अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित है2,3.

4D इमेजिंग की वर्तमान डिजाइन के लिए एक चेतावनी है कि प्रत्येक फिल्म अलग फोटॉन स्केलिंग है जो व्यक्ति DLIT-μCT स्कैन के शामिल है. बीएल foci के स्थानीयकरण, या इसकी तीव्रता में परिवर्तन सूक्ष्म होते हैं अगर यह व्याख्या करने के लिए छवियों को कठिन बना सकते हैं, या एक से अधिक कमजोर foci से घिरा हुआ एक तीव्र बीएल ध्यान दिया है. इसलिए, अनुदैर्ध्य visualizations के लिए, यह समय अंक भर में रंग सलाखों के अनुरूप रखने के लिए महत्वपूर्ण है.

संक्रमण के एक 4D फिल्म की अवधारणा किसी भी उचित ढंग से लेबल जीवाणु रोगज़नक़ के लिए लागू किया जा सकता है. इस तकनीक के भविष्य के विकास के संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए अवरक्त जांच के निकट फ्लोरोसेंट bioluminescent बैक्टीरियल रोगज़नक़ों और इंजेक्शन के संयोजन का उपयोग संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं की जांच की सुविधा के लिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग टोमोग्राफी (उड़ना) के साथ ही DLIT उपयोग करने के लिए लक्ष्य होगा. इसके अलावा इस के लिए, इस प्रोटोकॉल में हम केवलसंक्रमण की 4D फिल्में बनाने के लिए bioluminescent बैक्टीरिया के उपयोग का वर्णन. हालांकि, कुछ मामलों में यह bioluminescence रिपोर्टर संक्रमण के दौरान मेजबान आनुवंशिकी की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, ताकि iRFP साथ टैग उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट लेबल बैक्टीरिया का उपयोग करने के लिए आवश्यक हो सकता है. महत्वपूर्ण बात है, DLIT / उड़ना-μCT संयोजन बहु - साधन इमेजिंग का उपयोग हमें गैर invasively कमी, शोधन, और वैज्ञानिक अनुसंधान में पशुओं के उपयोग के प्रतिस्थापन के लिए काफी योगदान होगा, जो एक जीवाणु संक्रमण के दौरान कई मापदंडों की जांच करने की अनुमति देगा के रूप में NC3R की पहल (में उल्लिखित http://www.nc3rs.org.uk/ ).

Disclosures

इस लेख के उत्पादन और नि: शुल्क प्रवेश PerkinElmer द्वारा प्रायोजित है.

लेखकों केविन पी, फ्रांसिस, जेफ Meganck और Chaincy कू कैलिपर ए PerkinElmer कंपनी के कर्मचारी हैं.

सभी पशु प्रयोगों पशु वैज्ञानिक प्रक्रियाएं अधिनियम 1986 के अनुसार में प्रदर्शन किया गया और स्थानीय एथिकल समीक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.

Acknowledgments

इंपीरियल कॉलेज में vivo इमेजिंग सुविधा में मलेरिया अनुसंधान केंद्र द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioluminescent C. rodentium Frankel lab ICC180 Wiles et al., 2004
Veet Boots Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well.
Isofluorane (100% v/v) Abbott B506  
Medical Oxygen BOC Medical Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required.
Luria Bertani broth Merck 1.10285.0500 25 g in 1L Demineralised water.
Luria Bertani agar Merck 1.10283.0500 37 g in 1L Demineralised water.
Kanamycin sulphate Sigma (Fluka) 60615  
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes BD (Falcon) 352070  
Universals Corning (Gosselin) E5633-063  
1 ml syringe BD (Plastipak) 300013  
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved Vet Tech DE005  
Microbanks (Cryovial) Pro-Lab Diagnostics PL.170/Y  
IVIS Spectrum CT Caliper- a PerkinElmer Company 133577 Rev A/ Spectrum CT  
6kVA UPS Caliper- a PerkinElmer Company  
XGI-8 anesthesia system Caliper- a PerkinElmer Company 118918  
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal Caliper- a PerkinElmer Company 118999/00  
Living Image v4.3.1 SP1 Caliper- a PerkinElmer Company  
Benchtop shaking incubator New Brunswick Scientific Innova 44  

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References

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के 4D multimodality इमेजिंग<em&gt; Citrobacter rodentium</emचूहे में&gt; संक्रमण
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Collins, J. W., Meganck, J. A., Kuo, C., Francis, K. P., Frankel, G. 4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice. J. Vis. Exp. (78), e50450, doi:10.3791/50450 (2013).

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