Summary
멀티 양상 이미징 작은 동물 모델에서 세균성 식민지 공부를위한 유용한 방법입니다. 이 프로토콜은 생물 발광과 생쥐의 감염을 설명
Abstract
이 프로토콜은 길이 방향 감염 사이클의 네 가지 차원 (4D) 영화를 생성하는 통합 μCT (DLIT-μCT)와 복합 3D 확산 광 영상 단층 촬영 및이 데이터의 연속적인 사용을 사용하여 발광 세균 감염을 모니터링하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 4D 감염 영화를 개발하고 IVIS 스펙트럼 CT를 사용하여 세균 감염 연구를위한 DLIT-μCT 이미징을 검증하기 위해, 우리는 발광 C. 감염에 사용 생쥐의 자기 제한 대장염의 원인 rodentium. 이 프로토콜에서는, 우리는 발광 C.와 생쥐의 감염을 설명 rodentium 일상 DLIT-μCT 이미징 8 일 동안 배설물에서 세균 열거 형으로 식민지의 비 침습 모니터링.
IVIS 스펙트럼 CT의 사용은 하나의 영상 플랫폼을 사용하여 광학 및 μCT 검사의 원활한 공동 등록을 용이하게합니다. 저용량 μCT 양상은 마우스의 이미지를 수누적 방사선 유물을 유발하지 않고 3D에있는 발광 박테리아 병소의 상세한 해부학 적 지역화를 제공 감염 동안 여러 시간 지점에서. 중요한 것은, 감염된 생쥐의 4D 영화는 생체 내에서 세균 식민지 역학을 모니터링 할 수있는 강력한 분석 도구를 제공합니다.
Introduction
작은 동물 모델은 특히 그 활용 생쥐에서 일상적으로 세균 병인을 조사하거나 항생제, 생균제, 프리 바이오 틱스와 백신 1-7로 감염에 대한 개입 전략을 테스트하는 데 사용됩니다. 작은 동물 감염의 주요 실험 판독 값. 병원균 부하 감염의 공간과 시간적 현지화 및 감염 유기체의 면역 반응에 대한 변경됩니다 생체 내 광학 이미징 감염증 연구를위한 유용한 도구입니다 여러 모니터링 할 수 있습니다 리포터 유전자의 사용 (루시 페라 제, 형광 단백질, 베타 - lactamase를, 등)를 통해 실험 판독 값, 형광 염료, 나노 입자 또는 화학 발광 프로브 단백질, 생물 공정, 또는 미생물 6을 대상으로.
생물 발광 영상 (BLI)는 병원성 세균에 의해, 같은 마우스 및 쥐 등 작은 동물의 식민지을 모니터링하는 데 사용되는 광학 이미징 양상이다RIA 3,6,8,9. 마우스는 같은 Photorhabdus luminescens에서 럭스 CDABE 오페론로, 루시퍼.이 박테리아는 그 생체 내 이미징 시스템 3,6,9 기반으로 CCD를 사용하여 빛을 생산을 통해 감지 할 수를 표현 재조합 박테리아에 감염됩니다. 중요한 것은 단지 대사 활성 미생물은 가능한 박테리아 세포는이 방법 10,11으로 감지되는 의미 발광 (BL)입니다. 2D BLI, BL 소스의 위치를 사용하면 신호가 8 방출 동물의 표면에서 유추됩니다. 생체 내에서 BL 병소의 정확한 해부학 적 지역화는 달리 장기 3,6,9의 생체 분석을 통해 결정해야하며, 복합 3D 확산 광 영상 단층 촬영 (DLIT)는 BL의 양적 차원 재구성을 컴파일하는 데 사용할 수 있습니다 소스 12. DLIT이 촬영 BL 이미지를 수집하여 수행되는 정의 협 대역 통과 광 필터를 사용하여이후 확산 광 단층 촬영 3D 재구성 알고리즘 1,7,12,13에 그들을 입력.
현재 멀티 양상 이미징은 생체 분석을위한 필요없이 생체 발광 병소의 진정한 비 침습 해부학 적 지역화를 얻을 수있는 유일한 방법이다. 최근에, 우리는 DLIT의 조합 프로 바이오 틱 박테리아 7 예방 치료를 다음 Citrobacter rodentium (C. rodentium) 식민지 역학을 평가하는 μCT 이미징 공동 등록을 사용 하였다. C. rodentium는 enteropathogenic 및 enterhemorrhagic 대장균 14로 모델 인간의 감염에 사용되는 생쥐 특정 장내 병원균이다. C.는 rodentium 감염은 일반적으로 가벼운 체중 감소, 설사, 편광 살전 면역 반응과 대장 토굴 증식 등과 연결 별개의 병리학 적 변화 및 수축 단계 병변 formati과 관련된 대장염을 일으키는 원인이14. 이, C.에 추가 rodentium의 병인은 철저하게이 박테리아 멀티 모달 영상 3,4,7와 함께 사용하기위한 이상적인 모델 미생물하고 잘 문서화되어 C57BL/6J 마우스에 BLI과 식민지 역학을 사용하여 연구되었다.
이 프로토콜은 하나의 multimodality 이미징 플랫폼 IVIS 스펙트럼 CT, 비 침습적이 감염의 진정한 역학을 보여주는 4D 영화의 생성을 사용하여 세균 감염의 통합 DLIT-μCT 이미징을위한 방법을 설명하는 첫 번째입니다.
Protocol
1. 마우스 준비
- 연구에 필요한 18-20g C57BL/6J 마우스를 구입하거나 충분히 번식.
- 마우스가 외부 공급 업체로부터 구입하는 경우, 시설에 전송 다음, 장내 미생물 안정화를 압력 가마로 소독 한 음식과 물에 1 주 동안 쥐를 길들.
- , 귀 노치를 달아 케이지 당 생쥐의 수를 분리합니다.
- 감염 이전에 하루는 어떤 마취를 수행하기 전에, 절차의 기간 동안 충분한 산소와 isoflurane을가 있는지 확인합니다. 필요한 경우 더 많은 isofluorane을 추가하거나 산소 실린더를 교체하십시오. 그 후, 그들은 처음 사용하기 때문에 이상 50g을 얻은 경우, 마취 청소부의 무게를 확인을 버리고 신선한 청소부로 교체합니다.
- 7 분 VEET를 사용하여 XGI-8 마취 시스템 및 털을 뽑다에서 3 % isofluorane를 사용하여 Anaesthetise 마우스.
- 참고 :
- 철저한 탈모 특히에 필수적이다모피 멜라닌 검은 색으로 마우스는 크게 생물 발광 신호 3,15를 감쇠.
- 모피 재성장을 시작하기 전에 마우스의 탈모는 일반적으로 8-10일 지속. 관심 영역은 영상 세션 누드 있도록 필요한 경우 장기간에 걸쳐 4D의 multimodality 이미징을 수행하려면, 마우스를 뽑다.
- 마우스는 바이오 안전성 수준 2 (BSL-2) 격납 시설에 보관되어 있습니다.
2. 세균 세포의 준비
- 충분히 카나마이신 [50 μg ML -1]로 보충 루리아 Burtani 국물과 한천 플레이트 필요한 ° C까지 4에서 연구 및 저장에 필요한 준비를합니다.
- 감염 전날 C.의 cryovial 해동 rodentium 변형 ICC180 바로는 카나마이신 [50 μg ML -1] 220 rpm에서의 하룻밤과 문화, 37 ° C.로 보충 한 cryobead 15 ML의 LB의 국물을 추가 중간 오염 컨트롤로, 추가를 준비카나마이신 [50 μg ML -1] 220 RPM, 37 문화 ° C.로 보충 uninoculated 15 ML의 LB의 국물
- 다음날 아침 (~ 16 시간)은 박테리아의 성장의 표시로 탁도를위한 매체 제어를 확인합니다. 컨트롤이 명확한 경우에, 팔콘 튜브에 ICC180 문화를 전송하고 4,000 rpm에서 원심 분리기. 그 후, PBS에서 박테리아 펠렛을 씻으십시오. 그런 다음 1.5 ML PBS (카나마이신과 보충 LB의 원래 부피의 1 / 10 일)에 resuspend을하고 세균 접종을 만들 철저히 섞는다.
- ICC180이 제대로 배양 및 이미지 이전 1 설명한대로 생활 이미지 4.3.1 마법사에서 BLI 및 자동 설정을 사용하여 IVIS 스펙트럼 CT에서 접종을하기 전에 생쥐의 감염 발광입니다되었는지 확인합니다.
참고 :- 스트레인 ICC180은 야생형 C.의 발광 유도체 rodentium ICC169 2. 이 균주는 K 등 럭스 CDABE 오페론이있다anamycin 저항 유전자는 염색체 2 xylE의 발현 유전자에 삽입.
- 표준 무균 기술을 사용하여 모든 세균 배양을 실시하고 필요한 경우도 멸균 소모품 / 시약을 구입하거나 사용하기 전에 압력솥.
- 2.4 단계에서 생물 발광 읽기 (P / S / cm 2 / SR)은 생쥐의 감염 이전 세균 수를 추정하는 데 사용할 수 있습니다.
3. 바이오 루미 네 센트 C.를 가진 쥐의 감염 rodentium 및 세균성 식민지의 평가
- 감염 이전 절차의 기간 동안 충분한 산소와 isoflurane을가 있는지 확인합니다. 필요한 경우 더 많은 isofluorane을 추가하거나 산소 실린더를 교체하십시오. 그 후, 그들은 처음 사용하기 때문에 이상 50g을 얻은 경우, 마취 청소부의 무게를 확인을 버리고 신선한 청소부로 교체합니다.
- XGI-8 Anaesthe를 사용하여 3 % isofluorane와 Anaesthetise 마우스SIA는 시스템 인도 구속을 제공합니다.
- 철저하게 세균 접종을 섞어 주사기에 0.2 ML (약 5 × 10 9 CFU ICC180)를 그립니다.
- 단단히 엄지와 집게 손가락으로 목 뒤의 피부를 파악하여 시간과 목덜미 그들에 마취 시스템 하나에서 마우스를 제거합니다.
- 혀를 통해, 그리고 식도의 아래, 입의 지붕으로 투여 바늘을 밀어 위장으로 세균 접종을 주입.
- 쥐의 경구 투여 후, 세균 접종이 폐에 전달되었음을 표시 할 수 있습니다 고통의 흔적에 대한 자신의 걸음 걸이와 호흡을 모니터링 할 수 있습니다. 폐에 주사 된 모든 쥐를 안락사.
- 차량 제어로 200 μL PBS와 함께 투여 감염되지 않은 쥐와 같은 단계 3.1-3.6에서 설명했다.
- 경구 투여가 제대로 수행되었는지 확인하려면, IVIS 스펙트럼 코네티컷에있는 이미지를 감염 및 모의 감염된 마우스는 생활에 BLI 및 자동 설정을 사용하여이미지 4.3.1 마법사는 이전에 1 설명했다.
- PBS 시리얼 희석하여 접종에 가능한 박테리아의 수를 결정하고 카나마이신과 보충 LB 한천에 세중의 안보 【50 μg ML -1].
- 이 약 5-50 식민지은 그 희석 각 지점에서 식민지의 수를 계산하고 식민지에서 계산 된 것을 희석을 기록 희석을 찾아 ICC180 CFU / ㎖의 수를 계산합니다. 그 후, CFU의 평균 수 (세 가지 점에서)을 계산하고 희석 배수 50 (각 자리는 원래 1 ML 샘플 20 μL입니다) 그리고 식민지가 CFU / ㎖을 제공에 계산 된 희석하여이 값을 곱합니다.
- 미리 무게 에펜 도르프 튜브 (좋은 균형 무게)로 각 마우스의 배설물을 수집하여 매일 쥐의 식민지을 모니터링하고 시료의 무게 (0.1 g ML -1)에 따라 PBS에 1 / 10로 희석.
- 에서 실행 가능한 세균의 수를 결정PBS 직렬 희석 및 LB 한천에 세중의에 얼룩이 대변은 카나마이신과 보충 [50 μg ML -1].
- 단계 3.9에 따라 대변의 g 당 생균 수를 계산 한 후 CFU / g을주고 0.1 g ML -1 PBS의 배설물 희석 계수 (단계 3.10)로 CFU / ㎖의 수를 곱합니다.
- 쥐가 순수 ICC180 문화 접종하는되었는지 확인하려면 식민지의 모든 생물 발광합니다. 단계 3.8에서 한천 플레이트를 타고, 눈으로도 세균성 식민지 형태를 평가하거나 판에서 대표적인 식민지를 선택하고 광학 현미경으로 분석합니다. 필요한 경우, 세균의 식별은 문화 순도를 평가하기 위해 긴장 특정 콜로니 PCR을 수행 할 수 있습니다. 그 후, 이미지 BLI를 사용하여 IVIS 스펙트럼 CT의 플레이트는 단계 3.7에서 설명한 접시에 식민지의 100 % 발광되어 있는지 확인합니다.
참고 :- 위관 바늘을 삽입하는 단계 3.4에서당신이이 폐에 갈 접종의 원인으로 저항이, 위관 바늘을 강요하지 않는 경우에는 느끼면. 대신 바늘을 다시 삽입하고 부드럽게 다시 시도하십시오.
- 3.1 단계는 선택 사항이며 마우스는 마취 기관 동물 복지 정책에 의존하지 않고 gavaged 경구 할 수 있습니다.
- 의자는 그들이 수집하는 일을 도금해야합니다. C.는 rodentium 4 PBS에서 ° C 하룻밤에 남아있는 잘못된 것으로 CFU / g 의자의 정량화가 발생할 수도 성장할 것이다.
4. 감염된 쥐의 μCT 이미징 매일 복합 3D 확산 라이트 이미징 단층 촬영 (DLIT-μCT)
동물 복지 고려 사항 : DLIT-μCT은 고정 동물의 고속, 낮은 방사선 선량 μCT 검사 (두 개의 마우스 스캔 ~ 23 MGY ~ 하나의 마우스 스캔 53 MGY)와 통합 DLIT 광학 이미징을 포함한다. 이 용량은 각 이미지 세션과 축적, 그래서 목표는 용량 싸다하게 유지됩니다가능한 W (항상 잘 LD 30분의 50 아래) 계속 연구를 달성하면서. 쥐의 기존 BLI 검사에서 감염의 표시가없는 경우 일부의 경우, μCT 검사가 더 선량을 최소화하기 위해 피할 수 있습니다. 방사선 노출에 대한 우려가있을 경우 용량은 장기간의 연구에서 가능한 한 낮게 유지하더라도, 마우스는 해로운 증상의 첫 징후이나 μCT 이미징 기간의 끝에서 도태 될 것입니다.
- 이전 이미징, IVIS 스펙트럼 CT를 초기화하고 X-선 안전 스위치가 작동하고 가열 단계는 영상의 정확한 온도 (37 ° C)에 있다는 것을 확인합니다. 그 후, 마취 시스템 및 마취 청소부의 무게 isoflourane의 수준을 확인합니다. 필요한 경우 더 많은 isofluorane를 추가하고 청소부 처음 사용하기 때문에 이상 50g을 얻은 경우,이를 삭제하고 신선한 청소부로 교체합니다.
- 스펙트럼 CT를 설정하므로 이미지 매개 변수가이생활 이미지 4.3.1 자동 노출 기능 영상 세균 루시퍼에 최적화 된를 실행합니다. 편집을 선택> 환경 설정> 수집 및 자동 노출 창. 다음> 범위 값> 특급을 선택합니다. 시간 (초)과> 최대로 설정합니다. 300S합니다. 마지막으로,> 대상 수 (최소)> 발광을 선택하고 10,000 카운트 설정합니다.
- 스펙트럼 CT에 하나의 마우스 이미징 플랫폼을 삽입하고 수직 그것을 마취로.
- X-선 안전 인터록 스위치를 켜고 IVIS를 초기화합니다.
- IVIS 스펙트럼 CT가 초기화되면, 인도 구속을 제공하기 위해 XGI-8 마취 시스템을 사용하여 3 % isofluorane와 마우스를 anaesthetise.
- 이 DLIT-μCT 검사, BLI를 사용하여 마우스와 같은 하나의 마우스 이미징 플랫폼 이전 1 설명한 사전 이미지를 수행하는 것이 필요 여부를 결정합니다. 강력한 신호를 얻을 경우 마우스 DLIT 영상에 적합합니다. 하나의 마우스 이미지 platfor에 마취 마우스를 남겨주세요DLIT-μCT에 대한 BLI 스캔 후 준비 됐어.
- 로 설정 - 최대 DLIT - μCT 검사 생활 이미지 소프트웨어 4.3.1 이미지 마법사를 사용합니다. 이미징 마법사가 자동으로 FOV, 잡음 비율 최고의 신호를 제공하기 위해 μCT 이미징을위한 DLIT 및 FOV, 노출 시간, 필터 세트와 비닝 (binning)에 대한 노출 시간, F-정지 및 비닝 (binning)을 결정합니다. 이미징 마법사가 나타나면, 만 560, 580, 600, 및 620 nm의 방출 필터를 포함하고 하나의 마우스 μCT 검사를 선택합니다. 다음을 클릭> 영상을 시작하는 취득.
- 영상 후 그 케이지에 마취 마우스를 반환 스펙트럼 CT에서 하나의 마우스 이미징 플랫폼을 제거하고 1 % 트라이 유전자를 사용하여 소독. 필요한 경우, 마우스가 마우스 간의 교차 오염의 위험을 최소화하기 위해에 배치되어있는 폼 패드를 교체합니다.
- 최대 4D 개월을 만드는 데 필요한 길이 영상 데이터를 생성하는 등의 단계 4.1-4.8에 설명 DLIT-μCT를 사용하여 8 일 게시물 감염 (PI)에 매일 이미지 마우스감염의 경쟁.
참고 :- 단계 4.7에서, 우리는 이미지 세균성 생물 발광에 560-620 nm의 방출 필터의 사용을 추천합니다. 세균의 생물 발광의 피크가 조직 광학 (생쥐 조직에 의해 그린 / 블루 광자의 중요한 감쇠)에 의한 485 nm의 주위에 있지만, 그것은 그들이 신호 깊이의 계산을 용이으로 3D 재구성을위한 레드 / 오렌지 광자를 사용하는 것이 중요합니다 .
- DLIT에 대한 생활 이미지 4.3.1에서 '자동'노출 설정은 캡처 된 광자의 양 및 각 필터 세트에 사용되는 최대 영상 시간을 최적화하기 위해 조정해야합니다.
- 그것은 예를 들어, 감지 발광 신호가있을 경우 연구자가 확실하지 않을 때 새로운 감염 모델을 사용하는 경우 BLI 사전 이미징 단계 4.6에서 설명한 수행하는 경우에만 필요합니다.
5. DLIT-μCT 영상 데이터의 3 차원 재구성
- 오픈 생활 이미지 소프트웨어 4.3.1 선택>; DLIT-μCT 파일이 들어있는 폴더를 찾아 엽니 다.
- 예 C.를 들어, 생활 이미지 브라우저에서 DLIT-μCT 파일을 엽니 다 로드를 클릭하여 rodentium 1 일 PI.
- 도구 팔레트에서 선택> 표면 지형> 누드 마우스로 클릭 한 다음 임계 값을 조정하고,> 표면을 생성합니다. 표면 재건에 성공하면 표면의 윤곽은 3D 뷰 창에 표시됩니다.
- 3D 뷰 창에서 렌더링 μCT 검사를 보려면, (> 3D 광학 도구 및 선택 해제> 디스플레이 표면 개체를 클릭) 표면 윤곽을 숨기거나 (> 3D 광학 도구를 클릭하고> 불투명도 슬라이더 막대를 조정) 표면 불투명도를 줄입니다.
- 3D DLIT 재건의 상세한 해부학 적 지역화 그렇게 만 마우스의 골격이 보이도록하고 최적의 명암을 가지고 3D 체적 데이터 (μCT 검사)를 변경하는 데 필요한을 제공합니다. > 3D Multimodality 도구를 선택> 대수 히스토그램, G를 클릭하십시오radient 조명, 품질 및 노이즈 제거. 마지막으로, 오른쪽으로 히스토그램 슬라이더를 조정하고 3D 체적 데이터 변경 대비를보십시오. 단지 뼈가 명확하게 표시 될 때까지 데이터를 조정하십시오. 원하는 경우, 히스토그램 전송 기능 점수의 색상을 변경합니다.
- 다음을 선택> DLIT 3D 도구 팔레트의 재건 만 560이, 580, 600, 620 nm의 생체 내 이미징 세균의 루시페라아제에 필요한 필터 세트를, 선택되어 있는지 확인합니다. 클릭> 시작합니다. 데이터 미리보기 창 메뉴가 2D로 이미지화 된 마우스에서 스펙트럼 필터링 BL 신호를 보여주는 표시됩니다. 이 신호는 소프트웨어에 의해 자동으로 역치되지만, 메뉴의 하단에있는 탭을 사용하여 필요한 경우 수동으로 조정할 수 있습니다. 임계 값은 재구성의 데이터로 포함 할 최소한의 데이터 강도 (이미지의 최대 신호의 백분율로 표시)을 결정합니다.
- 다음을 선택> DLIT 3D의 도구 팔레트의 재건과 DLIT 재건에 사용되는 광학 특성이 올바른지 확인합니다. > 속성 탭을 선택하고 조직 속성에 대한 설정이 마우스 조직에 설정되어 있는지 확인, 소스 스펙트럼은 박테리아로 설정됩니다.
- 클릭> DLIT 복원을 수행하기 위해 재구성.
- DLIT-μCT 3D 영화 클릭을 발생하기> 도구> 3D 애니메이션을 선택> 프리셋 애니메이션> CCW Y-축> 총 비행 시간> 10 초 (초당 25 프레임). 3D 애니메이션의 설정이 올바른 언론> 기록하고 같이 DLIT-μCT 3D 재구성을 저장하면. 별도의 폴더에 실험 그룹과 시점으로 표시 avi 파일을.
참고 :- 생활 이미지 4.3.1 및 설치 서비스 패키지 1과 PC는 멀티 양상 이미징 소프트웨어를 실행에 적합한 그래픽 카드가 그 PC를 사용하는 DLIT - μCT 데이터의 3 차원 복원을 수행 할 때 중요합니다. 목소프트웨어를 다운로드 할 수 있으며, GPU 사양은 릴리스 노트 (에 포함되어 http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm ).
- DLIT-μCT 3D 재구성이 저장되고 이후에 거꾸로 나타날 경우, 컴퓨터는 그래픽 드라이버의 이전 버전을 실행하고 이것은 제조 업체의 웹 사이트에서 업데이트를 다운로드하여 정류 수 있습니다.
- 5 단계에서, 우리는 3D DLIT-μCT 재구성을 생성하기 위해 우리의 기본 설정을 제시한다. 그러나,이 프로토콜에서 설명되지 않은 매개 변수를 수정할 수있는 3 차원 재구성하는 동안 여러 지점이 있습니다. 생활 이미지 4.3.1을 사용하여 3D 복원에 대한 포괄적 인 가이드를 위해 제조업체의 사용 설명서를 참조하십시오.
- 그것은 그들이 비교할 수 있도록 멀티 양상 이미징 도구에서 동일한 설정을 사용하여 3D 재구성을 만드는 것이 중요합니다. 뿐만 아니라이것은 DLIT-μCT 3D 재구성을 만들 때, 그것은 두 번째 총 시간 당 프레임의 같은 번호 (길이), 그렇지 않으면 4D 영상의 타이밍이 균일하지를 사용하여 동영상을 만드는 것이 중요합니다.
6. C.의 4D 영화의 생성 rodentium 감염
- 분명 쉽게 접근 할 폴더의 정확한 실험 시점과 그룹 DLIT-μCT 3D 재구성의 모든 레이블을 지정합니다.
- 윈도우 라이브 무비 메이커에서 새 파일을 작성하고 단계 6.1에서 제조 한 폴더에서 도구 탭을 사용하여 1 일 PI에서 시간 순서대로 DLIT-μCT 재구성을 삽입합니다.
- 해당 DLIT-μCT 비디오를 선택한 다음 홈을 선택하여 예를 들어 1 일 PI의 경우, 시점을 설명하는 모든 동영상의 시작 부분에 캡션을 추가> 캡션을 추가합니다. 텍스트 상자에 적절한 범례를 추가 화면에 나타납니다. DES 등의 글꼴 크기, 스타일, 색상 및 정당화를 조정소프트웨어 도구 모음에서 Microsoft Word로 동일한 탭을 사용하여 IRED. 마지막으로, 비디오의 왼쪽 상단 모서리에 캡션을 이동합니다.
- DLIT-μCT 동영상의 모든 단계 7.3를 반복합니다.
- 제목 페이지 추가, 예를 들면 C. 홈을 클릭하여 1-8 rodentium 감염 일> 제목입니다. 텍스트 상자에 적절한 제목이 빈 슬라이드에 추가되는 화면에 나타납니다. 글꼴 크기, 스타일, 색상 및 소프트웨어 도구 모음에서 Microsoft Word로 동일한 탭을 사용하여 원하는대로 정당화를 조정합니다.
- 무비 메이커 프로젝트 영화의 제목이 해당 폴더에있는 * MMP로 프로젝트를 저장합니다. 당신이 영화를 수정하려는 경우이 단계는 필수적입니다.
- . WMV 파일로 동영상을 저장할 수 있습니다. 영화 제작자 메뉴를 클릭> 컴퓨터의 영화>를 저장합니다.
- . AVI 또는 컴퓨터와 호환 적합한 다른 파일 형식으로 파일 변환기를 사용하여 무비 메이커 파일을 변환합니다.
참고 :- 그것은 권장되는 4D 영화윈도우 설치 라이브 무비 메이커 (과 PC에서 생성 된 http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker )합니다. WMV를 재생할 수있는 좋은 멀티 미디어 프로그램이나. AVI 파일 형식입니다.
Representative Results
5 × 10 9 CFU C.와 C57BL/6J 마우스의 감염 rodentium 잘 설명 세균 감염 모델과 자기 제한 위장 감염의 결과입니다 일 6-8 후 감염 사이 3~4주 2,14 사이에 지속 봉우리. 감염은 쥐의 면역 시스템에 의해 창자 루멘에 국한되고, 결과적으로, 박테리아는 지속적으로 대변 창고입니다. C.에 의해 생쥐의 식민지 rodentium는 대변, 또는 생물 발광 영상 2,3에서 직접 세균 열거 형으로 비 침습적으로 모니터링 할 수 있습니다.
이 원고는 3D와 C의 4D multimodality 이미징을 수행하기 위해 최적화 된 프로토콜을 설명 감염시 세균 부하 및 현지화를 모니터링하는 생쥐에서 rodentium. 그림 1에 제시된 결과는 성공적 4D 화상 진찰에 필요한 컨트롤을 보여줍니다. 이전 생쥐의 감염에 그것을 결정하는 것이 필수적입니다사용되는 세균 접종은 생물 발광 (그림 1A)입니다 광산 및 그 발광 C.와 쥐의 경구 투여 후 신호가 동물의 뱃속에 아니라 폐 (그림 1B) 16에서 관찰 할 수 rodentium.
생물 발광 영상을 사용하여 세균 집락을 모니터링 이외에, 그것은 대변의 세균 수를 정량화하는 것이 좋습니다이야, 위장 점막의 세균 식민지의 간접 측정으로 사용되는 그림 2 C57BL6 / J 8에서 찍은 대변 일반 세균 부하를 보여줍니다. ~ 5 × 10 9 CFU ICC180에 감염된 하루 6-7까지 일 2 PI에서 팔일 PI의 식민 증가에 대한 모니터링 된 생쥐 곳 ~ 5시에 감염 피크 × 10 10 CFU / g, 이전 보고서 2,3,17과 일치하는 것입니다.
evalua의 중요성을 강조하기 위해팅은 하나의 마우스, 도표 1B 3뿐만 아니라 비디오 1 감염의 확산은 C. 다음과 같은 마우스에서 생성 된 위에서 설명한 바와 같이 rodentium 감염. 매일 DLIT-μCT은 해부학 적 참조로 골격을 사용하여,이 마우스에서 발광 박테리아의 공간 분포를 평가하기 위해 사용되었다. 그림 3에서 3 키 시간 포인트 PI에서 ICC180에 감염 C57BL/6J 마우스의 DLIT-μCT 재건을 보여줍니다 3 일 PI 작은 발광 병소는 공간적 분포에 약간의 변화가 5 일 PI에 의한 생물 발광 강도에서 중간 증가를 전시하는 결장에서 관찰 할 수 있습니다. 7 일 PI에서 우리는 생물 발광이 크게 증가하여 전체 대장에 걸쳐 발광 병소의 확산을 관찰했다.
비디오 1 ICC180와 일 1-8 PI에서 3D DLIT-μCT 복원의 편집과 C.를 보여줍니다하루 결장에 일에서 결장에 4-6 PI 세균 수는 하루에 박테리아 병소가 전체 대장을 포함 7 PI를 정점으로까지 확장 3 PI를 펼쳐 1-2 일 PI 사이의 근위 위장관 내 rodentium. 8 일 PI에만 두 가지 박테리아 병소는 근위부와 원위부 결장에 존재한다. 순서대로 각 시점에서 풀 3D 재구성을 볼 수있는 기능은 호스트 병원체 상호 작용을 분석하는 강력한 도구를 나타내며 동일한 데이터 집합에 여전히 3D보다 쉽게 해석 할 수있다.
그림 1.의 2D 생물 발광 영상) 바이오 루미 네 센트 C. 접종 200 μL와 함께 경구 투여 후 rodentium ICC180 접종 및 B) 마우스. 애로우 헤드 (>) 발광 C.를 보여줍니다 rodentium em>를 위장합니다.
그림 2. C. rodentium 식민지 역학. C.의 정량화 rodentium 식민지는 팔일 PI에 대한 대변에서 단위를 형성
그림 3. 발광 C.의 확산 광 영상 단층 촬영 - μCT 검사 3 일, 5, 7 PI 화살촉 (>)에서 모니터 한 마우스에서 rodentium 감염은 대장 식민지를 보여줍니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
비디오 1.P :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv "대상 ="_blank "는> 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. 한 마우스에서 C. rodentium 감염의 4D 영화는 일 1-8 PI에서 모니터링
Discussion
세균 감염의 4D 영화 멀티 양상 이미징 많은 양의 데이터를 신속하고 쉽게 시각화하고 해석 할 수있는 유용한 도구를 제공합니다. 이 기술은 감염이 개인 마우스 퍼지는 방법에 대한 자세한 분석을 용이하게하고 조사 할 수있는 방법 호스트 또는 세균 유전자 또는 종단 연구 7시 특정 개입 전략의 효과 세균 하중, 배포 및 지역화 삭제. 이 동영상은 유용한 교육 보조 및 일반 대중에게 정보를 전파하는 수단을 제공합니다.
DLIT-μCT 이미징 및 감염의 4D 영상을 컴파일 할 수있는 능력에서 얻은 데이터의 품질에 영향을 미칠 수있는이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 부분은 C.와 생쥐의 성공과 동질 감염 rodentium. 이 연구에 사용 된 생쥐는 18-20그램 사이 그 것을 필수적이다 세균리얼 접종 갓 준비한 약 5 × 10 9 CFU는 앞에서 2,3 설명되어 있습니다. 이전 생쥐의 감염은 접종이 스펙트럼 CT를 사용하여 한 번 접종이 준비되어 발광 있는지 확인하는 것이 중요하다 각 마우스가 마우스 유사한 전염성 복용을받을 수 있도록하기 위해 gavaged되기 전에, 그것은 지속적으로 균질화해야합니다. 생쥐의 DLIT - μCT 영상은 생활 이미지 4.3.1 소프트웨어의 자동 노출 기능이 자동으로 잘 잡음보다 될 수있는 신호 최적화 된 이미지 매개 변수를 결정하도록 최적화되었습니다. 그러나, 자동 노출 기능이 절차에 설명 된대로 수정해야 할 사용자 정의 된 설정과 매개 변수에 의존합니다. 이렇게하지 않으면 자동 노출에 대한 스펙트럼 CT의 초기 설정은 영상 종양 표현하기위한 프로그램이기 때문에, 감염 명백한 진행이 발생하지 않는 수집 광자의 낮은 숫자로 빈약 한 이미지를 얻을 수 있습니다반딧불 루시 페라. 복원은 560-620 nm의 따라서, 재건에 포함 할 더 신뢰할 수있는 데이터가 있으며, 시뮬레이션 및 측정 된 데이터의 최적 계약을주고 사용하여 수행.
DLIT-μCT의 사용 제한은 μCT 검사에서 해당 이온화 방사선이 종단 연구 18 세 이상 누적 치사량의 방사선 손상의 원인이됩니다. 치사량의 방사선 노출은 DNA의 손상 및 내부 장기 19 apoptosis를 유발 면역 반응을 약화 할 수 있습니다. 이온화 방사선에 대한 LD 30분의 50은 생쥐의 마우스 변형과 연령에 따라 5-7 Gy의 사이 18,20,21를 사용하는, 초과하는 경우 궁극적으로, 누적 치사량의 방사선 손상은 사망을 일으킬 수 있습니다. 무엇보다 중요한 원칙은 보수적으로 복용량을 추정하기 때문에 이온화 방사선 분자 손상의 일부는 치유 할 수 있지만, 일반적으로이 연구 계획을 차지하지 않습니다. 대신, 목표는 멀리 벨로 유지하는 것입니다가능한 유동이 제한 여전히 연구 목표를 달성하는 동안. 이 때문에 감염에 대한 정상적인 면역 반응이 연구에서 특히 중요합니다, 이미징, 및 형질 전환 동물을 면역 구성, 또는 심하게 감염된 사실의 주파수는 이온화 방사선에 더 민감 할 수 있습니다.
감염의 4D 영화를 생성하는 실험을 계획 할 때, 그것은 실험의 길이를 고려하는 것이 중요합니다, μCT의 수는 사용중인 마우스의 변형에 대한 전리 방사선이 기간 동안 필요한 검사와 LD 30분의 50. 이 세균 검출 한계 및 이미징 시간에 영향을 미치기 때문에 DLIT-μCT에 또 다른 잠재적 인 제한은, 사용되는 균주에서 기자 식의 힘입니다. BLI 이전에 알 수 있듯이 그것은 매우 연구자가 완전히 악성이다 균주를 검증 사용하는 것이 좋습니다,하지만 최대 럭스 오페론 발현에 최적화되어 있습니다2,3.
4D 영상의 현재 디자인 한 가지주의 할 점은 각각의 영화가 다른 광자 스케일링이 개별 DLIT-μCT 검사로 구성되어 있다는 것입니다. BL 병소의 현지화, 또는 강도의 변화가 미세한 경우이 해석 할 이미지가 어려울 수 있습니다, 또는 여러 약한 병소에 의해 둘러싸인 하나의 강렬한 BL 초점이됩니다. 따라서 경도 시각화를 위해, 그것은 시점에 걸쳐 색 막대가 일관성을 유지하는 것이 중요합니다.
감염의 4D 영화의 개념은 모든 적절한 표시 세균성 병원체에 적용 할 수 있습니다. 이 기술의 향후 발전 감염에 호스트 반응을 조사하는 적외선 프로브에 가까운 형광 발광 박테리아 병원균 주사의 조합을 사용하여 감염에 호스트 반응의 조사를 용이하게하기 위해 형광 이미징 단층 촬영 (FLIT)뿐만 아니라 DLIT를 사용하는 것을 목표로합니다. 또한이 방법이 프로토콜 우리는 단지감염의 4D 영화를 만들 수 발광 박테리아의 사용을 설명합니다. 그러나, 일부 경우에 그것은 생물 발광 기자가 감염 동안 호스트 유전학을 연구에 사용할 수 있도록 iRFP 태그 예를 들어, 형광 라벨 박테리아를 사용하는 것이 필요할 수 있습니다. 중요한 DLIT / FLIT-μCT을 결합 멀티 양상 이미징의 사용은 우리가 비 침습적 감소, 교양, 과학 연구에서 동물의 사용 대체에 크게 기여하는 세균성 감염 동안 여러 매개 변수를 조사 할 수 로 NC3R의 이니셔티브 (에 설명 http://www.nc3rs.org.uk/ ).
Disclosures
이 문서에 대한 생산 및 무료 액세스가 퍼킨 엘머에 의해 후원됩니다.
저자 케빈 P, 프랜시스, 제프 Meganck 및 Chaincy 쿠오 캘리퍼스-A 퍼킨 회사의 직원입니다.
모든 동물 실험은 동물 과학 수속 법 1986에 따라 수행되었고, 지역 윤리 심의위원회에 의해 승인되었습니다.
Acknowledgments
제국 대학 생체 내 이미징 시설에서는 MRC에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
| Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
| Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
| Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
| Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
| Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
| Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
| 50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
| Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
| 1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
| Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
| Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
| IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
| 6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
| XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
| XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
| Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
| Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 | |
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References
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