Summary
Adenovirale genoverdracht in naïeve CD4 T-cellen met transgene expressie van de Coxsackie adenovirus receptor kan de moleculaire analyse van regulatoire T celdifferentiatie
Abstract
Regulatoire T-cellen (Tregs) zijn essentieel voor immunotolerantie aan zichzelf en aan bepaalde vreemde antigenen. Tregs kunnen vanuit naïeve CD4 T-cellen in vitro met TCR-en co-stimulering in de aanwezigheid van TGFp en IL-2. Dit draagt enorm potentieel voor toekomstige therapie echter de moleculen en signaalwegen control differentiatie grotendeels onbekend.
Primaire T-cellen kunnen worden gemanipuleerd door ectopische genexpressie, maar gemeenschappelijke methoden niet aan de belangrijkste naïeve toestand van de T-cel te richten voor primaire antigen herkenning. Hier bieden we een protocol om buitenbaarmoederlijke genen tot expressie in naïeve CD4 T-cellen in vitro voor het induceren van Treg differentiatie. Het geldt transductie met de replicatie-deficiënte adenovirus en legt de opwekking en productie. Het adenovirus kan nemen grote inserts (tot 7 kb) en kan worden uitgerust met de initiatiefnemers te hoog en voorbijgaande OVEREXP bereikenression in T-cellen. Het transduceert effectief naïeve muis T-cellen als ze drukken een transgeen Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Belangrijk na infectie de T cellen blijven naïeve (CD44 laag, CD62L hoog) en rustend (CD25 -, CD69 -) en kan worden geactiveerd en gedifferentieerd tot Tregs Soortgelijke niet-geïnfecteerde cellen. Zo, deze methode maakt manipulatie van CD4 T-cel differentiatie vanaf het allereerste begin. Het zorgt ervoor dat ectopische genexpressie is al op zijn plaats wanneer vroege signalering gebeurtenissen van de eerste TCR stimulatie induceert cellulaire veranderingen die uiteindelijk leiden naar Treg differentiatie.
Introduction
Tregs zijn cruciaal om immuun tolerantie te handhaven en overschrijding immuunreacties temperen. Tregs onderdrukken omstander T-cel activatie. Bijgevolg ablatie van Tregs leidt tot fatale auto-immuniteit en zelfvernietiging gedreven door geactiveerde T-cellen 1. Tregs in de thymus ontwikkelen in negatieve selectie van CD4-positieve enkelvoudige precursors, maar ze kunnen ook differentiëren in de periferie van naïeve CD4 T-cellen bij lage dosis antigeen stimulatie met suboptimale costimulatie 1,2. Thymus Tregs lijken weefsel auto-immuniteit onderdrukken tegen zelf-antigenen, terwijl perifere Tregs zijn betrokken bij het verstrekken van tolerantie in de darmen of longen. Deze geïnduceerde Tregs krachtig voorkomen dat T-cel activatie na herkenning van vreemde antigenen in het slijmvlies, waaronder milieu-antigenen van voedsel en lucht, commensale bacteriën en allergenen 3,4. Daarnaast Tregs zijn cruciaal voor maternale tolerantie voor foetale peptiden 5 vast te stellen en voorafvent graft-versus-host ziekte 6. Tegelijkertijd, Tregs ook ongewenste effecten mediëren door verzachtende immuunbewaking van tumorcellen 7,8. Het kenmerk kenmerk van Tregs is de uitdrukking van de subset-opgave transcriptiefactor Foxp3, een vork-head domein-bevattende transcriptiefactor die nodig en voldoende is om te overleggen Treg functie 9,10 is. Sommige signaalwegen die Foxp3 expressie kan induceren zijn bekend. Echter, de moleculaire processen die, reguleren of moduleren Treg differentiatie als reactie op T cel receptor activering minder goed begrepen.
Tregs kan zeer effectief worden geïnduceerd in vitro door het stimuleren van naïeve CD4 T-cellen met anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen in de aanwezigheid van TGFp en IL-2 11. Zoals de opkomende Tregs zijn functioneel in vivo, de manipulatie van moleculen die Treg differentiatie bevorderen draagt enorm potentieel voor toekomstige therapies, bijvoorbeeld de behandeling van astma, ziekte van Crohn en transplantatie 11,12. Omgekeerd kan therapeutische modulatie van moleculen aan Treg differentiatie blokkeren bieden voordeel in toekomstige aanpak van de gecombineerde behandeling van de tumor patiënten.
In vitro differentiatie assays geleverd tot de beschrijving van moleculaire veranderingen die geassocieerd met T cel subsets. Op dit moment, experimentele pogingen om te zoeken of het scherm voor genproducten die controle T cel differentiatie worden gehinderd door het feit dat de meest voorkomende methoden van ectopische genexpressie falen in naïeve T-cellen. Bijvoorbeeld, elektroporatie en retrovirale transductie zijn alleen effectief in geactiveerde T-cellen. In tegenstelling tot de oorspronkelijke verwachtingen lentivirale transductie, die typisch effectief in rustende cellen vereist pre-activatie van naïeve T-cellen met cytokinen 13. Ook de overdracht van cDNA of mRNA tijdens elektroporatieomvat depolarisatie van het plasmamembraan, dat zich verleent kenmerken van T-cel activatie en zelfs mobiliseren Ca2 + signalering en activeer NFAT eiwitten (niet gepubliceerde waarneming en ref. 14). Ook voor retrovirale transductie, de naïeve T-cellen te worden geactiveerd voor 18-40 uur. Gedurende deze tijd, de verdeling van de kernmembraan tijdens celdeling optreedt en maakt de daaropvolgende genomische integratie van het retrovirale vector 15. Deze werkwijzen zijn dus niet in staat de eerste moleculaire regulatie van initiële T-cel ontmoeting met antigen, de beslissende fase van helper T cel differentiatie pakken.
Adenovirale transductie is bekend om tijdelijke ectopische genexpressie kan in een aantal humane celtypes die de menselijke Coxsackie adenovirus receptor (CAR) drukken. Het verloopt zonder vereiste voor cel activering of cel-cyclus progressie. De oppervlakte-expressie van CAR is essentieel voor een efficiënte virus hechting en internalisatie en transgene expressie van de afgeknotte versie CARΔ1 onder een T-cel-specifieke promoter bleek muis thymocyten en T-cellen gevoelig zijn voor adenovirale infectie 16 maken. Vooral neemt het transgen niet wijzigen thymocyt ontwikkeling of in vitro differentiatie van naïeve CD4 T-cellen in verschillende subsets (gegevens niet getoond; 17 ref.). Adenovirus-gemedieerde transductie van T-cellen werd eerder gebruikt voor overexpressie 17,18 en knock-down-benaderingen 19,20. De transgene T-cellen kan worden gezuiverd uit commercieel verkrijgbare DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc referentie 17.). Belangrijk adenovirale transductie maakt hoge expressie van een gen van interesse in naïeve T-cellen induceren zonder duidelijke tekenen van activatie. De T-cellen blijft naïef (CD44 laag, CD62L hoog) en rust (CD25 -, CD69 -) na infectiop en kan worden geactiveerd en gedifferentieerd tot Treg Soortgelijke niet-geïnfecteerde cellen.
Productie van recombinante adenovirussen kan worden bereikt na transfectie van adenovirale HEK293A cellen met plasmiden (figuur 1). Deze plasmiden bevatten doorgaans de menselijke soort 5 adenovirusgenoom met E1 en E3 genen verwijderd om recombinante adenovirussen replicatie-incompetent 21 renderen. HEK293A cellen vullen replicatie-deficiëntie, zoals ze werden vereeuwigd door middel van stabiele integratie van geschoren adenovirus 22. Aangezien adenovirale vectoren zijn groot (~ 40 kb) en dus niet geschikt voor de traditionele restrictie-enzym-gemedieerde klonen, gebruikten we het Gateway systeem. Het gen van belang wordt eerst gekloneerd in een kleinere vermelding vector, waaruit het gemakkelijk kan worden overgebracht naar de bestemming adenovirale vector lambda via recombinatie reactie (LR) 23. We geconstrueerde de pCAGAdDu vectordoor het combineren van de CAG promotor (kip actinepromotor en CMV versterker) met een expressie-cassette met LR locaties aan weerszijden van de procaryotische ccdB selectie marker 24. Deze expressiecassette gefuseerd met een interne ribosoom toegangsplaats (IRES) element dat co-expressie van eukaryote marker infectie versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP), dat is gefuseerd aan een sequentie die het bovine groeihormoon poly (A)-signaal mogelijk maakt. We kozen CAG cis-regulerende sequenties, omdat het prototype CMV promoter werd gevonden sterk activatie-afhankelijk en daardoor ongunstig voor genexpressie in naïeve T-cellen zijn.
Hier geven we een protocol voor efficiënte in vitro Treg differentiatie en een methode om naïeve CD4 T-cellen te transduceren zonder activatie (Figuur 2). De methode maakt ectopische genexpressie of knock down voorgaande CD4 T-cel differentiatie bij de naïeve staat. Het maakt het testen van het effect van een overexpressed gen van belang tijdens de vroege signalering evenementen bij eerste TCR stimulatie tot T-cel deelverzameling inzet. Onze validatie-experimenten geven ook de basis om soortgelijke adenovirus toepassing in de differentiatie van andere T-cel subsets zoals Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, of Tfh cellen vast te stellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klonen van een gen van belang in een Entry Vector
- Kloon het gen van belang in een invoer vector. PCR amplificatie van het gen, gevolgd door blunt-end ligatie in een topoisomerase-gekoppelde vector (bijv. pENTR / D-TOPO) of restrictie-enzym-gemedieerde klonering kan worden gebruikt voor deze procedure.
2. Het overbrengen van het gen van belang in de pCAGAdDu Destination Vector
- Overdracht van het gen van interesse van de binnenkomst vector in de bestemming vector door LR recombinatie (bijvoorbeeld Gateway LR Clonase II Enzym Mix). Dit zal de adenovirale expressievector (afbeelding 1).
- Lineariseren 10 ug van het adenovirale expressievector in een Pad restrictie digest, neerslaan van het DNA en resuspendeer in water in een concentratie van 3 ug per 100 ul. Linearisatie bevrijdt de virale inverted repeats (ITR), die nodig zijn voor replicatie en inkapseling van het vIral DNA in virusdeeltjes.
3. Generatie van de Primary Virus Lysate
- Seed 1 x 10 5 HEK293A cellen in 2 ml kweekmedium (DMEM, 10% FBS, 5% Penstrep) in een putje van een 6-wells plaat en incuberen van de cellen gedurende 6-14 uur bij 37 ° C in een 10% CO 2 incubator om hen in staat om zich te houden. Cellen moeten dan ongeveer 50% confluentie.
- Lipofectie: Overdracht 6 pl jetPEI reagens in 94 pi van 50 uM NaCl, vortex kort. Voeg de gemengde oplossing van 100 gl gelineariseerde adenovirus vector terwijl vortexen en incubeer de transfectie mix gedurende 15-30 minuten bij kamertemperatuur.
Voer alle volgende stappen uit onder de juiste voorwaarden voor bioveiligheid adenovirusinfectie!
- Verdeel de oplossing druppelsgewijs aan de HEK293A cel bevattende putje en incubeer de cellen bij 37 ° C en 10% CO2. Bij gebruik van een fluorescentie marker, evalueren de Transfectie efficiëntie visueel na 12-36 uur met behulp van een omgekeerde fluorescentie microscoop. Voeg 0,5 ml vers medium om de 3 dagen.
- Controle om de 2 - 3 dagen met een lichte of fluorescentie microscoop voor cytopathische effecten (CPE), die zijn gebieden met vergrote en afgeronde cellen die beginnen te los. Dit wijst op efficiënte virusproductie. Bij het optreden van bredere zones van CPE (figuur 3), duurt het 24-72 uur voordat alle cellen worden geïnfecteerd.
- Als alle cellen vertonen tekenen van CPE, maar voor een totale onthechting van cellen plaatsvindt, los van de cellen door zachte pipetteren en overdracht cellen met supernatans (SN, 3 - 5 ml) een 15 ml polystyreen buis.
- Bevries de cellen in de SN op droog ijs gedurende 15-20 min en vervolgens ° C ontdooien ze snel bij 37 breuk van de cellen. Herhaal deze vries-en-dooi-cyclus (F / TC) nog twee keer. Houd de primaire virus lysaat op ijs voor gebruik binnen een dag of bevriezen bij -80 ° C voor opslag op lange termijn. Eventuele aanvullende F/ TC het virus titer met 30 - 50%.
4. Virus Amplification
- Zaad en groeien HEK293A cellen tot 90% confluentie op een 14 cm weefselkweek schotel.
- Infecteren van de cellen met de helft van de primaire virus lysaat (1,5-2,5 ml) en incuberen van de cellen gedurende tenminste 36 uur. Vrijwel alle cellen moeten vervolgens worden geïnfecteerd, wat kan worden vastgesteld door fluorescentie microscopie. Voor de re-amplificatie van een reeds geamplificeerd (dat wil zeggen meer geconcentreerd) virusvoorraad, HEK293A infecteren bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 50 (zie 6.3).
- De cellen moeten worden geoogst wanneer ze allemaal te zien CPE maar voordat onthechting. Met een efficiënte virus productie deze toestand wordt bereikt binnen 48 uur na infectie. (Als het langer duurt maximaal een week, overwegen een nieuwe ronde van amplificatie door het verhogen van de hoeveelheid adenovirus voorraad gebruikt voor de in 4.2 beschreven infectie.)
- Maak de cellen door zachte pipetteren en overdracht cellen en SN om een 50 ml polystyreen buis. Spin cellen neer op 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Verwijder de SN en resuspendeer de pellet in een geschikt volume medium en SN (ca. 1 ml).
- Voer 3 F / TC de cellen en centrifugeer bij 800 xg gedurende 15 min bij 4 ° verstoren C. Opstijgen van de SN dat de virusdeeltjes bevat (dwz de geconcentreerde virus lysaat), en de hoeveelheid van het virus lysaat te slaan bij -80 ° C.
5. Virus Titer Bepaling
- Zaad 10 5 A549-cellen per putje in 5 putjes van een 12-wells plaat in 1 ml medium en laat cellen hechten gedurende 6 uur.
- Gebruik 1 ui van geconcentreerde adenovirus (op ijs ontdooid) om een seriële verdunning in medium (1:5000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) uit te voeren en voeg 10 ul per putje. Laat een goed niet-geïnfecteerde om de gating passen in flowcytometrie.
- Na 36 uur, start de SN, wassen met PBS en losmaken cellen (bijvoorbeeld door behandeling met trypsine). Voor biohazard voorzorgsmaatregelen, is het raadzaam om vast te stellen cellen in 100 pi 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en wassen met PBS tegelijk.
- Voer een FACS analyse van infectie marker expressie. Plot 'pi viraal lysaat toegepast' tegen het absolute aantal geïnfecteerde cellen (figuur 4). Bepaal de lineaire bereik van de infectie en het berekenen van de titer per ml onverdunde virus van de standaard curve over de lineaire bereik met x = 1000 pi.
6. T-cel infectie
- Isoleer naïeve / rustende CD4 T-cellen uit DO11.10 tg; CARΔ1 tg muizen met behulp van MACS (Naïeve CD4 + T Cell Isolation Kit II) of FACS-sortering (CD4 + CD25-CD62L + CD44-).
- Voor kleinschalige experimenten, pipet een geschikt volume van virale lysaat om een MOI van 50 te bereiken in een putje van een 96-well ronde bodemplaat.
- Voeg tot 4 x 10 5 T-cellen in een finale infectie volume van 50 ul in T-cel medium (RPMI1640, 10% FBS, 5% Penstrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x MEM Essentialvitamine, 1x L-glutamine, 1:250.000 Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
Voorbeeld:
Een MOI van 50 wordt gebruikt om 3 x 10 5 T-cellen te infecteren; de virale titer is 3 x 10 9 ml -1
Volume Virus MOI = x T celaantal / virale titer = 50 x (3 x 10 5) / (3 x 10 ml 9 -1) = 0.005 ml
Opmerking: voor de besmetting van grotere aantallen cellen, opschaling met een MOI van 50 in een infectie volume van 165 ul per 10 6 naïeve T-cellen in een polystyreen buis met losse kop (maximaal tp 3 ml per tube).
- Incubeer cellen gedurende 90 min bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
- Spin down cellen op 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, opstijgen SN, opnieuw in suspensie in 200 ul PBS. Centrifugeer opnieuw en opstijgen SN.
(Optioneel kunnen de cellen opnieuw gewassen om het virus efficiënt te verwijderen)
- Resuspendeer cellenin 200 pl T-celmedium zonder stimulerende antilichamen en zonder IL-2 of andere cytokinen en pauze van 40 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator om expressie van het gen van belang kan voor activering.
7. T-cel activatie en Polarisatie
- Pipetteer volume van anti-CD3-en anti-CD28 gekoppelde korrels die het aantal cellen (bijv. 4 x 10 5) gelijk aan een kleine reagens beker, voeg de 10-voudig volume van PBS en ze op een magneet voor 2 min . Opstijgen en resuspendeer de kralen in 200 ul polariserende medium (voor Tregs: T-cel medium + 1 ng / ml TGF, 100 U / ml IL-2).
Opmerking: Cellen kunnen ook worden geactiveerd met weefselkweekschaaltjes bekleed met anti-CD28 en anti-CD3 antilichamen of een DO11.10 T cel receptor-specifieke wijze met bestraalde BALB / c splenocyten gepulseerd met peptide 323-339 ovalbumine antigeen.
- Centrifugee het rustte cellen als voorheen, opstijgen van de SN en resuspendeer cellen in 200 pi polariserende medium met anti-CD3-en anti-CD28-antilichaam-gekoppelde kralen. Incubeer 72 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator zonder medium.
8. T cel fixatie en kleuring voor flowcytometrie
- Was de cellen: Spin down cellen op 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, opstijgen SN, opnieuw in suspensie in 200 ul PBS. Centrifugeer opnieuw en opstijgen SN. Voer alle volgende stappen wassen dienovereenkomstig.
- Resuspendeer de cellen in 100 pi bevestigbaar dode cel kleurende oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Was de cellen, resuspendeer in 100 ul PBS, voeg 100 pl 4% paraformaldehyde in PBS, incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen, resuspendeer ze in 200 ul ijskoude 70% methanol in PBS en incubeer 30 minuten op ijs.
Opmerking: Cellen kunnen behandeld worden voortaan zonder biohazard voorzorg!
- Bereid 60 pi meester-mix van 60 ul PBS + 10 ug / ml Fc-blok (anti-FCR3 om niet-specifieke binding te blokkeren). Was de cellen, resuspendeer ze in 40 pl PBS + anti-FCR3 en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 20 ul van PBS + anti-FCR3 die 1 ug PE-gekoppeld anti-Foxp3 antilichaam, mengen en incuberen bij 4 ° C overnacht.
- Was tweemaal cellen in PBS en geanalyseerd cellen op een flow cytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virus Production
Voor het genereren van hoge virus titers, de timing van HEK293A celoogst in primaire virusproductie of virusreplicatie cruciaal. Representatieve fluorescente en fasecontrastbeelden met visuele tekenen van virusproductie zijn weergegeven in figuur 3. De CPE werden waargenomen 10 dagen na transfectie van HEK293A cellen met een controle pCAGAdDu vector zonder insert. CPE worden gekenmerkt door de verschijning van gebieden met vergrote en round-up cellen die beginnen te los te maken en vertonen een hoge expressie van de infectie marker GFP. De mate van CPE wijst op efficiënte virusproductie. Celkweekplaten met soortgelijke CPE worden geoogst binnen 24-72 uur, en een ruwe virus lysaat kan worden gegenereerd door vries-en-dooi cycli. De virus titer kan dan worden bepaald door seriële verdunning van het virus lysaat de vergelijking van infecties kan met een gelijke MOI (figuur 4). Binnen het lineaire bereik, tHij regressieanalyse vergelijking kan worden gebruikt om het aantal infectieuze deeltjes per ml verdunde virus lysaat berekenen. In het voorbeeld is de titer voor x = 1 pi is 30.016.535 gl -1 ≈ 3 x 10 10 ml -1.
Het evalueren van de impact van adenovirus infectie op T-cel activatie en differentiatie
De effecten van adenovirus transductie van doelcellen werden geëvalueerd door infecteren naïeve CD4 T-cellen met toenemende MOI met een adenovirale vector controle die alleen expressie IRES-GFP (Figuur 5a). De infectie-efficiëntie werd gemeten door FACS-analyse bepalen van GFP positieve cellen in vaste T-cel monsters 72 uur na inductie van Treg differentiatie. Het tarief van GFP positieve cellen verhoogd met de MOI gebruikt voor infectie en bereikte 84% infectie bij een MOI van 50. We hebben niet veel hoger percentage van geïnfecteerde T-cellen te verkrijgen bij gebruik MOI hoger dan 50 (gegevens niet getoond). Hoewel Infectie rendement is afhankelijk van het gen van belang, kan men meestal besmetten meer dan 50% van de cellen bij een MOI van 50. Bij MOI tussen 1 en 50 de cellevensvatbaarheid werd niet beïnvloed (Figuur 5b). Belangrijk is dat de stimulatie en de differentiatie van naïeve T-cellen in Tregs was vergelijkbaar in de geïnfecteerde vergelijking met de niet-geïnfecteerde cellen (Figuur 5c). Een belangrijke eigenschap van het adenovirus transductie is de mogelijkheid om naïeve en rustende T-cellen te infecteren zonder toekenning of vereisen T-cel activatie. Dit is duidelijk uit de analyse van merkers van T-cel activatie (CD25, CD69, CD44) en de markering van naïeve (CD62L) T-cellen in monsters met of zonder adenovirus infectie en rusten gedurende 40 uur bij 37 ° C in een 5% CO 2 incubator (figuur 6). Alvorens in vitro T-cel activatie met anti-CD3-en anti-CD28-gekoppelde kralen, de geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde T-cellen werden op dezelfde wijze CD25 lage, lage CD69 en CD44 low maar CD62L hoog, tonen hun naïeve en rusttoestand (figuur 6, bovenste panelen). Bij T-cel activatie, de geïnfecteerde cellen toonde opregulatie van de activatie merkers CD25, CD69 en downregulatie van CD62L bijna niet te onderscheiden van geïnfecteerde cellen (Figuur 6, onderste panelen). Zo wordt de activatie status van T-cellen niet veranderd door adenovirus infectie. De rustfase is geassocieerd met het verlies van 60 tot 70% van de cellen door de afwezigheid van groeifactoren en cytokines, vergeleken met 10 - 20% dode cellen 40 uur na activering zonder te rusten. Dit werd rekening gehouden bij de keuze van het oorspronkelijke aantal cellen van 3 x 10 5 cellen.
Het evalueren van de Overexpression niveau van een gen van belang
Om de hoeveelheid overexpressie bereikt door adenovirale gentransfer, wilden wij bepalen microRNA-155 (miR-155) expressieniveaus in naïeve T-cellen die weopnieuw besmet met miR-155-uitdrukken of controle adenovirus of werden geïnfecteerde links. We kozen voor miR-155 omdat deze volwassen miRNA wordt uitgedrukt op een gematigd niveau in naïeve T-cellen en raakt sterk geïnduceerd worden bij T-cel activatie. Bovendien heeft het een cruciale rol in T-cel-afhankelijke humorale responsen 25,26.
Het niveau van microRNA overexpressie werd geëvalueerd door qPCR. Na infectie werden de cellen 40 uur rusten, geactiveerd voor 40 uur of 40 uur rusten, gevolgd door 40 uur van activatie. Na 40 uur rusten, de naïeve T-cellen geïnfecteerd met miR-155 coderende virus getoond een ongeveer 17-voudige overexpressie van miR-155 in vergelijking met cellen geïnfecteerd met controle virus of niet-geïnfecteerde cellen (Figuur 7). Deze bijna overeenkwam met de mate waarin de endogene miR-155 geïnduceerd na T cel activatie (Figuur 7 en ref. 25,27). Ongeacht deze sterke inductie van endogeen miR-155 niveaus, cellen geïnfecteerd met miR-155 adenovirus toonde nog ongeveer vier-voudige toename in expressie van miR-155 na activering in vergelijking met virus-geïnfecteerde of niet-geïnfecteerde cellen te controleren. De waargenomen mate van ectopische overexpressie was vergelijkbaar voor andere microRNAs (gegevens niet getoond). Let op: voor grote inserts, overexpressie minder effectief kunnen zijn.
Analyse van T celdifferentiatie
De data analyse kan worden uitgevoerd op verschillende manieren. Analyse van differentiatie in de GFP positieve poort van een gen van belang (dat wil zeggen in de geïnfecteerde cellen) vergeleken met differentiatie in dezelfde GFP positieve gate van controle cellen (geïnfecteerde cellen met een vector zonder gen van interesse) voldoende om aanzienlijke verschillen te detecteren. Om meer subtiele effecten van een gen van belang te bestuderen, hebben we de differentiatie van geïnfecteerde cellen vergeleken met die van niet-geïnfecteerde cellen van dezelfde bron (figuur 8). Deze dienen als een interne control en kan worden gebruikt om de "relatieve differentiatie" binnen een nauwkeurig berekenen. Wanneer een virus heeft geen effect op differentiatie, de "relatieve differentiatie" idealiter 1. Het relatieve verschil van de controle virus in onze handen heeft een bereik van 0,9 tot 1,1. Relatieve differentiatie mag alleen worden toegepast op het vergelijken van gen-of rente-besmette monsters van het virus-geïnfecteerde monsters controleren.
Figuur 1. Schematische weergave van adenovirus generatie. Entry vectoren (pENTR) bevatten recombinatie donorplekken (AttL1, attL2) die flankeren een gen van interesse. De bestemming vector pCAGAdDu bevat de recombinatie doelwitplaatsen (AttR1, attR2) aan weerszijden van de toxine CcdB gen voor negatieve selectie in E. coli, die wordt vervangen door het gen van interessedoor LR recombinatie. De bestemming vector bevat ook een menselijk adenovirus type 5 genoom zonder E1/E3 genen, die zijn verwijderd om replicatie-deficiënte recombinante adenovirussen. Pacl linearisatie bevrijdt omgekeerde herhalingen (ITR) voor transfectie in cellen die HEK293A dragen de adenovirale genen van infectieuze genereren adenovirus deeltjes die resulteren in cytopathische effecten. Adenovirus wordt geoogst uit producerende cellen door vries-en-dooi cycli. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Schematische voorstelling van T-cel infectie en differentiatie. Naïeve T-cellen werden geïnfecteerd met adenovirus lysaat gedurende 1,5 uur, gewassen met PB S en uitgerust in T-celmedium gedurende 40 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. De cellen werden daarna gedurende 72 uur geactiveerd met anti-CD28 en anti-CD3-antilichaam-gekoppelde kralen in aanwezigheid van TGFp en IL-2. Vaste en gekleurde cellen werden geanalyseerd door FACS en de expressie van Foxp3 in geïnfecteerde versus niet-geïnfecteerde cellen werd bepaald.
Figuur 3. Cytopathische effect van adenovirus-producerende cellen HEK293A. Optreden van CPE op dag tien na transfectie van 10 5 HEK293A cellen met 3 ng gelineariseerde vector pCAGAdDu. Afbeelding van de fase contrast het linker paneel toont, het rechter paneel toont de groene fluorescentie.
55/50455fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50455/50455fig4.jpg "/>
Figuur 4. Het bepalen van de titer van adenovirus lysaten door infectie van A549 cellen. 10 5 A549 cellen werden geïnfecteerd met het aangegeven virus verdunning gedurende 48 uur en geanalyseerd op expressie van de GFP merker infectie door flow cytometrie. Het aantal GFP positieve cellen uitgezet tegen de hoeveelheid virus. De titer van onverdunde virus wordt berekend uit de standaardcurve via lineaire bereik met x = 1.000 III.
Figuur 5. Adenovirus infectie bij een MOI van 1-50 heeft geen effect op T-cel levensvatbaarheid of Treg differentiatie Naïeve T-cellen gezuiverd uit DO11.10 tg; CARΔ1 tg muizen werden geïnfecteerd met adenovirus bij verschillende MOI's.90 minuten, gewassen met PBS en 40 uur rusten in T-celmedium. Cellen werden geactiveerd Treg polariserende omstandigheden gedurende 72 uur. Vaste en gekleurde cellen werden geanalyseerd voor het inbouwen van dode cellen kleurstof (b), expressie van de infectie marker GFP (a) en van de differentiatiemarker Foxp3 (c). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 6. Adenovirusinfectie wordt de activeringsstatus van T-cellen niet verandert Naïeve T-cellen uit DO11.10 tg;. CARΔ1 tg muizen werden geïnfecteerd met adenovirus met een MOI van 50 gedurende 90 min (lijnen) of links geïnfecteerde (gebieden), gewassen met PBS en rustte voor 40 uur. Cellen werden geanalyseerd op expression van activatie merkers voor (bovenste panelen) en na (onderste panelen) 40 hr activatie in Treg polariserende omstandigheden.
Figuur 7. . Relatieve miR-155 overexpressie voor en na T cel activatie Naïeve T-cellen van DO11.10 tg; CARΔ1 tg muizen werden geïnfecteerd bij een MOI van 50 met microRNA-155 (miR-155)-expressie of controle adenovirus, of links-geïnfecteerde. De cellen werden vervolgens 40 uur rusten, geactiveerd voor 40 uur of 40 uur rusten, gevolgd door 40 uur activeren. Expressie van microRNA-155 is ten opzichte van SnoRNA202 bepaald door qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Virusproductie en titratie
Voor optimale transfectie resultaten, de kwaliteit en de hoeveelheid gelineariseerde vector uiterst belangrijk. We hadden geen negatieve effecten hebben op de primaire productie lysaat observeren vanuit een aanvankelijke sterke groei van de cultuur sinds de infectie zal snel overgaan zodra efficiënte virus productie plaatsvindt. Echter, virusproductie door HEK293A cellen worden beïnvloed door lange inserts die de doeltreffendheid verminderen. Sommige open reading frames werden daadwerkelijk gevonden te bemoeien met het virus productie. Deze virale voorraden kan meestal worden gered door de verschillende rondes van amplificatie, en slechts enkele open reading frames bleken onverenigbaar met het virus productie te zijn. Vanuit onze ervaring, zal de verschijning van CPE binnen 48 uur na de besmetting voor virus amplificatie levert doorgaans een viraal lysaat van ongeveer 1 x 09-05 oktober x 10 10 infectieuze deeltjes / ml.
Adenovirale Infectie van Naïeve T-cellen
Adenovirale infectie van naïeve T-cellen niet de status van activering van T-cellen niet wijzigen voor en na stimulatie. Dit maakt het transductiesysteem een krachtig experimenteel hulpmiddel voor het bestuderen van T-cel differentiatie van de eerste TCR-stimulatie op. We hebben efficiënte ectopische expressie van genen van belang na infectie en 'rustende' T-cellen gedurende 40 uur, op een tijdstip bepaald wanneer de cel nog naïef en geen tekenen van activatie vertonen. Dit betekent dat gedurende de volgende T-cel activatie, het gen van belang wordt al overexpressie en kan de invloed op T celdifferentiatie oefenen vanaf het begin. Zo adenovirale transductie heeft een duidelijk voordeel ten opzichte van elektroporatie of retrovirale transductie die activering vereist en drukken een gen van belang pas na de eerste TCR signalering 15,28. Indien late aspecten van differentiatie worden geanalyseerd en expressie van het gen van belang niet vereist voordat initiële T-cel activatie, naïeve T-cellen kunnen ook worden direct na adenovirale transductie gestimuleerd. Omdat adenovirale infectie is zeer efficiënt, kan het worden uitgebreid tot de samenwerkingsactiviteiten van twee genen van belang te bestuderen door het uitvoeren van dubbele infecties met adenovirussen die andere infectie markers zoals Thy1.1 of hCD2 uiten. Dit laatste is ook toegankelijk voor antilichaam oppervlak vlekken en kunnen problemen bij marker behoud omzeilen tijdens fixatie. In geactiveerde T-cellen echter adenovirale infectie heeft een veel lagere efficiëntie, en elektroporatie of retrovirale transductie methoden kunnen gunstig zijn. Een ander nadeel voor adenovirus toepassing is het vluchtige karakter van meningsuiting. Adenovirus wordt gehandhaafd als episoom aan de nucleaire matrix van de cel en worden verdund als T-cellen prolifereren, leidt tot het verlies van gen expressie binnen 5-7 dagen na T-celactivering (gegevens niet getoond;. Ref 17). Bovendien adenovirus-getransduceerde cellen readily herkend en geëlimineerd door een intact immuunsysteem, die het gebruik ervan beperkt in vivo, bijvoorbeeld in adoptieve overdrachtsexperimenten T-cellen in de muis. Een andere mogelijke toepassing van de adenovirale systeem kon de besmetting van Treg cellen geïsoleerd uit DO11.10 tg zijn; CARΔ1 tg muizen om Treg functie of lineage stabiliteit aspecten te bestuderen.
Validatie van Adenovirus Effecten op geïnfecteerde cellen
Adenovirus besmetting efficiënt en bijna geen invloed op T cellevensvatbaarheid en Treg differentiatie. Bij een MOI van 50, zonder inachtneming nadelige effecten van adenovirus infectie op T-cellen verkregen we de beste infectie-efficiëntie. Dit moet eveneens worden vastgesteld wanneer het systeem wordt toegepast op andere celkweek en differentiatie toestand, typisch door titratie experimenten met leeg adenovirus zonder expressie van het gen van belang. Als het adenovirale infectie als zodanig geen invloed op de uitkomst van het experiment,de vergelijking van gen van rentedragende adenovirus met lege adenovirus is steeds aangepast zijn aan de gevolgen van het overgedragen gen van belang te ontdekken. Indien er geen effect van adenovirale infectie kan de gemeten parameter ook vergeleken worden tussen niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde cellen van hetzelfde monster.
Data Analysis
De fixatie hier beschreven methode maakt een gelijktijdige analyse van de differentiatie marker Foxp3 met de infectie marker GFP, dus een "relatieve differentiatie 'worden bepaald. Deze analyse van twee populaties binnen een monster heeft een hogere gevoeligheid voor subtiele effecten dan bulk vergelijkingen bevolking tussen twee monsters, omdat het duurt well-to-well variaties in aanmerking. Echter alleen effecten inherent aan geïnfecteerde cellen worden herkend door deze werkwijze, terwijl goed brede effecten, bijv. invloeden uitgeoefend door een uitgescheiden factor, worden verwaarloosd. Relatieve differentiatie moet worden gecontroleerd in elkeexperiment met inbegrip van controle-geïnfecteerde cellen aan effecten van infectie zelf te sluiten op differentiatie. Voor een optimaal resultaat dient een bijna gelijk percentage van besmette naar niet-geïnfecteerde cellen in een monster worden nagestreefd, terwijl hogere infectie tarieven zijn gunstig in bulk vergelijkingen tussen verschillende monsters.
Concluderend, genoverdracht in naïeve T-cellen met adenovirus combinatie met in vitro differentiatie protocollen is een krachtig systeem om de moleculaire basis van Treg differentiatie onderzoeken. Hierdoor kan de generatie van kennis naar de dominante tolerantie in therapeutische benaderingen tegen allergische en auto-immuunziekten door Tregs verleende benutten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Lirui Du bedanken voor het construeren van de pCAGAdDU vector en Oliver Gorka voor bepaling van de fixatie protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| PacI | New England Biolabs | R057S | |
| jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N | |
| HEK293A Cell Line | Invitrogen | R705-07 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 14 cm tissue culture dish | Nunc | 168381 | |
| BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr | Taconic Farms | Model Nr. 4285 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 | |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| NaPyruvate | Lonza | BE13-115E | |
| NEAA 100x | Lonza | BE13-114E | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Invitrogen | 15630-056 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | |
| MEM Essential vitamin mixture (100x) | Lonza | 13-607C | |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation | Invitrogen | 114-56D | |
| Recombinant Human TGF-beta 1 | R&D Systems | 240B | |
| Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | ||
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L-23105 | |
| Mouse BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 | |
| Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 | |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | 4427975 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
References
- Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
- Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).
- Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).
- Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation. Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).
- Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
- Laurence, A., Amarnath, S., et al. STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease. Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. Immunoregulatory T cells in tumor immunity. Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).
- Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors. European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Chen, W., Jin, W., et al. Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).
- Xu, W., Lan, Q., et al. Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation. PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).
- Circosta, P., Granziero, L., et al. T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR. Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).
- Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).
- Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).
- Leon, R. P., Hedlund, T., et al. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).
- Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).
- Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model. BMC Immunology. 3, 4 (2002).
- Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation. The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).
- Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression. Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).
- Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).
- Bernard, P., Couturier, M. Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).
- Thai, T. -H., Calado, D. P., et al. Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155. Science. 316 (5824), 604-608 (2007).
- Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function. Science. 316 (5824), 608-611 (2007).
- Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).
- Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. , (2011).
