Summary
Adenovirale Gentransfer in naiven CD4-T-Zellen mit transgenen Expression des Coxsackie Adenovirus-Rezeptor ermöglicht die molekulare Analyse von regulatorischen T-Zell-Differenzierung
Abstract
Regulatorische T-Zellen (Tregs) sind unerlässlich, um Immuntoleranz auf Selbstbestimmung sowie auf bestimmte fremde Antigene zu präsentieren. Tregs kann von naiven CD4 + T-Zellen in vitro mit TCR-und Co-Stimulation in Gegenwart von TGF-und IL-2 erzeugt werden. Dies birgt ein enormes Potenzial für zukünftige Therapien, aber die Moleküle und Signalwege, die Kontrolle Differenzierung sind weitgehend unbekannt.
Primären T-Zellen können durch ektopische Expression manipuliert werden, aber üblichen Verfahren nicht die wichtigste naive Zustand der T-Zelle vor dem primären Antigen-Erkennung anzusprechen. Hier bieten wir ein Protokoll zu ektopische Gene in naiven CD4 T-Zellen exprimieren in vitro vor Induktion Treg Differenzierung. Es gilt Transduktion mit der Replikation-Adenovirus und erklärt, seine Erzeugung und Produktion. Das Adenovirus kann bis große Einsätze (bis zu 7 kb) und kann mit Promotoren ausgestattet werden, um hohe und vorübergehende Überbel erreichenression in T-Zellen. Es wandelt effektiv naive T-Zellen der Maus, wenn sie eine transgene Coxsackie Adenovirus-Rezeptor (CAR) auszudrücken. Wichtig ist, dass nach der Infektion die T-Zellen bleiben naive (CD44 niedrig, CD62L hoch) und Ruhe-(CD25 -, CD69 -) und kann aktiviert und in Tregs differenziert werden ähnlich nicht-infizierten Zellen. Somit ermöglicht dieses Verfahren Manipulation von CD4 T-Zell-Differenzierung von Anfang an. Es sorgt dafür, dass ektopische Genexpression ist bereits in Kraft, wenn sie früh signalisiert Ereignisse des ersten TCR Stimulation induziert zelluläre Veränderungen, die schließlich in Treg Differenzierung führen.
Introduction
Tregs sind entscheidend für die Immuntoleranz zu halten und überschießenden Immunreaktionen dämpfen. Tregs unterdrücken Zuschauer T-Zell-Aktivierung. Folglich führt Ablation von Tregs zu tödlichen Autoimmunität und Selbstzerstörung durch aktivierte T-Zellen 1 angetrieben. Tregs im Thymus entwickeln während negative Selektion von CD4-positiven einzigen Vorstufen, aber sie können auch in der Peripherie zu unterscheiden von naiven CD4 + T-Zellen bei niedriger Dosis Antigen-Stimulation mit suboptimalen Kostimulation 1,2. Thymic Tregs scheinen Gewebe Autoimmunität gegen Selbst-Antigene zu unterdrücken, während peripheren Tregs bei der Bereitstellung von Toleranz im Darm oder der Lunge in Verbindung gebracht haben. Diese induzierten Tregs potently verhindern T-Zell-Aktivierung nach Anerkennung ausländischer Antigene in der Schleimhaut, einschließlich Umwelt-Antigenen aus Nahrung und Luft, symbiotischer Bakterien, Allergene und 3,4. Darüber hinaus sind Tregs entscheidend für mütterliche Toleranz gegenüber fetalen Peptide 5 zu etablieren und vormontiertEntlüftung graft-versus-host disease 6. Zur gleichen Zeit, Tregs vermitteln auch unerwünschte Effekte durch Dämpfung Immunüberwachung von Tumorzellen 7,8. Das Erkennungsmerkmal der Tregs ist der Ausdruck der Teilmenge-Angabe Transkriptionsfaktor Foxp3, eine Gabel-Kopf-domain-containing Transkriptionsfaktor, der notwendig und ausreichend verleihen Treg-Funktion ist 9,10. Einige Signalwege, die Foxp3-Expression zu induzieren können, sind bekannt. Allerdings sind die molekularen Prozesse, die steuern, regulieren, modulieren oder Treg Differenzierung in Antwort auf T-Zell-Rezeptor auslöst weniger gut verstanden.
Tregs sehr effektiv in vitro durch die Stimulierung der naiven CD4 T-Zellen mit anti-CD3 und anti-CD28-Antikörper in Gegenwart von TGF-2 und IL 11 ausgelöst werden. Da die Schwellenländer Tregs in vivo, die Manipulation von Molekülen, die Treg Differenzierung zu fördern sind funktional trägt enormes Potential für zukünftige therapies z. B. die Behandlung von Asthma, Morbus Crohn, und Transplantation 11,12. Umgekehrt kann therapeutische Modulation von Molekülen an Treg Differenzierung blockieren bieten Nutzen in Zukunft Ansätze der kombinierten Behandlung von Tumorpatienten.
In vitro Differenzierung Assays sind für die Beschreibung der molekularen Veränderungen, die mit T-Zell-Untergruppe Differenzierung verbunden sind maßgeblich. Im Moment, experimentelle Versuche, Suche oder Bildschirm für die Gen-Produkte, die Kontroll-T-Zell-Differenzierung durch die Tatsache, dass die häufigsten Methoden der ektopische Genexpression in naiven T-Zellen nicht behindert werden. So sind zum Beispiel die Elektroporation und die retrovirale Transduktion nur wirksam in aktivierten T-Zellen. Im Gegensatz zu den ursprünglichen Erwartungen lentiviralen Transduktion, die in der Regel wirksam in ruhenden Zellen ist, erfordert vor Aktivierung naiver T-Zellen durch Zytokine 13. Ferner kann die Übertragung von cDNA oder mRNA bei der Elektroporationbeinhaltet Depolarisation der Zellmembran, die sich verleiht Eigenschaften der T-Zell-Aktivierung und sogar mobilisieren Ca 2 +-Signalisierung und aktivieren NFAT Proteinen (unveröffentlichte Beobachtung und ref. 14). Auch für retrovirale Transduktion haben die naiven T-Zellen für 18 aktiviert werden - 40 Stunden. Während dieser Zeit erfolgt die Auswertung der Kernmembran im Verlauf der Zellteilung ermöglicht und für die nachfolgende genomische Integration des retroviralen Vektors 15. Diese Methoden sind daher nicht in der Lage, um die frühe molekulare Regulation der ersten Begegnung mit T-Zell-Antigen, das die entscheidende Phase der Helfer-T-Zell-Differenzierung ist anzugehen.
Adenovirus-Transduktion ist bekannt, ektopische transienten Genexpression in einer Reihe von humanen Zelltypen, die den menschlichen Coxsackie-Adenovirus-Rezeptor (CAR) zum Ausdruck zu verleihen. Es geht ohne Anforderung für Zell-Aktivierung oder Zellzyklus-Progression. Die Oberflächenexpression von CAR ist von wesentlicher Bedeutung für eine effiziente Bindung und Internalisierung Virus, und transgene Expression der verkürzten Version CARΔ1 unter einem T-Zell-spezifischen Promotors wurde festgestellt, dass Mäusethymozyten und T-Zellen anfällig für Adenovirusinfektion 16 machen. Wichtig ist, dass das Transgen nicht ändern Thymozyten Entwicklung oder in vitro Differenzierung von naiven CD4-T-Zellen in verschiedene Untergruppen (Daten nicht gezeigt; ref 17.). Adenovirus-vermittelte Transduktion von T-Zellen wurde zuvor zur Überexpression 17,18 verwendet und Knock-down-Ansätze 19,20. Die transgenen T-Zellen können aus kommerziell erhältlichen DO11.10 tg gereinigt werden; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. und 17 ref.). Wichtig ist, ermöglicht adenoviralen Transduktion hohe Expression eines Gens von Interesse in naive T-Zellen zu induzieren, ohne offensichtliche Anzeichen der Aktivierung. Die T-Zellen bleiben naive (CD44 niedrig, CD62L hoch) und Ruhe-(CD25 -, CD69 -) nach infectiauf und kann aktiviert und in Treg ähnlich nicht infizierten Zellen unterschieden werden.
Herstellung von rekombinanten Adenoviren nach Transfektion von Zellen mit adenoviralen HEK293A Plasmide (Abbildung 1) erreicht werden. Diese Plasmide enthalten in der Regel den menschlichen Adenovirus Typ 5-Genom mit E1 und E3 Gene gelöscht rekombinanten Adenoviren replikationsinkompetent 21 machen. HEK293A Zellen ergänzen Replikationsdefizienz, wie sie durch stabile Integration geschert Adenovirus 22 verewigt haben. Seit Adenovirusvektoren groß (~ 40 kb) und damit nicht gut für traditionelle Restriktionsenzym-vermittelte Klonierung geeignet sind, beschäftigten wir das Gateway-System. Das Gen von Interesse wird zunächst in einem kleineren Eingangsvektor, aus dem sie leicht in das adenovirale Zielvektor über Lambda Rekombination (LR) 23 übertragen werden können kloniert. Wir konstruierten die pCAGAdDu Vektordurch die Kombination der CAG-Promotor (Huhn Actin-Promotor und CMV-Enhancer) mit einer Expressionskassette, enthaltend LR flankieren die prokaryotische ccdB Selektionsmarker 24. Diese Expressionskassette ist mit einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES-Element), die Co-Expression der eukaryontischen Infektionsmarker enhanced green fluorescent protein (eGFP), die zu einer Sequenz, die die Rinder-Wachstumshormon-poly (A)-Signal fusioniert ist ermöglicht fusioniert. Wir haben die CAG cis-regulatorische Sequenzen, da die prototypischen CMV-Promotor wurde als hoch-Aktivierung ab und sind daher ungünstig für die Genexpression in naive T-Zellen.
Hier bieten wir ein Protokoll für die effiziente in vitro Treg Differenzierung und eine Methode, um naive CD4 T-Zellen ohne Aktivierung (Abbildung 2) transduzieren. Das Verfahren ermöglicht ektopische Genexpression oder niederzuschlagen vorhergehenden CD4 T-Zell-Differenzierung bei der naiven Zustand. Es ermöglicht die Prüfung der Wirkung einer overexpressed Gen von Interesse in der frühen Signalwege beim erstmaligen TCR Stimulation bis T-Zell-Untergruppe Engagement. Unsere Validierungsexperimente auch die Grundlage, um ähnliche Adenovirus Anwendung bei der Differenzierung von anderen T-Zell-Untergruppen wie Th1, Th2, Th9, Th17, Th22 oder Tfh Zellen zu etablieren.
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Protocol
1. Klonierung eines Gens von Interesse in einem Eintrag Vector
- Klonen Sie das Gen von Interesse in einem Eintrag Vektor. PCR-Amplifikation des Gens von Blunt-End-Ligation in einem Topoisomerase-gekoppelten Vektor (zB pENTR / D-TOPO) oder Restriktionsenzym-vermittelte Klonierung kann für dieses Verfahren verwendet werden, gefolgt.
2. Die Übertragung des Gens von Interesse in der pCAGAdDu Destination Vektor
- Übertragen Sie das Gen von Interesse aus dem Eintrag in das Ziel-Vektor Vektor durch LR Rekombination (zB Gateway-LR Clonase II Enzyme Mix). Dadurch wird der adenoviralen Expressionsvektors (Abbildung 1).
- Linearisieren 10 ug des adenoviralen Expressionsvektors in einem Pacl Restriktionsverdau, die DNA auszufällen und resuspendieren in Wasser bei einer Konzentration von 3 g pro 100 ul. Linearisierung befreit die viralen invertierten Repeats (ITR), die für die Replikation und Einkapselung des v erforderlich sindIRAL DNA in Viruspartikel.
3. Die Erzeugung des Primary Viruslysat
- Seed 1 x 10 5 HEK293A Zellen in 2 ml Zellkulturmedium (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) in ein Well einer 6-Well-Platte und Inkubation der Zellen für 6 - 14 Stunden bei 37 ° C in einer 10% CO 2-Inkubator, damit sie halten. Die Zellen sollten dann bei ca. 50% Konfluenz werden.
- Lipofection: Transfer 6 ul jetPEI Reagenz in 94 ul 50 uM NaCl, kurz vortexen. In der gemischten Lösung zu 100 ul linearisierten Adenovirus-Vektor unter Vortexen und Inkubation dieses Transfektionsgemisch für 15 - 30 min bei Raumtemperatur.
Führen Sie alle folgenden Schritte unter den entsprechenden Bedingungen für Biosicherheit Adenovirus-Infektion!
- Abgeben der Lösung auf dem HEK293A Zelle enthaltende Vertiefung zugetropft und Inkubation der Zellen bei 37 ° C und 10% CO 2. Bei Verwendung eines Fluoreszenz-Marker bewerten transfektion Effizienz visuell nach 12 - 36 Stunden mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop. 0,5 ml frisches Medium alle 3 Tage.
- Überprüfen Sie jede 2 - 3 Tage mit einer leichten oder Fluoreszenzmikroskop für zytopathische Effekte (CPE), die Bereiche mit vergrößerten und abgerundeten Zellen, die zu lösen beginnen. Dies deutet auf eine effiziente Virus Generation. Beim Auftreten von breiteren Zonen der CPE (Abbildung 3), dauert es 24 bis 72 Stunden, bis alle Zellen infiziert sind.
- Wenn alle Zellen zeigen Anzeichen von CPE, aber bevor eine allgemeine Ablösung von Zellen auftritt, lösen die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren und Transfer Zellen mit Überstand (SN, 3 - 5 ml) in ein 15 ml Röhrchen Polystyrol.
- Einfrieren der Zellen in der SN auf Trockeneis für 15 - 20 min und auftauen sie schnell bei 37 ° C anschließend zum Bruch der Zellen. Wiederholen Sie diesen Frost-und Tauwetter-Zyklus (F / TC) zwei weitere Male. Halten Sie die primäre Viruslysat auf Eis für die Nutzung innerhalb eines Tages oder frieren Sie sie bei -80 ° C für die langfristige Lagerung. Jede zusätzliche F/ TC wird die Virustiter um 30 reduzieren - 50%.
4. Virus Amplification
- Seed und wachsen HEK293A Zellen 90% Konfluenz auf 14 cm Gewebekulturschale.
- Infect die Zellen mit der Hälfte der primären Virus-Lysat (1,5 - 2,5 ml) und Inkubation der Zellen für mindestens 36 Stunden. Nahezu alle Zellen sollten dann infiziert werden können, was durch Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden. Für die Re-Verstärkung eines bereits verstärkt (dh mehr konzentriert) Virus Lager, infizieren HEK293A bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 50 (siehe 6.3).
- Die Zellen sollten geerntet werden, wenn sie alle CPE zeigen aber vor Ablösung werden. Mit effizienten Virus-Produktion wird dieser Zustand innerhalb von 48 Stunden nach der Infektion erreicht. (Falls es dauert bis zu einer Woche, sollten eine weitere Runde der Verstärkung durch die Erhöhung der Menge von Adenovirus Lager für die Infektion in 4.2 beschrieben wird.)
- Lösen Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren und Transfer Zellen und SN auf eine 50 ml Tube Polystyrol. Spin Zellen nach unten bei 300 g für 10 min bei 4 ° C.
- Entfernen Sie die SN und das Pellet in einem geeigneten Volumen an Medium oder SN (ca. 1 ml).
- Führen Sie 3 F / TC, um die Zellen und Zentrifuge bei 800 g für 15 min bei 4 ° C stören Nehmen Sie den SN, dass die Viruspartikel enthält (dh die konzentrierte Viruslysat) und Aliquot der Viruslysat es bei -80 ° C lagern
5. Virus Titer Bestimmung
- Seed 10 5 A549 Zellen pro Well in 5 Vertiefungen einer Platte mit 12 Vertiefungen in 1 ml Medium und lassen Zellen 6 h lang anhaften.
- Verwenden Sie 1 ul konzentrierter Adenovirus (auf Eis aufgetaut), um eine serielle Verdünnung in Medium (1:5.000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) durchführen und mit 10 ul pro Well. Eine Vertiefung, um die infizierten Gating in der Durchflusszytometrie einzustellen.
- Nach 36 Stunden, nehmen Sie den SN, waschen mit PBS lösen und Zellen (zB durch Trypsinisierung). Für Biohazard Vorsichtsmaßnahmen, ist es empfehlenswert, c behebenEllen in 100 ul 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 min bei Raumtemperatur und Waschen mit PBS einmal.
- Führen Sie eine FACS Analyse der Infektion Marker Ausdruck. Plot 'ul Viruslysat angewendet "gegen die absolute Zahl der infizierten Zellen (Abbildung 4). Bestimmen Sie den linearen Bereich der Infektion und die Berechnung der Titer pro ml unverdünnt Virus aus der Standard-Kurve über den linearen Bereich mit x = 1.000 ul.
6. T-Zell-Infektion
- Isolieren naive / ruhenden CD4 T-Zellen aus DO11.10 tg; CARΔ1 tg Mäusen mit MACS (Naive CD4 + T-Zell-Isolation Kit II) oder FACS-Sortierung (CD4 + CD25-CD62L + CD44-).
- Für kleine Experimente, Pipette eine angemessene Lautstärke Viruslysat eine MOI von 50 in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit rundem Boden erreichen.
- Fügen Sie bis zu 4 x 10 5 T-Zellen in einem abschließenden Infektion Volumen von 50 ul in T-Zell-Medium (RPMI1640, 10% FBS, 5% PenStrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x MEM WesentlicheVitamin, 1x L-Glutamin, 1:250.000 Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
Beispiel:
Einer MOI von 50 wird verwendet, um 3 x 10 5 T-Zellen zu infizieren; das virale Titer ist 3 x 10 9 ml -1
Virus volume = MOI x T Zellzahl / virale Titer = 50 x (3 x 10 5) / (3 x 10 9 ml -1) = 0,005 ml
Hinweis: für die Infektion von größeren Zellzahlen, Scale-up mit einer MOI von 50 in einer Infektion Volumen von 165 ul pro 10 6 naiven T-Zellen in einem Polystyrol-Röhrchen mit losen cup (bis tp 3 ml pro Röhrchen).
- Inkubieren Zellen für 90 min bei 37 ° C in einer 5% CO 2-Inkubator.
- Spin down Zellen bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur ausziehen SN, in 200 ul PBS resuspendieren. Zentrifuge wieder ausziehen SN.
(Optional: die Zellen wieder gewaschen werden, um das Virus effizienter zu entfernen)
- Die Zellenin 200 ul T-Zell-Medium ohne stimulierenden Antikörpern und ohne IL-2 oder anderen Zytokinen und ruhen sie für 40 Stunden bei 37 ° C in einer 5% CO 2-Inkubator, um die Expression des Gens von Interesse vor der Aktivierung zu ermöglichen.
7. T-Zell-Aktivierung und Polarisation
- Pipette ein Volumen von anti-CD3-und anti-CD28-gekoppelten Kügelchen, die die Anzahl der Zellen (z. B. 4 x 10 5) gleich in eine kleine Tasse Reagenz, fügen Sie die 10-fache Volumen PBS und legte sie auf einem Magneten für 2 min . Nehmen Sie den Überstand und resuspendieren die Perlen in 200 ul polarisierende Medium (Tregs: T-Zell-Medium + 1 ng / ml TGF, 100 U / ml IL-2).
Hinweis: Die Zellen können auch unter Verwendung aktiviert Zellkulturschalen mit anti-CD28 und anti-CD3-Antikörper beschichtet werden, oder in einem DO11.10 T-Zell-Rezeptor-spezifische Weise unter Verwendung von bestrahlten BALB / c-Splenozyten mit Ovalbumin 323-339 Peptidantigen gepulst.
- Centrifuge die ausgeruht Zellen wie zuvor, nehmen Sie den SN und Zellen in 200 ul polarisierende Medium mit anti-CD3-und anti-CD28-Antikörper-gekoppelten Kügelchen. Inkubieren für 72 Stunden bei 37 ° C in einer 5% CO 2-Inkubator ohne Medium.
8. T-Zell-Fixierung und Färbung für die Durchflusszytometrie
- Waschen der Zellen: Spin down Zellen bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur ausziehen SN, in 200 ul PBS resuspendieren. Zentrifuge wieder ausziehen SN. Führen Sie alle folgenden Waschschritte entsprechend.
- Die Zellen in 100 ul feststellbar tot Zellfärbung Lösung und Inkubation für 30 min bei 4 ° C.
- Waschen der Zellen resuspendieren in 100 ul PBS, fügen Sie 100 ul 4% Paraformaldehyd in PBS, Inkubation 15 min bei RT.
- Waschen der Zellen resuspendieren sie in 200 ul eiskaltem 70% Methanol in PBS und Inkubation für 30 min auf Eis.
Hinweis: Die Zellen können von nun an ohne biohazard vorsorglich behandelt werden!
- Bereiten Sie 60 ul Master-Mix aus 60 ul PBS + 10 ug / ml Fc-Block (anti-FCR3 unspezifische Bindung zu blockieren). Waschen der Zellen resuspendieren sie in 40 ul PBS + Anti-FCR3 und Inkubation 15 min bei RT.
- In 20 ul PBS + Anti-FCR3 mit 1 ug PE-gekoppelten anti-Foxp3 Antikörper, gut mischen und bei 4 ° C inkubieren über Nacht.
- Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS und analysieren Zellen auf einem Durchflusszytometer.
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Representative Results
Virus Produktion
Zur Erzeugung hoher Virustiter, ist der Zeitpunkt der Zellernte HEK293A in primären Virusproduktion oder Virusamplifikation entscheidend. Repräsentative Fluoreszenz-und Phasenkontrast-Aufnahmen mit visuellen Zeichen der Virus-Produktion sind in Abbildung 3 dargestellt. Die CPE wurden 10 Tage nach der Transfektion von Zellen mit einem HEK293A Kontrolle pCAGAdDu Vektor ohne Insert beobachtet. CPE sind durch das Auftreten von Bereichen mit vergrößerten und Round-up-Zellen, die zu lösen und eine hohe Expression des GFP-Marker Infektion beginnen ist. Das Ausmaß der CPE weist auf effiziente Virus Generation. Zellkulturplatten zu ähnlichen CPE innerhalb von 24 geerntet werden können - 72 h und ein rohes Viruslysat kann durch Gefriertrocknung und-Auftau-Zyklen erzeugt werden. Der Virustiter kann dann durch serielle Verdünnung des Virus-Lysat bestimmt werden, um den Vergleich von Infektionen mit einem gleichen MOI (4) zu ermöglichen. Innerhalb des linearen Bereichs, ter Regressionsanalyse Gleichung kann verwendet werden, um die Anzahl der infektiösen Partikel pro ml unverdünnter Viruslysats berechnen. In dem Beispiel ist der Titer für x = 1 ist ul ul 30016535 -1 ≈ 3 x 10 10 ml -1.
Evaluierung der Auswirkungen der Adenovirus-Infektion auf T-Zell-Aktivierung und Differenzierung
Die Auswirkungen von Adenovirus-Transduktion auf Zielzellen haben durch Infizieren naive CD4-T-Zellen mit zunehmender MOIs mit einem adenoviralen Vektor, der Steuerung drückt nur IRES-GFP (Abbildung 5a) bewertet worden. Die Infektion Effizienz wurde durch FACS Analyse zur Bestimmung GFP positiven Zellen in festen T-Zell-Proben 72 Stunden nach Induktion von Treg Differenzierung gemessen. Die Rate der GFP positiven Zellen erhöht mit dem MOI zur Infektion und erreichte 84% Infektion bei einer MOI von 50 Jahren. Wir erhalten nicht viel höhere Prozentsätze von infizierten T-Zellen bei der Verwendung von MOI größer als 50 (Daten nicht gezeigt). Obwohl infektion Wirkungsgrad je nach dem Gen von Interesse, kann man in der Regel infizieren mehr als 50% der Zellen mit einer MOI von 50. Bei MOIs zwischen 1 und 50 die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinträchtigt (Figur 5b). Wichtig ist, dass die Stimulation und die Differenzierung von naiven T-Zellen in Tregs ähnlich in der infizierten im Vergleich zu den nicht-infizierten Zellen (Fig. 5c). Eine wichtige Eigenschaft des Adenovirus-Transduktion ist seine Fähigkeit, naive und ruhende T-Zellen ohne Übertragung oder erfordern T-Zell-Aktivierung zu infizieren. Dies ist offensichtlich aus der Analyse der Marker der T-Zell-Aktivierung (CD25, CD69, CD44) und der Markierung von naiven (CD62L) T-Zellen in Proben mit oder ohne Adenovirus-Infektion und einer Ruhepause von 40 Stunden bei 37 ° C in einer 5% CO 2-Inkubator (Abbildung 6). Vor der in vitro T-Zell-Aktivierung mit Anti-CD3 und anti-CD28-gekoppelten Kügelchen wurden die infizierten und nicht-infizierten T-Zellen CD25 ähnlich niedrig, niedrig CD69 und CD44 low aber CD62L hoch, demonstrieren ihre naive und Ruhezustand (Abbildung 6, obere Felder). Bei T-Zell-Aktivierung zeigten die infizierten Zellen Hochregulation der Aktivierung CD25, CD69 und CD62L Herabregulation der kaum zu unterscheiden von nicht-infizierten Zellen (Abb. 6, untere Reihe). Somit wird der Aktivierungszustand der T-Zellen nicht von Adenovirus-Infektion verändert. 20% tote Zellen 40 Stunden nach der Aktivierung ohne Rast - Die Ruhephase ist mit dem Verlust von 60 bis 70% der Zellen aufgrund der Abwesenheit von Wachstumsfaktoren oder Cytokine, im Vergleich zu 10 verbunden. Dies wurde berücksichtigt, wenn die Auswahl der anfänglichen Zellzahl von 3 x 10 5 Zellen.
Auswertung der Überexpression eines Gens in der Nähe
Um die Menge der Überexpression von adenoviralen Gentransfer erreicht auszuwerten, versuchten wir, die microRNA-155 (miR-155) Expression in naiven T-Zellen zu bestimmen, dass manneu infiziert mit miR-155-Expression oder Kontroll-Adenovirus oder blieben nicht infizierten. Wir entschieden uns für miR-155, da diese reifen miRNA auf moderatem Niveau in naiven T-Zellen exprimiert wird, und wird stark von T-Zell-Aktivierung induziert. Darüber hinaus hat es eine entscheidende Rolle bei der T-Zell-abhängige humorale Antworten 25,26.
Die Höhe der microRNA Überexpression wurde durch qPCR ausgewertet. Nach der Infektion wurden die Zellen für 40 Stunden ruhte, aktiviert für 40 Stunden oder 40 Stunden ausgeruht nach 40 Stunden der Aktivierung gefolgt. Nach 40 Stunden ruhen, die naive T-Zellen mit miR-155-Kodierung Virus infiziert zeigte eine etwa 17-fache Überexpression von miR-155 im Vergleich zu Zellen, die mit Kontrollvirus oder nicht-infizierten Zellen (7) infiziert. Diese fast den Umfang abgestimmt auf denen die endogenen miR-155 ist nach T-Zell-Aktivierung (Abbildung 7 und ref. 25,27) induziert. Unabhängig von dieser starke Induktion der endogenen miR-155 Ebenen, Zellen mit mi infiziertR-155 Adenovirus zeigte noch etwa vierfache Erhöhung der Expression von miR-155 nach der Aktivierung im Vergleich zu Virus-infizierten oder nicht infizierten Zellen zu steuern. Die beobachtete Niveau der ektopischen Überexpression war vergleichbar für andere microRNAs (Daten nicht gezeigt). Bitte beachten Sie, dass für große Einsätze, Überexpression weniger wirksam sein können.
Die Analyse der T-Zell-Differenzierung
Die Datenanalyse kann auf verschiedene Arten durchgeführt werden. Analyse der Differenzierung der GFP positive Gate eines Gens von Interesse (dh in den infizierten Zellen) verglichen, um die Differenzierung in der gleichen GFP positive Gate Kontrollzellen (infizierten Zellen mit einem Vektor ohne Gen von Interesse) ausreicht, um wesentliche Unterschiede zu erkennen. Weniger ausgeprägte Wirkungen eines Gens von Interesse zu untersuchen, haben wir die Differenzierung in infizierten Zellen mit der von nicht-infizierten Zellen, die aus dem gleichen Schacht (8) verglichen. Dies als interne contro dienenl und kann genutzt werden, um die "relative Differenzierung" innerhalb eines genau zu berechnen. Wenn ein Virus hat keinen Einfluss auf die Differenzierung, wird die "relative Differenzierung" idealerweise 1 sein. Die relative Differenzierung zur Steuerung Virus in der Hand hat einen Bereich von 0,9 bis 1,1. Relative Differenzierung sollte nur auf den Vergleich Gen-interessant-infizierten Proben Virus-infizierten Proben Kontrolle angewendet werden.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des Adenovirus Generation. Eintrag Vektoren (pENTR) enthalten Rekombination Donorstellen (AttL1, AttL2), die Flanke eines Gens von Interesse. Das Ziel Vektor pCAGAdDu enthält die Rekombination Zielorten (attr1, attr2) flankieren das Toxin CcdB Gen für negative Selektion in E. coli, das von dem Gen von Interesse ersetzt wirddurch LR Rekombination. Das Ziel Vektor enthält auch eine menschliche Adenovirus Typ 5 Genom ohne E1/E3 Gene, die gelöscht wurden, um replikationsdefizient rekombinanten Adenoviren zu erzeugen. Pacl Linearisierung befreit invertierten Wiederholungen (ITR) vor der Transfektion in HEK293A Zellen, die die adenoviralen Gene zu erzeugen infektiöse tragen Adenovirus Teilchen, die sich in zytopathischen Wirkungen. Adenovirus wird von produzierenden Zellen durch Einfrieren und Auftauen und geerntet. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 2. Schematische Darstellung der T-Zell-Infektion und Differenzierung. Naive T-Zellen mit einem Adenovirus Lysat 1,5 Stunden infiziert, gewaschen mit PB S und ausgeruht in T-Zell-Medium für 40 Stunden bei 37 ° C in einer 5% CO 2-Inkubator. Die Zellen wurden dann 72 Stunden lang unter Verwendung von anti-CD28 und anti-CD3-Antikörper-gekoppelten Kügelchen in der Anwesenheit von TGF und IL-2 aktiviert. Fixierten und gefärbten Zellen wurden durch FACS analysiert, und die Expression von Foxp3 in infizierten im Vergleich zu nicht-infizierten Zellen wurde bestimmt.
Abbildung 3. Zytopathischer Wirkung der Adenovirus-produzierenden Zellen HEK293A. Auftreten von CPE an Tag zehn nach der Transfektion von 10 5 HEK293A Zellen mit 3 ng linearisierter pCAGAdDu Vektor. Die linke Tafel zeigt die Phase Kontrast Bild zeigt das rechte Fenster die grüne Fluoreszenz.
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Abbildung 4. Bestimmen des Titers von Adenovirus-Lysaten durch Infektion von A549-Zellen. 10 5 A549-Zellen wurden mit den angegebenen Viren infiziert Verdünnung inkubiert für 48 Stunden und analysiert die Expression des GFP-Marker Infektion durch Durchflusszytometrie. Die Zahl der GFP-positiven Zellen gegen die Menge des Virus verwendet aufgetragen. Der Titer unverdünnt Virus aus der Standard-Kurve über den linearen Bereich mit x = 1.000 ul berechnet.
Abbildung 5. Adenovirus-Infektion bei einer MOI von 1 - 50 hat keinen Einfluss auf die T-Zell-Lebensfähigkeit oder Treg Differenzierung naiver T-Zellen gereinigt aus DO11.10 tg; CARΔ1 tg-Mäusen wurden mit Adenovirus an unterschiedlichen MOI infiziert.für 90 min mit PBS gewaschen und ausgeruht für 40 h in T-Zell-Medium. Die Zellen wurden in Treg polarisierenden Bedingungen für 72 Stunden aktiviert. Feste und gefärbten Zellen wurden für den Einbau von toten Zellen Farbstoff (b), Ausdruck der Infektion Marker GFP (a) und der Differenzierung Marker Foxp3 (c) analysiert. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 6. Adenovirus-Infektion ändert nichts an der Aktivierung von T-Zellen Status Naive T-Zellen aus DO11.10 tg;. CARΔ1 tg Mäuse wurden mit Adenovirus mit einer MOI von 50 für 90 min (Linien) oder links infizierten (Flächen) infiziert, mit PBS gewaschen und ruhte für 40 Stunden. Die Zellen wurden für expre analysiertssion der Aktivierung Marker vor (obere Felder) und nach (untere Reihe) 40 Stunden der Aktivierung in Treg polarisierenden Bedingungen.
Abbildung 7. . Relative miR-155 Überexpression vor und nach der T-Zell-Aktivierung von naiven T-Zellen DO11.10 tg; CARΔ1 tg-Mäuse wurden mit einer MOI von 50 mit microRNA-155 infiziert (miR-155)-exprimierenden oder Kontroll-Adenovirus oder links infiziert. Die Zellen wurden dann für 40 Stunden ruhte, aktiviert für 40 Stunden oder 40 Stunden ausgeruht um 40 hr Aktivierung gefolgt. Expression von microRNA-155 wurde gegenüber SnoRNA202 durch qPCR bestimmt.
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Discussion
Virus Generierung und Titration
Für eine optimale Transfektion Ergebnisse scheinen die Qualität und Menge der linearisierte Vektor wichtigste. Konnten wir nicht beobachten negative Auswirkungen auf die primären Lysat Produktion von einer anfänglichen Überwucherung der Kultur seit der Infektion schnell gehen wird, sobald effiziente Virus-Produktion auftritt. Virus kann jedoch die Produktion um HEK293A Zellen durch lange Einsätze, die die Effizienz verringern betroffen sein. Einige offene Leserahmen wurden tatsächlich festgestellt, dass Virus-Produktion stören. Diese viralen Bestände können in der Regel über mehrere Runden von Verstärkung gerettet werden, und nur wenige offene Leserahmen erwiesen sich als unvereinbar mit Virus-Produktion. Aus unserer Erfahrung ist das Aussehen von CPE innerhalb von 48 Stunden nach der Infektion für Virusamplifikation liefern typischerweise einen Viruslysat von ca. 1 x 09-5 Oktober x 10 10 infektiösen Partikeln / ml.
Adenovirus-Infektion von naiven T-Zellen
Adenovirus-Infektion von naiven T-Zellen nicht ändert den Aktivierungsstatus von T-Zellen vor und nach der Stimulation. Dies macht die Transduktionssystem ein leistungsfähiges Werkzeug für die experimentelle Untersuchung von T-Zell-Differenzierung anfänglichen TCR-Stimulation auf. Wir haben effiziente ektopische Expression von Genen von Interesse nach der Infektion und 'ruhenden' von T-Zellen für 40 Stunden, zu einer Zeit bestimmt, wenn sich die Zelle noch naiv und keine Anzeichen der Aktivierung. Dies bedeutet, dass während des nachfolgenden T-Zell-Aktivierung, das Gen von Interesse bereits überexprimiert wird und sein Einfluss auf T-Zell-Differenzierung von Anfang auszuüben. Somit hat adenoviralen Transduktion einen klaren Vorteil gegenüber Elektroporation oder retrovirale Transduktion die aktiviert werden müssen und zum Ausdruck eines Gens von Interesse nur nach anfänglichen TCR-Signal 15,28. Allerdings, wenn spät Aspekte der Differenzierung wird analysiert und die Expression des Gens von Interesse ist nicht vor der ersten T-Zell-activ erforderlichation, können naive T-Zellen als auch direkt nach der adenoviralen Transduktion stimuliert werden. Seit adenoviralen Infektion ist sehr effizient, es kann erweitert werden, um kooperative Aktivitäten zweier Gene von Interesse, indem Sie doppelt Infektionen mit Adenoviren, die andere Infektionsmarkern wie Thy1.1 oder hCD2 ausdrücken zu studieren. Letzteres ist auch zugänglich Antikörper Oberflächenfärbung und kann Schwierigkeiten bei Erhaltung Marker während der Fixierung zu umgehen. In aktivierten T-Zellen hat jedoch adenoviralen Infektion eine viel geringere Effizienz und Elektroporation oder retroviraler Transduktion Verfahren kann günstig sein. Eine weitere Einschränkung für Adenovirus Anwendung ist die vorübergehende Charakter des Ausdrucks. Adenovirus als ein Episom an der Kernmatrix der Zelle beibehalten wird und verdünnt als T-Zellen proliferieren, die zum Verlust von Marker-Gen-Expression innerhalb von fünf bis sieben Tage nach der T-Zell-Aktivierung (Daten nicht gezeigt. Ref 17) werden. Außerdem Adenovirus-transduzierten Zellen sind readily erkannt und durch ein intaktes Immunsystem, was ihre Verwendung in vivo begrenzt, zum Beispiel in der adoptiven Transfer von T-Zellen Versuche in der Maus eliminiert. Eine weitere mögliche Anwendung des adenoviralen System könnte die Infektion von Treg-Zellen aus DO11.10 tg isoliert sein; CARΔ1 tg Mäusen Treg-Funktion oder Stabilität Linie Aspekte studieren.
Validierung von Adenovirus Auswirkungen auf infizierten Zellen
Adenovirus-Infektion war effizient und hatte fast keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen und T Treg Differenzierung. Bei einer MOI von 50, erhalten wir die beste Infektionseffizienz ohne Einhaltung negativen Auswirkungen der Adenovirus-Infektion auf T-Zellen. Dies hat in ähnlicher Weise hergestellt werden, wenn das System auf andere Zellkultur oder Differenzierung Zustand angelegt wird, in der Regel durch Titration mit leeren Adenovirus ohne die Expression des Gens von Interesse. Wenn der adenoviralen Infektion als solche hat Auswirkungen auf das Ergebnis des Experiments,der Vergleich der Gen von verzinslichen Adenovirus mit leeren Adenovirus noch angemessen ist, um Effekte des übertragenen Gens von Interesse zu entdecken. Wenn es keine Wirkung der Adenovirus-Infektion, können die gemessenen Parameter auch zwischen nicht-infizierten und infizierten Zellen der gleichen Probe verglichen werden.
Data Analysis
Die Fixierung hier beschriebene Methode ermöglicht eine gleichzeitige Analyse der Differenzierung Marker Foxp3 zusammen mit der Infektion Marker GFP, so dass eine "relative Differenzierung" bestimmt werden kann. Diese Analyse der beiden Populationen innerhalb einer Probe eine höhere Sensitivität für subtile Effekte als Massenpopulation Vergleiche zwischen zwei Proben, da es gut-zu-gut Variationen berücksichtigt. Allerdings wird nur eigentümlichen Wirkungen infizierten Zellen durch dieses Verfahren anerkannt werden, während gut breiten Effekte, zB Einflüsse durch einen Faktor abgesondert ausgeübt wird, würde vernachlässigt werden. Relative Differenzierung sollte in jedem gesteuert werdenExperiment einschließlich der Kontrolle-infizierten Zellen, um Effekte der Infektion selbst auf die Differenzierung auszuschließen. Für optimale Ergebnisse sollte ein fast gleich von infizierten auf nicht infizierte Zellen innerhalb einer Probe angestrebt werden, während höhere Infektionsraten in bulk Vergleiche zwischen mehreren Proben sind günstig.
Abschließend Gentransfer in naiven T-Zellen mit Adenovirus mit in vitro Differenzierung Protokolle kombiniert ist ein leistungsstarkes System, um die molekularen Grundlagen der Treg-Differenzierung zu untersuchen. Dies könnte die Generierung von Wissen, um die dominante Toleranz von Tregs in therapeutische Ansätze gegen Allergien und Autoimmunerkrankungen übertragenen auszunutzen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Lirui Du für den Bau des pCAGAdDU Vektor und Oliver Gorka für die Bereitstellung der Fixierung Protokoll danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| PacI | New England Biolabs | R057S | |
| jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N | |
| HEK293A Cell Line | Invitrogen | R705-07 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 14 cm tissue culture dish | Nunc | 168381 | |
| BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr | Taconic Farms | Model Nr. 4285 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 | |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| NaPyruvate | Lonza | BE13-115E | |
| NEAA 100x | Lonza | BE13-114E | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Invitrogen | 15630-056 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | |
| MEM Essential vitamin mixture (100x) | Lonza | 13-607C | |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation | Invitrogen | 114-56D | |
| Recombinant Human TGF-beta 1 | R&D Systems | 240B | |
| Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | ||
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L-23105 | |
| Mouse BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 | |
| Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 | |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | 4427975 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
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