Summary
Multi-modalitet bildebehandling er en verdifull tilnærming for å studere bakteriell kolonisering i små dyremodeller. Denne protokollen skisserer infeksjon hos mus med selvlysende
Abstract
Denne protokollen beskriver fremgangsmåten som kreves for å lengderetningen overvåke en selvlysende bakteriell infeksjon med kompositt 3D diffust lys bildebehandling tomografi med integrert μCT (DLIT-μCT) og påfølgende bruk av disse dataene til å generere en fire dimensjonale (4D) film av infeksjonen syklus. Å utvikle 4D infeksjon filmer og å validere DLIT-μCT bildebehandling for bakteriell infeksjon studier ved hjelp av en IVIS Spectrum CT, brukte vi infeksjon med selvlysende C. rodentium, noe som fører selvbegrensende kolitt i mus. I denne protokollen, skissere vi smitte av mus med selvlysende C. rodentium og ikke-invasiv monitorering av kolonisering av daglig DLIT-μCT bildebehandling og bakteriell telling fra avføring for 8 dager.
Bruken av IVIS Spectrum CT muliggjør sømløs co-registrering av optiske og μCT skanninger med en enkelt avbildning plattform. Den lave dose μCT modalitet gjør at avbildning av muspå flere tidspunkter i løpet av infeksjon, som gir detaljert anatomisk lokalisering av bioluminescent bakteriell foci i 3D uten å forårsake artefakter fra den kumulative stråling. Viktigst, 4D filmer av infiserte mus gi en kraftig analytisk verktøy for å overvåke bakteriekolonisering dynamikk in vivo.
Introduction
Små dyremodeller, særlig de som benytter mus, blir rutinemessig brukt til å undersøke bakteriell patogenese eller for å teste intervensjon strategier for infeksjoner, for eksempel antibiotika, probiotika, prebiotika og vaksiner 1-7. De viktigste eksperimentelle avlesninger fra små dyr infeksjoner er patogen belastning, romlig og tidsmessig lokalisering av infeksjonen, og endringer i immunrespons av den infiserte organismen. In vivo optisk avbildning er et verdifullt verktøy for smittsomme sykdommer forskning og kan brukes til å overvåke flere eksperimentelle avlesninger gjennom bruk av reporter genene (luciferase, fluorescerende proteiner, beta-laktamase, osv), fluorescerende fargestoffer, nanopartikler eller kjemiluminescente prober rettet mot et protein, biologisk prosess, eller mikroorganismen 6..
Bioluminescence imaging (BLI) er en optisk avbildningsfunksjonalitet brukes til å overvåke kolonisering av små dyr, som mus og rotter, etter sykdomsfremkallende bakteria 3,6,8,9. Mus infiseres med rekombinante bakterier som uttrykker en luciferase, slik som lux operon fra CDABE Photorhabdus luminescens. Disse bakterier kan så detekteres ved deres lette produksjon ved hjelp av et CCD-basert in vivo avbildning system 3,6,9. Viktigere, bare metabolsk aktive mikroorganismer er bioluminescent (BL), noe som betyr bare levedyktige bakterielle celler oppdages av denne metodikken 10,11. Ved hjelp av 2D BLI, plasseringen av BL kilden utledes fra overflaten av dyret hvor signalet avgis 8.. Den nøyaktige anatomiske lokalisering av BL foci in vivo må fastsettes gjennom ex vivo analyse av organer 3,6,9 I kontrast, kan kompositt 3D diffust lys bildebehandling tomografi (DLIT) brukes til å lage en kvantitativ 3D rekonstruksjon av BL kilde 12.. DLIT utføres ved å samle BL bilder tatt ved hjelp av definerte smale band-pass optiske filtre ogderetter å skrive dem inn i en diffus optisk tomografi 3D rekonstruksjon algoritme 1,7,12,13.
For tiden, er multi-modalitet avbildning den eneste metoden som er tilgjengelig for å få ekte ikke-invasiv anatomisk lokalisering av bioluminescent foci in vivo uten behov for ex vivo analyse. Nylig, har vi brukt en kombinasjon av DLIT co-registrert med μCT bildebehandling for å evaluere Citrobacter rodentium (C. rodentium) kolonisering dynamikk etter profylaktisk behandling med probiotiske bakterien 7. C. rodentium er et mus bestemt enteric patogen brukes til å modellere menneskelige infeksjon med enteropatogene og enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. rodentium infeksjon forårsaker kolitt, vanligvis assosiert med mild vekttap, diaré, polarisert Th1 immunforsvar og forskjellige patologiske forandringer, inkludert colonic krypten hyperplasi og feste og effacing lesjon formati14.. I tillegg til dette, C. rodentium patogenesen har blitt grundig studert ved hjelp BLI og dets kolonisering dynamikken i C57BL/6J mus er godt dokumentert, noe som gjør denne bakterien en ideell modell mikroorganisme for bruk med multi-modalitet bildebehandling 3,4,7.
Denne protokollen er den første til å skissere en metodikk for integrert DLIT-μCT avbildning av en bakteriell infeksjon med en enkelt multimodalitet bildebehandling plattform, IVIS Spectrum CT, og generering av en 4D film som viser den sanne dynamikken i denne infeksjonen ikke-invasiv.
Protocol
En. Mus Forberedelse
- Kjøpe eller avle nok 18-20 g C57BL/6J mus som kreves for studien.
- Dersom musene er kjøpt fra en ekstern leverandør, etter transport til anlegget, tilvenne mus for 1 uke på autoklavert mat og vann for å stabilisere tarmen bakterieflora.
- Vei, øre hakk, og skille det nødvendige antall mus per bur.
- Dagen før infeksjon, før du utfører anestesi, sjekke at det er tilstrekkelig oksygen og isofluran for varigheten av prosedyren. Tilsett om nødvendig mer isofluorane eller erstatte oksygen sylinder. Deretter sjekke vekten av de bedøvende åtseletere, hvis de har fått mer enn 50 g siden deres første gangs bruk, kast dem og erstatte med ferske åtseletere.
- Bedøve mus med 3% isofluorane i XGI-8 Anestesi System og fjerne håret ved hjelp av Veet for 7 min.
- Merknader:
- Grundig hårfjerning er viktig, spesielt isvarte mus som melanin i pelsen demper betydelig bioluminescent signal 3,15.
- Hårfjerning av mus varer vanligvis 8-10 dager før pelsen begynner å vokse. For å utføre 4D multimodalitet bildebehandling over lengre perioder, fjerne håret mus når det er nødvendig, slik at området av interesse er naken for imaging økter.
- Mus er plassert i en biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) containment anlegget.
2. Bakteriell celleforberedelsen
- Forbered nok Luria Burtani buljong og agarplater supplert med Kanamycin [50 mg ml -1] kreves for studien og oppbevar ved 4 ° C inntil nødvendig.
- Dagen før infeksjonen tine en cryovial av C. rodentium belastning ICC180 og umiddelbart legge en cryobead til 15 ml LB buljong supplert med Kanamycin [50 mg ml -1] og kultur over natten ved 220 rpm, 37 ° C. Som en kontroll for medium forurensning, utarbeide en ekstrauinokulert 15 ml LB-næringsløsning supplert med Kanamycin [50 ug ml -1] og kulturen ved 220 rpm, 37 ° C.
- Neste morgen (~ 16 timer), sjekk medium kontroll for turbiditet som et tegn på bakterievekst. Hvis kontrollen er klar, overføre ICC180 kultur til en falk rør og sentrifuger ved 4000 rpm. Deretter vaske bakteriell pellet i PBS. Deretter resuspender i 1,5 ml PBS (1/10 av det opprinnelige volum av LB supplementert med kanamycin) og blandes grundig for å skape det bakterielle inokulat.
- For å kontrollere at ICC180 har blitt dyrket riktig og er selvlysende før smitte av musene, bilde podestoffet i IVIS Spectrum CT ved hjelp BLI og auto-innstillingen i levende bilde 4.3.1 veiviseren som beskrevet tidligere en.
Merk:- Strain ICC180 er en selvlysende derivat av villtype C. rodentium ICC169 to. Denne bakteriestammen har lux CDABE operon inkludert en Kanamycin resistens-genet innsatt i et pseudogene av Xyle i kromosomet 2..
- Gjennomføre alle bakteriell dyrkning ved hjelp av standard aseptiske teknikker og om nødvendig enten kjøpe sterile forbruksvarer / reagenser eller autoklaveres før bruk.
- I trinn 2.4, kan bioluminescence teller (p / s / cm 2 / sr) brukes for å estimere kimtall forut for infeksjon i mus.
3. Infeksjon av Mus med Bioluminescent C. rodentium og vurdering av bakteriell Colonization
- Før infeksjon, det kontrolleres at det er tilstrekkelig oksygen og isofluran for varigheten av fremgangsmåten. Tilsett om nødvendig mer isofluorane eller erstatte oksygen sylinder. Deretter sjekke vekten av de bedøvende åtseletere, hvis de har fått mer enn 50 g siden deres første gangs bruk, kast dem og erstatte med ferske åtseletere.
- Bedøve mus med 3% isofluorane ved hjelp av en XGI-8 Anaesthesia System for å gi human tilbakeholdenhet.
- Bland bakterielt inokulum grundig og tegne 0,2 ml (ca. 5 x 10 CFU ICC180 9) inn i sprøyten.
- Fjern mus fra anestesi-systemet en av gangen og scruff dem ved å ta godt tak i huden bak nakken med tommel og pekefinger.
- Skyv gavage nålen mot ganen, over tungen og ned i spiserøret og injisere det bakterielle inokulat i magen.
- Etter oral sonde av musene, overvåke deres gangart og puste for tegn på stress som kan være et tegn på at bakteriell inoculum har blitt levert inn i lungene. Avlive noen mus som er blitt inokulert i lungene.
- Gavage uinfiserte mus med 200 ul PBS som et redskap for kontroll, slik det er beskrevet i trinn 3.1 til 3.6.
- For å bekrefte at oral sonde ble utført riktig, image infiserte og mock infiserte mus i IVIS Spectrum CT ved hjelp BLI og auto-innstillingen i den levendeBilde 4.3.1 veiviseren som beskrevet tidligere en.
- Bestem antallet levedyktige bakterier i inokulatet ved seriell fortynning i PBS og spotting i triplikat på LB-agar supplementert med kanamycin [50 ug ml -1].
- Beregne antall ICC180 cfu / ml ved å finne en fortynning hvor det er ca 5-50 kolonier og telle antall kolonier fra hvert punkt på den fortynning og registrere fortynning at koloniene ble regnet med. Deretter beregner gjennomsnittlig antall cfu (fra de tre stedene) og multiplisere denne verdien med fortynningsfaktoren 50 (hver spot er 20 ul av den opprinnelige 1 ml prøve) og fortynning koloniene ble talt på, og gir cfu / ml.
- Overvåk kolonisering av musene daglig ved å samle avføring fra hver mus i en pre-veide Eppendorf rør (veies på en fin balanse) og fortynn 1/10 i PBS, basert på vekten av prøven (0,1 g ml -1).
- Bestem antallet levedyktige bakterier iavføringen ved seriell fortynning i PBS og spotting i tre eksemplarer på LB agar supplert med Kanamycin [50 mg ml -1].
- Beregn det antall levedyktige bakterier per gram avføring ved å følge trinn 3.9, og deretter multiplisere antallet cfu / ml ved fekal fortynningsfaktor i PBS (trinn 3.10) på 0,1 g ml -1 for å gi cfu / g.
- Å fastslå at mus ble vaksinert med en ren ICC180 kultur og at alle kolonier er selvlysende. Ta agarplater fra trinn 3.8, vurdere bakteriell koloni morfologi enten ved øyet eller velge en representant koloni fra platen og analysere ved lysmikroskopi. Om nødvendig, kan bakteriell identifikasjon utføres ved stammespesifikk koloni PCR for å vurdere kultur renhet. Deretter image platene i IVIS Spectrum CT bruker BLI som beskrevet i trinn 3.7 og sjekk at 100% av koloniene på plate er selvlysende.
Merknader:- I 3.4 trinn, når du setter inn sonde nålHvis du føler at motstanden ikke tvinge sonde nål, da dette fører til at inoculum å gå inn i lungene. I stedet setter inn nål og forsiktig prøve igjen.
- Trinn 3.1 er valgfritt og mus kan være muntlig gavaged uten bedøvelse avhengig av instituttene dyrevelferd politikk.
- Avføring må være belagt ut den dagen de er samlet. C. rodentium vil vokse selv om igjen ved 4 ° C over natten i PBS og vil føre til kvantifisering av cfu / g avføring å være feil.
4. Daglig Composite 3D Diffuse Lys Imaging tomografi med μCT Imaging (DLIT-μCT) av infiserte mus
Dyrevelferd hensyn: DLIT-μCT innebærer DLIT optisk bildebehandling integrert med en rask, lav stråledose μCT scan (~ 23 mGy for en to mus scan, ~ 53 mGy for en enkelt mus scan) av en immobilisert dyr. Denne dosen akkumuleres med hver tenkelig økt, så målet er å holde dosen som low som mulig (og alltid godt under LD 50/30) mens fortsatt utføre undersøkelsen. I noen tilfeller, hvis det ikke er noen tegn på infeksjon i et konvensjonelt BLI skanning til mus, kan det μCT skanning unngås for å minimalisere ytterligere dose. Selv om dosen holdes så lav som mulig, i langvarige studier om det er noen bekymring for stråling, vil mus bli hentet ved første tegn på uheldige symptomer eller ved slutten av μCT bildebehandling perioden.
- Før bildebehandling, initialisere IVIS Spectrum CT og sjekk at X-ray sikkerhetslåser jobber og at det oppvarmede scenen er på riktig temperatur (37 ° C) for bildebehandling. Deretter kontrollerer nivået av anestesi isoflourane i systemet og vekten av narkosen utvaskerne. Tilsett om nødvendig mer isofluorane og hvis de åtseletere har fått mer enn 50 g siden deres første gangs bruk, kast dem og erstatte med ferske åtseletere.
- Sett opp Spectrum CT slik at bildebehandling parametere somkjøre automatisk eksponering funksjonen i levende bilde 4.3.1 er optimalisert for bildebehandling bakteriell luciferase. Velg Rediger> Innstillinger> Kjøp og Auto Exposure Window. Deretter velger du> områdeverdier> Exp. (Sekunder) og still> Max. til 300s. Til slutt velger du> Target Count (minimum)> Selvlysende og satt til 10.000 teller.
- Sett inn en mus bildebehandling plattformen til Spectrum CT og lodde den inn i anestesi.
- Slå på X-ray sikkerhet sperre og initialisere IVIS.
- Når IVIS Spectrum CT er blitt initialisert, bedøve musene med 3% isofluorane bruker en XGI-8 Anestesi System for å gi human tilbakeholdenhet.
- For å avgjøre om det er nødvendig å utføre en DLIT-μCT skanning, pre-image musene bruker BLI som beskrevet tidligere en, i en mus bildebehandling plattform. Hvis en robust signal oppnås musen er egnet for DLIT bildebehandling. La bedøvet mus i én mus bildebehandling platform etter BLI scan klar for DLIT-μCT.
- Bruk Imaging Wizard i den levende bilde-programvare 4.3.1 for å sette opp den DLIT-μCT scan. The Imaging Wizard bestemmer automatisk FOV, eksponeringstid, F-stop og binning for DLIT og FOV, eksponeringstid, filter sett og binning for μCT bildebehandling for å gi best signal til støyforhold. Når du blir bedt av Imaging Wizard, inkluderer bare 560, 580, 600 og 620 nm utslipp filter og velg en mus μCT scan. Klikk deretter> Acquire å starte bildebehandling.
- Returnere bedøvet musen til buret sitt etter bildebehandling, fjerne en mus bildebehandling plattform fra Spectrum CT og desinfisere med 1% Tri-genet. Hvis det er nødvendig, erstatte skumputen at musen er posisjonert for å minimere risikoen for kryss-forurensning mellom mus.
- Bilde mus daglig inntil dag 8 etter infeksjon (PI) ved hjelp DLIT-μCT, som beskrevet i trinn 4.1 til 4.8, for å generere de langsgående bildedata er nødvendig for å lage en mo 4Dvie for infeksjon.
Merk:- I trinn 4.7, anbefaler vi bruk av de 560-620 nm utslipp filtre til bilde bakteriell Bioluminescens. Selv om toppen av bakteriell bioluminescens er rundt 485 nm, på grunn av vev optikk (den betydelig demping av blå / grønn fotoner med murine vev), er det viktig å bruke de oransje / rød fotoner for 3D rekonstruksjoner som de muliggjør beregning av signal dybde .
- 'Auto' eksponering i levende bilde 4.3.1 for DLIT må justeres for å optimalisere mengden av fotoner fanget og maksimal bildebehandling tidsbruk for hvert filter sett.
- Det er bare nødvendig for å utføre den BLI-pre-avbildning som er beskrevet i trinn 4.6 når forskeren ikke er sikker på om det er et påvisbart signal bioluminescent, for eksempel ved bruk av en ny infeksjonsmodell.
5. 3D Rekonstruksjon av DLIT-μCT Imaging data
- Åpen stue Bilde programvare 4.3.1 og velg>; Bla gjennom og åpne mappen som inneholder DLIT-μCT filer.
- Åpne DLIT-μCT fil i den levende Biletutforskaren, for eksempel C. rodentium Dag 1 PI ved å klikke Load.
- I verktøypaletten velger du> Surface Topografi> Nude mus, justere terskelen, og klikk deretter på> Generer Surface. Hvis overflaten gjenoppbygging er vellykket en overflate disposisjon vil bli vist i 3D-visning vinduet.
- Hvis du vil vise gjengitt μCT skanning i 3D-visning vinduet, skjule overflaten disposisjon (Klikk> 3D optiske verktøy og uegennyttig> Display flateobjektet), eller redusere overflaten opacity (Klikk> 3D optiske verktøy og juster> dekkevne bar).
- Å gi detaljert anatomisk lokalisering av 3D DLIT rekonstruksjon er det nødvendig å endre 3D volumetriske data (μCT scan) slik at kun musens skjelettet er synlig og at den har optimal kontrast. Klikk> 3D multimodalitet verktøy og velg> logaritmisk histogram, Gradient Illumination, kvalitet og denoise. Til slutt, justere histogrammet mot høyre og se 3D volumetriske data endring kontrast. Holde justere dataene til bare bein er godt synlig. Om ønskelig, kan du endre farge for overføring funksjon poeng på histogrammet.
- Neste select> DLIT 3D Rekonstruksjon i verktøypaletten og sørge for at bare 560, har 580, 600 og 620 nm filter sett, som er nødvendig for bildebehandling bakteriell luciferase in vivo, er valgt. Klikk> Start. Data Preview Window-menyen vises nå viser spectrally filtrert BL signaler fra mus som ble fotografert i 2D. Disse signalene blir automatisk thresholded av programvaren, men kan justeres manuelt om nødvendig med faner nederst i menyen. Terskelen bestemmer minimums intensitet data (representert som en prosent av det maksimale signalet i bildet) som vil bli inkludert som data i rekonstruksjonen.
- Neste velger du> DLIT 3D Rekonstruksjon i verktøypaletten og sjekk at de optiske egenskapene som brukes til DLIT gjenoppbygging er riktige. Velg> kategorien Egenskaper og kontroller at innstillingene for vevsegenskaper er satt til mus vev, er Source Spectrum satt til bakterier.
- Klikk> Rekonstruer å utføre DLIT gjenoppbygging.
- For å generere DLIT-μCT 3D-film klikk> Verktøy> 3D-animasjon og velg> Preset Animasjoner> CCW Y-aksen og> Total varighet> 10 sek (25 bilder per sekund). Når innstillingene for 3D-animasjon er riktige trykk> Record og lagre DLIT-μCT 3D rekonstruksjoner som. Avi-filer merket med eksperiment, gruppe og tidspunkt i en egen mappe.
Merk:- Det er viktig når du utfører 3D rekonstruksjoner av DLIT-μCT data å bruke en PC med levende bilde 4.3.1 og service pakke en installert, og at PC-en har et grafikkort som passer for å kjøre Multi-modalitet bildebehandlingsprogrammer. Ther programvaren kan lastes ned, og GPU spesifikasjoner finnes i versjonsmerknadene ( http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm ).
- Hvis DLIT-μCT 3D rekonstruksjoner vises bakover etter å ha blitt frelst, er datamaskinen kjører en gammel versjon av sin grafikk driver og dette kan rettes opp ved å laste ned en oppdatering fra produsentens hjemmeside.
- I trinn 5, presenterer vi våre foretrukne innstillinger for å generere 3D DLIT-μCT rekonstruksjoner. Det er imidlertid flere punkter i løpet av 3D rekonstruksjoner hvor parametere som ikke er omtalt i denne protokollen kan endres. For en omfattende guide til 3D rekonstruksjoner ved hjelp av levende bilde 4.3.1 henvises det til produsentenes bruksanvisningen.
- Det er viktig å skape 3D-rekonstruksjoner med identiske innstillinger i multi-modalitet bildebehandling verktøy slik at de er sammenlignbare. Forutendette, når du oppretter DLIT-μCT 3D rekonstruksjoner, er det viktig å gjøre videoer med samme antall bilder per sekund og total varighet (lengde), ellers tidspunktet for 4D video er ikke homogen.
6. Generasjon av en 4D film av C. rodentium Infeksjon
- Tydelig merke alle de DLIT-μCT 3D rekonstruksjoner med riktig eksperiment, tidspunkt og gruppe i en lett tilgjengelig mappe.
- Lag en ny fil i Windows Live Movie Maker og sett DLIT-μCT rekonstruksjoner i kronologisk rekkefølge fra dag en PI med fanen Verktøy fra mappen utarbeidet i trinn 6.1.
- Legge til tekster til starten av hver video som beskriver tidspunkt, for eksempel Dag 1 PI ved å velge riktig DLIT-μCT video og deretter velge Hjem> Legg til tekst. En tekstboks vises på skjermen, der den aktuelle legenden er lagt til. Justere skriftstørrelsen, stil, farge og begrunnelse som desIRED bruke identiske faner til Microsoft Word i programmets verktøylinje. Til slutt, flytter bildeteksten i venstre hjørne av videoen.
- Gjenta trinn 7.3 for alle de DLIT-μCT videoer.
- Legg til en tittel siden, for eksempel C. rodentium infeksjon dager 1-8 ved å klikke Hjem> tittelen. En tekstboks vises på skjermen der den aktuelle tittelen er lagt til et tomt lysbilde. Justere skriftstørrelsen, stil, farge og begrunnelse som ønsket å bruke identiske faner til Microsoft Word i programmets verktøylinje.
- Lagre prosjektet som en film maker prosjekt * MMP i en passende mappe med tittelen på filmen. Dette trinnet er viktig hvis du ønsker å endre filmen.
- Lagre filmen som en. Wmv-fil. Klikk Movie Maker-menyen> Lagre film> for datamaskinen.
- Konvertere movie maker fil ved hjelp av en fil konverter til. Avi eller et annet egnet filtype kompatibel med maskinen din.
Merknader:- Det anbefales at 4D-filmergenereres på en PC med Windows Live Movie Maker installert ( http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker ) og en god multi-media program stand til å spille. wmv eller. avi filtyper.
Representative Results
Infeksjon i C57BL/6J mus med 5 x 10 9 cfu C. rodentium er et godt beskrevet bakteriell infeksjon modell og resulterer i en selv-begrensende gastrointestinal infeksjon at toppene mellom dagene 6-8 etter infeksjon og varer mellom 3 til 4 uker 2,14. Infeksjonen er begrenset til intestinal lumen av det murine immunsystem og som en konsekvens, blir bakterier vil kontinuerlig felle i avføringen. Kolonisering av mus ved C. rodentium kan overvåkes non-invasiv ved direkte bakteriell telling fra avføring, eller Bioluminescens bildebehandling 2,3.
Dette manuskriptet skisserer en optimalisert protokoll for å utføre 3D og 4D multimodalitet avbildning av C. rodentium innenfor mus for å overvåke bakteriell belastning og lokalisering under infeksjonen. Resultatene presentert i Figur 1 viser kontrollene som er nødvendige for vellykket 4D avbildning. Før infeksjon i mus er det viktig å avskrekkemine som det bakterielle inokulat anvendes er bioluminescent (figur 1A), og at etter oral sonde av en mus med bioluminescent C. rodentium, at signalet kan observeres i magen på dyret og ikke i lungene (figur 1B) 16.
I tillegg til å overvåke bakteriell kolonisering ved hjelp av bioluminescens avbildning, er det god praksis å kvantifisere kimtall i avføring, som anvendes som en indirekte måling av bakterievekst på tarmslimhinnens Figur 2 viser den typiske bakteriemengden i feces tatt fra 8 C57BL6 / J. mus som har blitt infisert med ~ 5 x 10 9 cfu ICC180 og overvåkes for 8 dager PI Colonization øker fra dag 2 PI inntil dag 6-7 hvor infeksjonen topper på ~ 5 x 10 10 cfu / g, som er i tråd med tidligere rapporter 2,3,17.
For å understreke viktigheten av evalueringting spredning av smitte i en enkelt mus, Tall 1b og 3 samt Video 1 har blitt generert fra samme mus følger C. rodentium infeksjon, som beskrevet ovenfor. Daglig DLIT-μCT ble brukt til å evaluere den romlige fordelingen av selvlysende bakterier innen denne musen, ved hjelp av skjelettet som en anatomisk referanse. Figur 3 viser DLIT-μCT rekonstruksjon av en C57BL/6J mus infisert med ICC180 på 3-tasten tid poeng PI På dag 3 PI liten bioluminescent foci kan observeres i tykktarmen, som viser en moderat økning i Bioluminescens intensitet etter dag fem PI med liten endring i romlig fordeling. På dag 7 PI vi observert en betydelig økning i bioluminescens og bioluminescent foci fordeling i hele tykktarmen.
Video 1 er en samling av 3D DLIT-μCT rekonstruksjoner fra dager 1-8 PI med ICC180 og illustrerer C.rodentium innenfor den proksimale mage-tarmkanalen mellom dager 1-2 PI som sprer seg til kolon på dag 3 PI Fra dager 4-6 PI de bakterielle tall i tykktarmen utvide til en topp på dag 7 PI der den bakterielle foci dekker hele tykktarmen. Etter 8 dager PI bare to distinkte bakterielle foci er til stede i den proksimale og distale colon. Muligheten til å vise full 3D rekonstruksjon på hvert tidspunkt i kronologisk rekkefølge representerer et kraftig verktøy for å analysere vert patogen interaksjoner og er lettere å tolke enn en 3D fortsatt av samme datasett.
Figur 1. 2D Bioluminescens avbildning av A) Bioluminescent C. rodentium ICC180 inoculum og B) en mus etter oral sonde med 200 ul av podestoffet. Arrowhead (>) illustrerer bioluminescent C. rodentium em> i magen.
Figur 2. C. rodentium kolonisering dynamikk. kvantifisering av C. rodentium koloni dannende enheter fra avføring for 8 dager PI
Figur 3. Diffust lys bildebehandling tomografi-μCT skanning av bioluminescent C. rodentium smitte fra én mus overvåkes på 3 dag, 5 og 7 PI Arrowhead (>) illustrerer colonic kolonisering. Klikk her for å se større figur .
Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv "target =" _blank "> Klikk her for å se video. 4D-film av C. rodentium smitte fra én mus overvåkes fra dager 1-8 PI
Discussion
4 D filmen av bakteriell infeksjon gir et nyttig verktøy for å visualisere og tolke store mengder multi-modalitet imaging data raskt og enkelt. Denne teknikk muliggjør en detaljert analyse av hvordan en infeksjon spres gjennom en individuell mus, og kan brukes til å undersøke hvordan delesjon av verten eller bakterielle gener eller særlig intervensjonsstrategiene virkning bakteriemengde, fordeling og lokalisering i løpet av studien 7.. Disse videoene også gi nyttige læremidler og et middel for å spre informasjon til publikum.
Det er flere viktige skritt i denne protokoll som kan påvirke kvaliteten på data innhentet fra DLIT-μCT bildebehandling og evnen til å lage en 4D video av infeksjon. Den viktigste delen av denne protokollen er vellykket og homogen infeksjon i mus med C. rodentium. Det er vesentlig at musene brukte for studien er mellom 18-20 g, og at den bakterial Inokulant tilberedes og ca 5 x 10 9 cfu, som beskrevet tidligere 2,3. Før infeksjon i mus er det viktig å sjekke at inokulatet er bioluminescent hjelp av Spectrum CT og en gang inokulatet er blitt fremstilt, må den stadig homogeniseres før hver mus blir gavaged å sikre at musene mottar tilsvarende infeksiøse doser. Den DLIT-μCT avbildning av mus har blitt optimalisert slik at den automatiske eksponeringen funksjon i levende bilde 4.3.1 programvaren automatisk bestemmer de optimaliserte bildebehandling parametere for at signalet skal være godt over støy. Men stoler auto eksponering funksjonen på brukerdefinerte innstillinger og parametere som må endres som beskrevet i prosedyren. Unnlatelse av å gjøre dette vil resultere i dårlige bilder med et lavt antall fotoner samlet som ikke resulterer i en tydelig progresjon i infeksjonen, som Spectrum CT fabrikkinnstillinger for autoexposure er programmert for avbildning svulster uttrykkerFirefly luciferase. Rekonstruksjoner utført med 560-620 nm gir den beste avtalen mellom simulerte og målte data, og derfor er de mer pålitelige data for å inkludere i gjenoppbyggingen.
En begrensning i bruken av DLIT-μCT er at ioniserende stråling fra μCT skanning forårsaker subletale skader stråling som er akkumulert over en longitudinell 18.. Subletale stråling kan svekke immunforsvaret, føre til DNA-skader, og apoptose i indre organer 19. I siste instans kan kumulative subletale stråling skader forårsake død hvis LD 50/30 for ioniserende stråling er overskredet, som er mellom 5 til 7 Gy avhengig av mus belastning og alder av musene brukt 18,20,21. Selv om noen av molekylære skader fra ioniserende stråling kan helbrede, siden det overordnede prinsippet er å estimere dose konservativt, er dette vanligvis ikke redegjort for i studien planlegging. I stedet er målet å bo så langt below disse grensene som mulig samtidig å utføre studien mål. Dette er spesielt viktig i denne studien på grunn av den normale immunrespons på infeksjon, kan frekvensen av avbildning, og det faktum at transgene, immuno-består, eller sterkt infisert dyr være mer utsatt for ioniserende stråling.
Ved planlegging av eksperimentet for å generere en 4D-film av infeksjon, er det viktig å vurdere lengden av forsøket, skanner antall μCT nødvendig i løpet av denne perioden og LD 50/30 for ioniserende stråling for mus belastning som brukes. En annen potensiell begrensning til DLIT-μCT er styrken av reporteren uttrykk innenfor den bakteriestamme som benyttes, da dette vil påvirke bakterielle deteksjonsgrensene og tenkelig ganger. Det anbefales sterkt at forskerne bruke godkjente bakteriestammer som er fullt virulente, men optimalisert for maksimal lux operon uttrykk, som demonstrert tidligere for BLI2,3.
En påminnelse til dagens design av 4D bildebehandling er at hver film består av individuelle DLIT-μCT skanner som har forskjellige foton skalering. Dette kan gjøre bildene vanskelig å tolke om endringer i lokalisering av BL foci, eller intensiteten er subtile, eller hvis det er en intens BL fokus omgitt av flere svake fokus. Derfor, for langsgående visualiseringer, er det viktig å holde fargefeltene konsekvent på tvers av tidspunkter.
Konseptet med en 4D-film på infeksjon kan brukes på alle passende merket bakteriell patogen. Fremtidige utviklingen av denne teknikken vil ta sikte på å bruke fluorescens bildebehandling tomografi (smette) samt DLIT å lette etterforskningen av verten respons på infeksjon ved hjelp av en kombinasjon av selvlysende bakterier og injiserbare fluorescerende nær infrarøde følere for å undersøke vert respons på infeksjon. I tillegg til dette, i denne protokollen vi barebeskriver anvendelse av bioluminiserende bakterier for å skape 4D filmer av infeksjon. Men i noen tilfeller kan det være nødvendig å bruke fluorescens-merkede bakterier, for eksempel merket med IRFP, slik at bioluminescence reporter kan brukes for å undersøke genetikk vert under infeksjonen. Viktigere, vil bruk av multi-modalitet bildebehandling kombinere DLIT / smette-μCT tillate oss å non-invasiv undersøke flere parametere i løpet av en bakteriell infeksjon, noe som vil bidra betydelig til reduksjon, raffinement, og utskifting av bruk av dyr i forskning som skissert i NC3R initiativ ( http://www.nc3rs.org.uk/ ).
Disclosures
Produksjon og Fri tilgang til denne artikkelen er sponset av PerkinElmer.
Forfatterne Kevin P, Francis, Jeff MEGANCK og Chaincy Kuo er ansatte i Caliper-A PerkinElmer Company.
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med Animals vitenskapelige prosedyrer Act 1986 og ble godkjent av den lokale Ethical Review Committee.
Acknowledgments
In vivo avbildning anlegget ved Imperial College ble finansiert av MRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
| Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
| Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
| Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
| Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
| Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
| Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
| 50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
| Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
| 1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
| Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
| Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
| IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
| 6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
| XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
| XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
| Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
| Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 | |
|
|||
References
- Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice. J. Vis. Exp. (48), e2547 (2011).
- Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).
- Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6, 963-972 (2004).
- Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract. Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).
- Fanning, S., et al. Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).
- Collins, J. W., et al. Pre-treatment with Bifidobacterium breve UCC2003 modulates Citrobacter rodentium-induced colonic inflammation and organ specificity of infection. Microbiology. , 10-1099 (2012).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995).
- Hardy, J., et al. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303, 851-853 (2004).
- Szittner, R., Meighen, E. Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium. J. Biol. Chem. 265, 16581-16587 (1990).
- Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J. Antimicrob. Chemother. 67, 404-414 (2012).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J. Biomed. Opt. 12, 024007 (2007).
- Cronin, M., et al. High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting. PLoS One. 7, e30940 (2012).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cell Microbiol. 7, 1697-1706 (2005).
- Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Mol. Imaging Biol. 13, 1114-1123 (2011).
- Wiles, S., Crepin, V. F., Childs, G., Frankel, G., Kerton, A. Use of biophotonic imaging as a training aid for administration of substances in laboratory rodents. Lab Anim. 41, 321-328 (2007).
- Crepin, V. F., et al. Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo. Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).
- Willekens, I., et al. Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol. ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).
- Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. Small-animal X-ray dose from micro-CT. Mol Imaging. 3, 149-158 (2004).
- Sato, F., Sasaki, S., Kawashima, N., Chino, F. Late effects of whole or partial body x-irradiation on mice: life shortening. Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 39, 607-615 (1981).
- Kohn, H. I., Kallman, R. F. The influence of strain on acute x-ray lethality in the mouse. II. Recovery rate studies. Radiat. Res. 6, 329-338 (1957).
