Summary
Çok yöntemi görüntüleme küçük hayvan modellerinde bakteri kolonizasyonu eğitim için değerli bir yaklaşımdır. Bu protokol bioluminescent ile farelerin enfeksiyonu özetliyor
Abstract
Bu protokol boyuna enfeksiyon döngüsünün dört boyutlu (4D) film oluşturmak için entegre μCT (DLIT-μCT) ile kompozit 3D dağınık ışık görüntüleme tomografi ve bu verilerin sonraki kullanım kullanarak biyolüminesens bakteriyel enfeksiyon izlemek için gereken adımları açıklar. 4D enfeksiyon film geliştirmek ve bir IVIS Spectrum CT kullanarak bakteriyel enfeksiyon çalışmaları için DLIT-μCT görüntüleme doğrulamak için, biz bioluminescent C ile enfeksiyon kullanılan Farelerde kendini sınırlayan kolit neden rodentium. Bu protokol, biyolüminesans C ile farelerin enfeksiyon anahat rodentium ve günlük DLIT-μCT görüntüleme ve 8 gün boyunca dışkı bakteriyel numaralandırma tarafından kolonizasyon non-invazif izleme.
IVIS Spectrum BT kullanımı tek bir görüntüleme platformu kullanarak optik ve μCT taramaları kesintisiz ortak kayıt kolaylaştırır. Düşük doz μCT yöntemi farelerin görüntüleme sağlarkümülatif radyasyon eserler neden olmadan 3 boyutlu olarak bioluminescent bakteri odaklarının ayrıntılı anatomik lokalizasyonu sağlayan enfeksiyon sırasında birden fazla zaman noktalarında. Önemlisi, enfekte farelerin 4D film in vivo bakteriyel kolonizasyon dinamikleri izlemek için güçlü bir analitik araç sağlar.
Introduction
Küçük hayvan modellerinde, özellikle bu kullanarak farelerde, rutin bakteriyel patogenezi araştırılması veya antibiyotikler, probiyotikler, prebiyotikler ve aşılar 1-7 gibi enfeksiyonlar, için müdahale stratejileri test etmek için kullanılır. Küçük hayvan enfeksiyonlarından ana deneysel okuma. Patojen yük, enfeksiyon mekansal ve zamansal lokalizasyonu ve enfekte organizmanın immün yanıt değişiklikler in vivo optik görüntülemede bulaşıcı hastalık araştırmaları için değerli bir araçtır ve birden fazla izlemek için kullanılabilir haberci genlerin kullanımı (lusiferaz, floresan proteinler, beta-laktamaz, vb) aracılığı ile deneysel okuma, floresan boyalar, nanopartiküller ya da kemiluminesan probları, bir protein, biyolojik bir süreci veya mikroorganizma 6'ya hedeflemiştir.
Biyoparlaklık görüntüleme (BLI) patojenik bakterileri tarafından, örneğin, fare ve sıçan gibi küçük hayvanlar, bir kolonizasyon izlemek için kullanılan optik bir görüntüleme yöntemidirria 3,6,8,9. Fareler böyle Photorhabdus luminescens lüks CDABE operonunun olarak, lusiferaz. Bu bakteriler daha sonra in vivo görüntüleme sistemi 3,6,9 merkezli bir CCD kullanarak hafif üretim yoluyla tespit edilebilir ifade rekombinant bakteri bulaşmış. Önemlisi, sadece metabolik olarak aktif mikro-organizmaların tek uygun bakteri hücrelerinin bu yöntem 10,11 ile tespit edilir, yani biyolüminesens (BL) bulunmaktadır. 2B, BLI BL kaynağının konumunu kullanarak sinyali 8 yayılan hayvanın yüzey anlaşılmaktadır. In vivo BL odaklar kesin anatomik lokalizasyon aksine organların 3,6,9 ve ex vivo analizi ile belirlenmelidir, kompozit 3D dağınık ışık görüntüleme tomografi (DLIT) BL bir nicel 3D rekonstrüksiyon derlemek için kullanılabilir kaynak 12. DLIT alınan BL görüntüleri toplayarak gerçekleştirilir tanımlanan dar bant-geçiş optik filtreleri kullanarak vedaha sonra bir yaygın optik tomografi 3 boyutlu rekonstrüksiyon algoritması 1,7,12,13 içine giren.
Şu anda, çok modalite görüntüleme ex vivo analizi için gerek kalmadan in vivo bioluminescent odaklarının gerçek non-invaziv anatomik lokalizasyon almak için kullanılabilen tek yöntemdir. Son zamanlarda, DLIT bir arada bir probiyotik bakteri 7 ile koruyucu tedavi sonrasında Citrobacter rodentium (C. rodentium) kolonizasyon dinamikleri değerlendirmek için μCT görüntüleme ile birlikte kayıtlı kullanılır. C rodentium enteropatojenik E. coli ve enterhemorrhagic 14 model insan enfeksiyonu için kullanılan bir sıçangil özel enterik patojendir. ° C. rodentium enfeksiyon genellikle hafif kilo kaybı, ishal, polarize Th1 immün yanıt ve kolon kript hiperplazisi de dahil olmak üzere ve bağlama farklı patolojik değişiklikler ve silen lezyon Formatı ile ilişkili kolit, neden14. Bu, ek olarak, C. rodentium patogenezi iyice Bu bakteri çok yöntem görüntüleme 3,4,7 ile kullanım için ideal bir model mikroorganizma yapma, iyi belgelenmiştir C57BL/6J farelerde BLI ve kolonizasyon dinamikleri kullanılarak incelenmiştir.
Bu protokol tek bir multimodalite görüntüleme platformu, IVIS Spektrum BT ve non-invaziv bu enfeksiyonun gerçek dinamiklerini gösteren bir 4D filmin nesil kullanarak bir bakteriyel enfeksiyon entegre DLIT-μCT görüntüleme için bir metodoloji anahat ilk.
Protocol
1. Fare Hazırlık
- Çalışma için gerekli 18-20 g C57BL/6J fareler satın ya da yeterince cins.
- Fareler harici bir tedarikçiden satın varsa, tesise ulaşım ardından, gut Mikrobiyota stabilize etmek için otoklava gıda ve su 1 hafta fareler alıştırmak.
- , Kulak çentik tartılır ve kafes başına farelerin gerekli sayıda ayırın.
- Enfeksiyona önce gün, herhangi bir anestezi yapmadan önce, prosedürün süresi için yeterli oksijen ve izofluran olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse, daha fazla isofluorane eklemek veya oksijen tüpü değiştirin. Daha sonra, onların ilk kullanımdan bu yana 50'den fazla g kazanmış ise, anestezi temizleyiciler ağırlığını kontrol atın ve taze temizleyiciler ile değiştirin.
- 7 dakika boyunca VEET kullanılarak XGI-8 Anestezi Sistemi ve tüylerini içinde% 3 Isofluorane kullanılarak Anaesthetise farenin.
- Notlar:
- Kapsamlı epilasyon, özellikle de önemlidirkürk melanin olarak siyah fareler önemli ölçüde bioluminescent sinyal 3,15 azaltır.
- Kürk regrow başlamadan önce farelerin epilasyon genellikle 8-10 gün sürer. Ilgi alanı görüntüleme oturumları için çıplak böylece gerektiğinde daha uzun süreler boyunca 4D Multimodalite görüntüleme gerçekleştirmek için, fareler tüylerini.
- Fare bir Biyogüvenlik Seviyesi 2 (BSL-2) muhafaza tesisinde yerleştirilmiştir.
2. Bakteriyel hücre hazırlanması
- Yeterli Kanamisin [50 mg ml -1] ile takviye Luria Burtani suyu ve agar plakaları gerekli ° C kadar 4 de çalışma ve mağaza için gerekli hazırlayın.
- Enfeksiyon öncesi gün ° C arasında bir dondurarak saklamaya uygun vialler çözülme rodentium gerginlik ICC180 ve hemen Kanamisin [50 mg ml -1] 220 rpm gecelik ve kültür, 37 ° C ile desteklenmiş bir cryobead için 15 ml LB suyu ekleyin Orta kirlenme için bir kontrol olarak, ek bir hazırlamakKanamisin [50 mg ml -1] 220 rpm, 37 ve kültür ° C ile desteklenmiş aşılanmamış 15 ml LB suyu
- Ertesi sabah (~ 16 saat), bakteriyel büyüme işareti olarak bulanıklık için orta kontrol edin. Kontrol açık ise, bir şahin tüp ICC180 kültür transferi ve 4,000 devirde santrifüj. Daha sonra, PBS içinde bakteryel tanelerin yıkayın. Daha sonra 1.5 ml PBS (Kanamisin ile desteklenmiş LB, orijinal hacminin 1/10) içinde tekrar süspansiyon ve bakteriyel inokulum oluşturmak için iyice karıştırın.
- ICC180 düzgün kültür ve görüntü daha önce 1 açıklandığı gibi Yaşam Resim 4.3.1 sihirbaz BLI ve otomatik ayarını kullanarak IVIS Spektrum CT aşı, önce farelerin enfeksiyona biyolüminesans değil doğrulamak için.
Not:- Gerilme ICC180 vahşi tip C bir biyolüminesans türevidir rodentium ICC169 2. Bu bakteri suşu, K dahil olmak üzere, lux CDABE operon'u varanamycin direnç geni kromozom 2 xylE bir sözde eklenir.
- Standart aseptik teknikler kullanılarak tüm bakteriyel kültür yürütmek ve gerekirse ya steril sarf / reaktif satın almak veya kullanmadan önce otoklav.
- Adım 2.4 'de, biyolüminesans süresi (P / S / cm 2 / sr) farelerin enfeksiyon öncesi bakteri sayısı tahmin etmek için de kullanılabilir.
3. Bioluminescent C ile farelerin enfeksiyonu rodentium ve Bakteriyel Kolonizasyon Değerlendirilmesi
- Enfeksiyon öncesinde, prosedürün süresi için yeterli oksijen ve izofluran olduğunu gösterir. Gerekirse, daha fazla isofluorane eklemek veya oksijen tüpü değiştirin. Daha sonra, onların ilk kullanımdan bu yana 50'den fazla g kazanmış ise, anestezi temizleyiciler ağırlığını kontrol atın ve taze temizleyiciler ile değiştirin.
- Bir XGI-8 anestezi kullanılarak% 3 Isofluorane ile Anaesthetise fareninsia Sistem insani kısıtlama sağlamak.
- Iyice bakteriyel inokulum karıştırın ve şırıngaya 0.2 ml (yaklaşık 5 x 10 9 kob ICC180) çizin.
- Sıkıca başparmak ve işaret parmağı ile boyun arkasındaki cilt tutarak bir zaman ve ense onlara anestezi sistemi birinden fareler çıkarın.
- Dil üzerinde, ve yemek borusu aşağı, ağız çatı doğru sonda iğne itin ve mideye bakteri inokulum enjekte.
- Farelerin ağızdan sonda ardından, bakteriyel inokulum akciğerlere teslim edildiğini bir işareti olabilir sıkıntı belirtileri için onların yürüme ve nefes izlemek. Akciğerlerde aşılanmış olan herhangi bir fare Euthanize.
- Bir vasıta kontrolü olarak 200 ul PBS ile sonda enfekte farenin, Adım 3.1-3.6 tanımlanmıştır.
- Ağızdan sonda doğru olarak yapıldığını onaylamak için, IVIS Spektrum CT görüntü enfekte ve sahte enfekte olmuş fareler Yaşam BLI ve otomatik ayarını kullanarakResim 4.3.1 sihirbaz olarak daha önce 1 nitelendirdi.
- PBS içinde seri seyreltme ile inokulum içinde canlı bakteri sayısını belirlemek ve Kanamisin ile desteklenmiş LB agar üzerine üç nüsha olarak tespit [50 mg ml -1].
- Orada yaklaşık 5-50 koloni olduğunu ve seyreltme her noktadan kolonilerin sayısını ve koloniler sayılır olduğunu seyreltme kayıt bir seyreltme bularak ICC180 hücre / ml sayısını hesaplayın. Daha sonra, cfu ortalaması (üç noktalar) hesaplamak ve seyreltme faktörü 50 (her nokta orijinal 1 ml numune 20 ul) ve koloniler kob / ml vererek, üzerinde sayıldı seyreltme ile bu değeri çarpın.
- Önceden tartılmış bir Eppendorf tüpü (iyi bir denge ağırlığında) her bir fareden alınan dışkı toplayarak günlük farenin kolonizasyonu izlenmesi ve numunenin ağırlığı (0.1 g ml-1) göre PBS içinde 1/10 seyreltilmiş.
- Içinde canlı bakteri sayıları belirleyinPBS içinde seri seyreltme ile ve LB agar üzerine üç kopya olarak tespit dışkı kanamisin ile takviye [50 ug ml-1].
- Adım 3.9 izleyerek dışkı gramı başına canlı bakteri sayısını hesaplayın, o cfu / g ila 0.1 ug ml-1 PBS içinde fekal seyreltme faktörü (adım 3.10) ile cfu / ml sayısının çarpın.
- Farenin saf ICC180 kültürü ile aşılandı ve olduğunu belirlemek için kolonilerin biyolüminesans vardır. Adım 3,8 agar plakaları almak, gözle ya da bakteri koloni morfolojisi değerlendirmek ya da plaka bir temsilci koloni almak ve ışık mikroskobu ile analiz. Gerekirse, bakteri tanımlama Kültür saflığını değerlendirmek üzere gerginlik spesifik koloni PCR ile gerçekleştirilebilir. Daha sonra, görüntü BLI kullanarak IVIS Spektrum CT tabak gibi adım 3.7 'de açıklanan ve plaka üzerinde kolonilerin% 100 biyolüminesens olup olmadığını kontrol edin.
Notlar:- Sonda iğne takmadan adım 3.4, in, Bu akciğerlere gitmek için inokulum neden olarak direnç, sonda iğne zorlamayın hissediyorum. Bunun yerine, iğne yeniden takın ve yavaşça tekrar deneyin.
- Adım 3.1 isteğe bağlıdır ve fareler anestezi enstitüleri hayvan refahı politikasına bağlı olmadan zorla ağız yolundan verilmiştir sözlü olabilir.
- Dışkı tahsil edildikleri o gün kaplama olmalıdır. C rodentium 4 PBS ° C gecede yaptı ve yanlış kob / g dışkı miktarının neden olsa bile büyüyecek.
4. Enfekte Farelerin μCT Görüntüleme günlük Kompozit 3D Yaygın Işık Görüntüleme Tomografi (DLIT-μCT)
Hayvan refahı hususlar: DLIT-μCT bir hareketsiz hayvan, hızlı, düşük radyasyon dozu μCT tarama (iki fare tarama için ~ 23 mGy, ~ tek bir fare tarama için 53 mGy) ile entegre DLIT optik görüntüleme içerir. Bu doz her bir görüntüleme oturumu ile birikir, bu nedenle amacı doz lo olarak tutmakmümkün w (ve her zaman iyi LD 50/30 altında) hala çalışma yerine ise. Farelerin geleneksel BLI tarama enfeksiyon belirtisi varsa Bazı durumlarda, μCT tarama daha dozu en aza indirmek için önlenebilir. Radyasyona maruz kalma ile ilgili herhangi bir endişe varsa doz uzun süreli çalışmalarda, mümkün olduğu kadar düşük tutulur olsa da, fare zararlı belirtilerin ilk işareti veya μCT görüntüleme süresi sonunda itlaf edilecektir.
- Önce görüntüleme için, IVIS Spektrum BT başlatmak ve X-ray güvenlik kilitleri çalışma ve ısıtmalı sahne görüntüleme için doğru sıcaklığı (37 ° C) olduğunu kontrol edin. Daha sonra, anestezi sistemi ve anestezi sürükleyiciler ağırlığını içinde isoflourane seviyesini gösterir. Gerekirse, daha isofluorane ekleyebilir ve çöpçüler ilk kullanımdan bu yana 50'den fazla g kazanmıştır varsa, atın ve taze temizleyiciler ile değiştirin.
- Spektrum CT kurmak böylece görüntüleme parametreleri oYaşam Resim 4.3.1 'de otomatik pozlama özelliği görüntüleme bakteriyel lusiferaz için optimize edilmiştir çalıştırın. Düzenle seçeneğini seçin> Tercihler> Toplama ve Otomatik Pozlama Pencere. Sonra> Aralık Değerler> Uzm seçin. Zaman (saniye) ve> Max ayarlayın. 300s için. Son olarak,> Hedef Sayısı (en az)> Işıklı seçin ve 10.000 sayıları ayarlanır.
- Spektrum BT içine bir fare görüntüleme platformu takın ve çekül bu anestezi içine.
- X-ray güvenlik kilidi açın ve IVIS başlatmak.
- IVIS Spektrum CT başlatıldı sonra, insani kısıtlama sağlamak için XGI-8 Anestezi Sistemi kullanılarak% 3 isofluorane ile fareler anaesthetise.
- Bir DLIT-μCT tarama, BLI kullanarak fare gibi tek bir fare görüntüleme platformda, daha önce 1 açıklanan öncesi görüntü gerçekleştirmek için gerekli olup olmadığını belirlemek için. Güçlü bir sinyal elde edilir, fare DLIT görüntüleme için uygundur. Bir fare görüntüleme platfor olarak anestezi fare bırakınDLIT-μCT için BLI taramadan sonra hazırım.
- Için set-up DLIT-μCT tarama Yaşayan Image yazılımı 4.3.1 'de Görüntü Sihirbazı kullanın. Görüntü Sihirbazı otomatik olarak FOV, gürültü oranı en iyi sinyal vermek için μCT görüntüleme için DLIT ve FOV, maruz kalma süresi, filtre setleri ve binning için maruz kalma süresi, F-stop ve binning belirler. Görüntü Sihirbazı tarafından istendiğinde, sadece 560, 580, 600, ve 620 nm emisyon filtreleri içerir ve tek bir fare μCT tarama seçin. Ardından> görüntüleme başlatmak için edinin.
- Görüntüleme sonra kafesine anestezi fare dönmek, Spektrum CT bir fare görüntüleme platformu çıkarın ve 1% Tri-gen kullanarak dezenfekte edin. Gerekirse, fare fareler arasında çapraz kontaminasyon riskini en aza indirmek için konumlandırılmış olduğu köpük yastık değiştirin.
- Kadar bir 4D mo yapmak için gerekli boyuna görüntüleme verileri oluşturmak için adımlar olarak 4,1-4,8 açıklandığı DLIT-μCT, kullanarak gün 8 yazılan enfeksiyon (PI) günlük Resim farelerenfeksiyon vie.
Not:- Adım 4.7 olarak, görüntü bakteriyel biyolüminesans için 560-620 nm emisyon filtre kullanımını tavsiye ederiz. Bakteriyel biyolüminesans zirvesine doku optik (fare doku ile yeşil / mavi fotonların önemli zayıflama) nedeniyle 485 nm, yaklaşık olmasına rağmen, onlar sinyal derinlik hesaplama kolaylaştırmak olarak 3D rekonstrüksiyon için turuncu / kırmızı fotonlar kullanmak önemlidir .
- DLIT için Yaşam Resim 4.3.1 'de' otomatik 'pozlama ayarları yakalanan fotonların miktarı ve her filtre seti için kullanılan maksimum görüntüleme zaman optimize etmek için ayarlanması gerekebilir.
- Bu, örneğin bir tespit bioluminescent sinyal, varsa araştırmacı emin değilken yeni bir enfeksiyon modeli kullanırken BLI öncesi görüntüleme adım 4,6 tarif gerçekleştirmek için gereklidir.
5. DLIT-μCT Görüntüleme Veri 3D İmar
- Açık Yaşam Image yazılımı 4.3.1 ve seçin>, DLIT-μCT dosyaları içeren klasörü bulun ve açın.
- Örneğin C. için, Yaşayan Image Browser en DLIT-μCT dosyasını açın Yük tıklayarak rodentium Gün 1 PI.
- Aracı Palet seçin> Yüzey Topoloji> Çıplak fare, tıklatın eşik ayarlayın ve> Yüzey oluşturun. Yüzey yeniden başarılı olursa bir yüzey anahat 3D görünüm penceresinde görüntülenir.
- 3D görünüm penceresinde işlenen μCT tarama görüntülemek için, (> 3D optik araçlar ve unselect> Teşhir Alanı Nesne tıklayın) yüzey çizgiyi gizlemek veya (> 3D optik araçları tıklayın ve> donukluk kaydırma çubuğunu ayarlayın) yüzey donukluk azaltmak.
- 3D DLIT yeniden detaylı anatomik lokalizasyonu bu işlemleri sadece fare iskeleti görünür olduğunu ve optimum kontrast sahip olduğu 3D hacimsel veri (μCT tarama) değiştirmek için gereklidir sağlamak. > 3D modelli araçları ve seçin> Logaritmik Histogram, G tıklayınradient Aydınlatma, Kalite ve Denoise. Son olarak, sağa Histogram sürgüsünü ayarlayın ve 3D hacimsel veri değişim kontrast izleyin. Sadece kemikleri net bir şekilde görülebiliyor kadar veri ayarlama tutun. İsterseniz, histogramı transfer fonksiyonu puan için rengini değiştirmek.
- Sonraki seçin> DLIT 3D Aracı Palet İmar ve sadece 560, 580, 600, ve 620 nm in vivo görüntüleme bakteriyel lusiferaz için gerekli filtre setleri, seçilmiştir emin olun. Tıklayın Başlat>. Veri Önizleme Penceresi menüsü 2D görüntülendi fare spektral filtre BL sinyaller görünür. Bu sinyaller otomatik olarak yazılım tarafından eşiklenir, ancak menünün altındaki sekmeleri kullanarak gerekirse manuel olarak ayarlanabilir. Eşik yeniden veri olarak dahil edilecek minimum veri yoğunluğu (resimde maksimum sinyal yüzdesi olarak temsil) belirler.
- Sonraki seçin> DLIT 3D Aracı Palet İmar ve DLIT yeniden inşası için kullanılan optik özellikleri doğru olup olmadığını kontrol edin. > Özellikler sekmesini seçin ve Doku Özellikleri ayarlarını fare doku olarak ayarlanmış olduğundan emin olun, Kaynak Spektrum Bakteri ayarlanır.
- Tıklayın> DLIT yeniden gerçekleştirmek için Yeniden İnşa.
- DLIT-μCT 3D film tıklama oluşturmak için> Araçlar> 3D animasyon ve seçin> Önceden Animasyonlar> sola Y ekseni ve> Toplam Süre> 10 sn (saniyede 25 kare). 3D animasyon için ayarları doğru basın> Kayıt ve gibi DLIT-μCT 3D rekonstrüksiyon kaydetmek kez. Ayrı bir klasörde deney, grup ve zaman noktası ile etiketli avi dosyaları.
Not:- Yaşam Resim 4.3.1 ve yüklü bir hizmet paketi 1 ile ve PC Multi-modalite görüntüleme yazılımı çalıştırmak için uygun bir grafik kartı olan bir PC kullanmak DLIT-μCT veri 3D rekonstrüksiyon yaparken önemlidir. Thyazılım indirilebilir olduğunu ve GPU özellikleri sürüm notları (içerdiği http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm ).
- DLIT-μCT 3D rekonstrüksiyon kaydedilir sonra geriye doğru görünüyorsa, bilgisayarınıza grafik sürücüsünün eski bir sürümünü çalıştıran ve bu üreticilerin web sitesinden bir güncelleştirme indirerek düzeltilmesi olabilir.
- Adım 5'te, 3D DLIT-μCT rekonstrüksiyon üretmek için tercih edilen ayarları mevcut. Ancak, bu protokolde ele değildir parametreler değiştirilebilir 3D rekonstrüksiyon sırasında birden fazla nokta vardır. Oturma Resim 4.3.1 kullanarak 3D rekonstrüksiyon için kapsamlı bir rehber için üreticilerin kullanım kılavuzuna bakınız.
- Onlar karşılaştırılabilir böylece çok yöntemi görüntüleme aracında aynı ayarları kullanarak 3D rekonstrüksiyon oluşturmak için önemlidir. Ek olarakBu, DLIT-μCT 3D rekonstrüksiyon oluştururken, bu ikinci ve toplam süresi kare aynı sayıda (uzunluk), aksi takdirde 4D video zamanlaması homojen değildir kullanarak video yapmak önemlidir.
6. C. bir 4D Film Üretimi rodentium Enfeksiyon
- Açıkçası kolay erişilebilir bir klasöre doğru deneme, zaman noktasında ve grubu ile DLIT-μCT 3D rekonstrüksiyon her etiket.
- Windows Live Movie Maker yeni bir dosya oluşturun ve adım 6.1 hazırlanan klasöründen araçları sekmesini kullanarak gün 1 PI kronolojik sırayla DLIT-μCT rekonstrüksiyon takın.
- Uygun DLIT-μCT Video seçip Ana seçerek örnek Gün 1 PI için, zaman noktasında anlatan her videonun başlangıç için başlık ekleme> Başlık Ekle. Bir metin kutusu uygun efsane eklenir ekranda, görünür. Des olarak yazı tipi boyutu, stil, renk, ve gerekçe ayarlayınyazılım araç çubuğundaki Microsoft Word ile aynı sekmeleri kullanarak IRED. Son olarak, videonun sol üst köşesine başlık hareket ettirin.
- DLIT-μCT tüm videoları için adım 7.3 tekrarlayın.
- Bir başlık sayfası ekleme, örneğin C. Ana Sayfa tıklayarak 1-8 rodentium enfeksiyonu gün> Başlık. Bir metin kutusu uygun başlık boş bir slayt eklenir ekranda görüntülenir. Yazı tipi boyutu, stil, renk, ve yazılım araç çubuğundaki Microsoft Word ile aynı sekmeleri kullanarak istediğiniz gibi gerekçe ayarlayın.
- Bir Movie Maker proje filmin başlığı ile uygun bir klasörde * mmp olarak proje kaydedin. Eğer film değişiklik istiyorsanız bu adım önemlidir.
- A. Wmv dosyası olarak film kaydedin. Movie Maker menüsü> bilgisayar için film> kaydedin.
- . Avi veya bilgisayarınızla uyumlu başka bir uygun dosya türü için bir dosya dönüştürücü kullanarak film yapımcısı dosyası dönüştürme.
Notlar:- Bu tavsiye edilir 4D filmWindows'un yüklü Live Movie Maker (bir PC üzerinde oluşturulan http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker ) ve. wmv çalabilen iyi bir multi-medya programı veya. avi dosya türlerini.
Representative Results
5 x 10 9 cfu C ile C57BL/6J farelerin Enfeksiyon rodentium iyi tarif bakteriyel enfeksiyon modeli ve kendi kendini sınırlayan gastrointestinal enfeksiyon neden olduğu gün 6-8 sonrası enfeksiyon ve 3 ila 4 hafta 2,14 arasında sürer zirveleri. Enfeksiyonun fare bağışıklık sistemi tarafından barsak lümeni ile sınırlıdır ve bunun sonucu olarak, bakteri sürekli dışkı dökülür. C. tarafından farelerin Kolonizasyon rodentium dışkı veya biyoparlaklık görüntüleme 2,3 doğrudan bakteriyel numaralandırma tarafından non-invaziv izlenebilir.
Bu el yazması 3D ve C maddeleri 4D Multimodalite görüntüleme gerçekleştirmek için optimize edilmiş bir protokol özetliyor enfeksiyon sırasında bakteri yükü ve yerelleştirme izlemek için fareler içinde rodentium. Şekil 1'de sunulan sonuçlar, başarılı 4D görüntüleme için gerekli kontrolleri göstermektedir. Önceki farelerin enfeksiyon caydırmak için gereklidirkullanılan bakteriyel inokulum biyolüminesans (Şekil 1A) olduğunu benim ve bu bioluminescent C ile bir fare ağızdan sonda takip Sinyal hayvanın mide değildir akciğer (Şekil 1B) 16 gözlenen olabilir rodentium.
Biyoparlaklık görüntüleme kullanarak bakteri kolonizasyonu izlemenin yanı sıra, bu dışkı bakteri sayıları ölçmek için iyi bir uygulama, gastrointestinal mukoza bakteri kolonizasyonu dolaylı bir ölçümü olarak kullanıldığı Şekil 2 C57BL6 / J 8 alınan dışkı tipik bakteri yükü göstermektedir. ~ 5 x 10 9 cfu ICC180 ile enfekte ve gündüz 6-7 kadar gün 2 PI 8 gün PI Kolonizasyon artar izlenmektedir fareler nerede ~ 5 de enfeksiyon tepe x 10 10 kob / g, önceki raporlar 2,3,17 doğrultusunda hangi.
Değerlendirmenin önemini vurgulamak içinting tek bir fare, Şekil 1b ve 3 yanı sıra Video 1 enfeksiyon yayılmasını C. ardından aynı fare elde edilmiştir yukarıda tarif edildiği gibi rodentium enfeksiyonu. Günlük DLIT-μCT anatomik bir referans olarak iskelet kullanarak, bu fare içinde bioluminescent bakteri mekansal dağılımını değerlendirmek için kullanılmıştır. Şekil 3 az 3 anahtar zaman noktalarında PI ICC180 ile enfekte bir C57BL/6J fare DLIT-μCT yeniden gösteriyor gün 3 PI küçük biyolüminesens odaklar mekansal dağılımı çok az değişiklik ile gün 5 PI tarafından biyolüminesans yoğunluğu ılımlı bir artış gösteren, hangi kolonda görülebilir. Gün 7 PI anda biyolüminesans önemli bir artış ve tüm kolon boyunca bioluminescent odaklar yayılmasını görülmektedir.
Video 1 ICC180 ile gün 1-8 PI 3D DLIT-μCT rekonstrüksiyon bir derleme ve C göstermektedirgün kolon günlerinden itibaren kolonda 4-6 PI bakteri sayısı gün bakteriyel odaklar tüm kolon kapsayan 7 PI zirve kadar genişletmek 3 PI yayılır gün 1-2 PI arasındaki proksimal gastrointestinal sistem içinde rodentium. Gün 8 PI sadece iki ayrı bakteri odakları proksimal ve distal kolonda mevcuttur. Kronolojik sıraya göre her zaman noktasında tam 3 boyutlu rekonstrüksiyon görüntüleme olanağı konak patojen ilişkileri analiz etmek için güçlü bir araç temsil eder ve aynı veri kümesi hala bir 3D daha yorumlamak daha kolaydır.
Şekil 1.. A 2B biyoparlaklık görüntüleme) Bioluminescent C. inokulum 200 ul ile ağızdan sonda takip rodentium ICC180 inokulum ve B) bir fare. Ok (>) bioluminescent C. göstermektedir rodentium em> midede.
Şekil 2,. ° C. rodentium kolonizasyon dinamikleri. C. miktarının rodentium koloni 8 gün PI dışkılarından birimleri oluşturan
Şekil 3,. Bioluminescent C. dağınık ışık görüntüleme tomografi-μCT tarama gün 3, 5 ve 7 PI Arrowhead (>) ve kontrol bir fare rodentium enfeksiyon kolon kolonizasyon göstermektedir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv "target =" _blank "> Videoyu izlemek için burayı tıklayın. bir fare C. rodentium enfeksiyon 4D film gün 1-8 PI izlenebilir
Discussion
Bakteriyel enfeksiyon 4D film çok yöntemi görüntüleme büyük miktarda veri hızlı ve kolay görselleştirmek ve yorumlamak için bir araç sağlar. Bu teknik bir enfeksiyon tek bir fare aracılığıyla yayılır nasıl detaylı analiz kolaylaştırır ve araştırmak için kullanılabilir nasıl ev sahibi ya da bakteri genleri veya uzunlamasına çalışma 7 sırasında özellikle müdahale stratejilerinin etkisi bakteri yükü, dağıtım, ve yerelleştirme silinmesi. Bu videolar da yararlı öğretim yardımcıları ve kamuoyuna bilgi yaymak için bir araç sağlar.
DLIT-μCT görüntüleme ve enfeksiyon 4D Video derlemek yeteneği elde edilen verilerin kalitesini etkileyebilecek bu protokolde pek çok kritik adım vardır. Bu protokolün en önemli parçası C ile farelerin başarılı ve homojen bir enfeksiyondur rodentium. Bu çalışma için kullanılan fareler 18-20 g arasında ve esastır bakteriyelarteriyel mikroorganizma taze hazırlanmış ve yaklaşık 5 x 10 9 CFU, daha önce 2,3 açıklanmıştır. Önce farelerin enfeksiyona bu inokulum Spektrum BT kullanarak ve bir kez aşı hazırlanmıştır biyolüminesens olup olmadığını kontrol etmek önemlidir her fare fareler benzer bulaşıcı dozlarda aldığınızdan emin olmak için zorla ağız yolundan verilmiştir önce, sürekli homojenize edilmelidir. Farelerin DLIT-μCT görüntüleme Yaşam Resim 4.3.1 yazılımında otomatik pozlama fonksiyonu otomatik olarak iyi gürültü üzerinde olması sinyal için optimize edilmiş görüntüleme parametreleri belirler, böylece optimize edilmiştir. Ancak, otomatik pozlama fonksiyonu yordamda açıklandığı gibi değiştirilmesi gerekir kullanıcı tanımlı ayarları ve parametreleri dayanır. Bu takdirde seçerler için Spectrum CT fabrika ayarlarını görüntüleme tümör ifade etmek için programlanmış gibi, enfeksiyon belirgin bir ilerleme neden olmadığını toplanan fotonların az sayıda yoksul görüntüleri neden olacaktırateşböceği lusiferaz. Rekonstrüksiyon 560-620 nm, bu nedenle yeniden dahil etmek daha güvenilir veriler, simüle ve ölçülen veri arasındaki en iyi anlaşma vermek ve kullanıldı.
DLIT-μCT kullanımına ilişkin bir sınırlama μCT tarama gelen bu iyonize radyasyon uzunlamasına bir çalışma 18 kümülatif bir alt ölümcül radyasyon hasarı neden olur. Alt öldürücü radyasyona maruz kalma DNA hasarı ve iç organlarda 19 apoptozise yol, bağışıklık yanıtı zayıflatabilir. Iyonize radyasyon için LD 50/30 farelerin fare gerginlik ve yaşa bağlı olarak 5 ila 7 Gy arasında 18,20,21 kullanıldığı, aşılırsa Sonuçta, kümülatif alt ölümcül radyasyon hasarı ölüme neden olabilir. Kapsayıcı ilke konservatif doz tahmin etmek olduğu iyonize radyasyondan moleküler hasar bazı, iyileşmek de, bu genellikle çalışma planlama muhasebeleştirilir değildir. Bunun yerine, amacı çok bel olarak kalmaktırmümkün olduğunca ow bu sınırları hala çalışma hedeflerine ulaşma süre. Bunun nedeni, enfeksiyon için normal bir bağışıklık tepkisinin Bu çalışmada özellikle önemlidir, görüntüleme ve transgenik hayvanlarda bağışıklık gibidir, ya da ağır enfekte olmasından sıklığı iyonlaştırıcı radyasyona karşı daha duyarlı olabilir.
Enfeksiyon 4D film oluşturmak için deney planlama, bu deney uzunluğu dikkate alınması önemlidir, μCT sayısı kullanılan fare suşu için iyonizan radyasyon için bu süre sırasında gerekli tarar ve LD 50/30. Bu bakteri tespit sınırları ve görüntüleme kez etkileyecek gibi DLIT-μCT bir başka potansiyel sınırlama, kullanılan bakteri suşu içinde muhabir ifade gücüdür. BLI için daha önce gösterdiği gibi son derece, araştırmacılar tamamen kışkırtıcı bakteri türleri geçerli kullanmanız önerilir, ama maksimum lux operon'u ifade için optimize edilmiştir2,3.
4D görüntüleme mevcut tasarım için bir uyarı her film farklı foton ölçekleme sahip bireysel DLIT-μCT taramalar oluşur olmasıdır. BL odaklar lokalizasyonu, ya da yoğunluğu değişiklikleri ince ise bu yorumlamak görüntüleri zorlaştırabilir veya birden fazla zayıf odaklar çevrili bir yoğun BL odak varsa. Bu nedenle, boyuna görsel için, bu zaman noktalarında renk çubukları tutarlı tutmak için önemlidir.
Enfeksiyon 4D film kavramı her bir uygun şekilde etiketlenmiş bakteriyel bir patojene karşı uygulanabilir. Bu tekniğin gelecekteki gelişimi enfeksiyon ev sahipliği yanıtları incelemektir kızılötesi prob yakın floresan biyolüminesens bakteriyel patojenler ve enjektabl bir arada kullanarak enfeksiyonu ev sahipliği yanıtların soruşturma kolaylaştırmak için floresan görüntüleme tomografi (dolaşmak) yanı sıra DLIT kullanmak hedefleyecektir. Buna ek olarak bu, bu protokolde sadeceenfeksiyon 4D filmleri oluşturmak için biyolüminesans bakterilerin kullanımını tarif eder. Bununla birlikte, bazı durumlarda, biyolüminesans muhabir enfeksiyon sırasında ana genetik araştırmak için de kullanılabilir, böylece iRFP ile etiketlendi örneğin, floresan etiketli bakteriler kullanmak gerekli olabilir. Önemlisi, DLIT / Flit-μCT birleştirerek çok yöntemi görüntüleme kullanımı bize non-invaziv azaltılması, arıtma, ve bilimsel araştırmalarda hayvanların kullanımı yerine önemli ölçüde katkı sağlayacak olan bir bakteriyel enfeksiyon sırasında birden çok parametre araştırmak sağlayacak olarak NC3R girişimi (özetlenen http://www.nc3rs.org.uk/ ).
Disclosures
Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Perkin Elmer tarafından desteklenmektedir.
Yazarlar Kevin P, Francis, Jeff Meganck ve Chaincy Kuo Kaliper-A Perkin Elmer Şirket çalışanları.
Tüm hayvan deneyleri Hayvanlar Bilimsel Usul Kanunu 1986 uygun olarak yapıldı ve yerel Etik Değerlendirme Komitesi tarafından kabul edildi.
Acknowledgments
Imperial College in vivo görüntüleme tesiste MRC tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
| Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
| Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
| Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
| Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
| Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
| Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
| 50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
| Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
| 1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
| Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
| Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
| IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
| 6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
| XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
| XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
| Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
| Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 | |
|
|||
References
- Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice. J. Vis. Exp. (48), e2547 (2011).
- Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).
- Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6, 963-972 (2004).
- Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract. Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).
- Fanning, S., et al. Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).
- Collins, J. W., et al. Pre-treatment with Bifidobacterium breve UCC2003 modulates Citrobacter rodentium-induced colonic inflammation and organ specificity of infection. Microbiology. , 10-1099 (2012).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995).
- Hardy, J., et al. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303, 851-853 (2004).
- Szittner, R., Meighen, E. Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium. J. Biol. Chem. 265, 16581-16587 (1990).
- Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J. Antimicrob. Chemother. 67, 404-414 (2012).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J. Biomed. Opt. 12, 024007 (2007).
- Cronin, M., et al. High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting. PLoS One. 7, e30940 (2012).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cell Microbiol. 7, 1697-1706 (2005).
- Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Mol. Imaging Biol. 13, 1114-1123 (2011).
- Wiles, S., Crepin, V. F., Childs, G., Frankel, G., Kerton, A. Use of biophotonic imaging as a training aid for administration of substances in laboratory rodents. Lab Anim. 41, 321-328 (2007).
- Crepin, V. F., et al. Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo. Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).
- Willekens, I., et al. Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol. ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).
- Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. Small-animal X-ray dose from micro-CT. Mol Imaging. 3, 149-158 (2004).
- Sato, F., Sasaki, S., Kawashima, N., Chino, F. Late effects of whole or partial body x-irradiation on mice: life shortening. Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 39, 607-615 (1981).
- Kohn, H. I., Kallman, R. F. The influence of strain on acute x-ray lethality in the mouse. II. Recovery rate studies. Radiat. Res. 6, 329-338 (1957).
