Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Adenoviral transduktion af Naive CD4 T-celler til at studere Treg Differentiering

Published: August 13, 2013 doi: 10.3791/50455
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Molecular Immunology, Helmholtz Zentrum München

Summary

Adenoviral genoverføring i naive CD4 T-celler med transgen ekspression af Coxsackie adenovirus receptoren muliggør molekylær analyse af regulatoriske T-celle differentiering

Abstract

Regulatoriske T-celler (tregs) er vigtigt at give immuntolerance over for selv samt til visse fremmede antigener. Tregs kan genereres fra naive CD4 T-celler in vitro med TCR-og co-stimulering i nærvær af TGFp og IL-2. Det bærer et enormt potentiale for fremtidige behandlinger dog molekylerne og signalveje, der kontrollerer differentiering er stort set ukendte.

Primære T-celler kan manipuleres gennem ektopisk genekspression, men fælles metoder undlader at målrette den vigtigste naive tilstand af T-celle forud for primær antigengenkendelse. Her giver vi en protokol til at udtrykke ektopiske gener hos naive CD4 T-celler in vitro, før induktion Treg differentiering. Den anvender transduktion med replikationsdefekt adenovirus og forklarer dets produktion og produktion. Adenovirus kan tage op store indsatser (op til 7 kb), og kan udstyres med initiativtagere at opnå en høj og forbigående overexpression i T-celler. Det effektivt transducerer naive mus T-celler, hvis de udtrykker en transgen Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Vigtigere er det, efter infektion af T-cellerne forbliver naiv (CD44 lav, CD62L høj) og hvile (CD25 -, CD69 -) og kan aktiveres og differentierede til tregs minder om ikke-inficerede celler. Således er denne metode giver mulighed manipulation af CD4 T-celle differentiering lige fra begyndelsen. Det sikrer, at ektopisk genekspression er allerede på plads, når tidlige signalering begivenheder i det oprindelige TCR stimulering inducerer cellulære ændringer, der i sidste ende føre til Treg differentiering.

Introduction

Tregs er afgørende at fastholde immun tolerance og til at dæmpe overskridelse immunrespons. Tregs undertrykke tilskuer T-celleaktivering. Derfor ablation af tregs fører til fatal autoimmunitet og selvdestruktion drevet af aktiverede T celler 1.. Tregs udvikle sig i thymus under negativ selektion af CD4 enkelt-positive prækursorer, men de kan også differentiere i periferien fra naive CD4 T-celler upon lavdosis antigenstimulering med suboptimal co-stimulation 1,2. Thymisk tregs synes at undertrykke væv autoimmunitet mod selv-antigener, mens perifer tregs har været impliceret i at yde tolerance i tarmen eller lungerne. Disse inducerede tregs potente forhindre T-celle aktivering efter indregning af udenlandske antigener i slimhinden, herunder miljø-antigener fra fødevarer og luft, kommensale bakterier og allergener 3,4. Desuden er tregs afgørende at etablere maternel tolerance over føtale peptider 5 og til preaftræk graft-versus-host sygdom 6.. På samme tid, også tregs medierer uønskede virkninger ved at dæmpe immunovervågning af tumorceller 7,8. Kendetegnet træk tregs er udtryk for delmængde-angivelse transskription faktor Foxp3, en gaffel-head domæne-holdige transskription faktor, der er nødvendig og tilstrækkelig til at give Treg funktion 9,10. Nogle signalveje, der kan fremkalde Foxp3 udtryk er kendt. Imidlertid er de molekylære processer, der styrer, regulerer eller modulerer Treg differentiering i respons på T-celle receptoren udløser mindre godt forstået.

Tregs kan meget effektivt induceres in vitro ved stimulering af naive CD4 T-celler med anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer i nærvær af TGFp og IL-2 11. Som det spirende tregs er funktionelle in vivo, manipulation af molekyler, der fremmer Treg differentiering bærer et enormt potentiale for fremtidig therapies, f.eks. behandling af astma, Crohns sygdom, og transplantation 11,12 Omvendt kan terapeutisk modulation af molekyler til at blokere Treg differentiering giver fordele i fremtidige tilgange kombineret behandling af tumor patienter.

In vitro differentiering assays har været medvirkende til beskrivelse af molekylære ændringer, der er forbundet med T-celle delmængde differentiering. I øjeblikket. Eksperimentelle forsøg på søgning eller screene for genprodukter, der styrer T-celle differentiering er hæmmet af, at de mest almindelige metoder til ektopisk genekspression mislykkes i naive T-celler For eksempel er elektroporation og retroviral transduktion kun effektiv i aktiverede T-celler. I modsætning til de oprindelige forventninger, lentiviral transduktion, som typisk er effektiv i hvilende celler, kræver forudgående aktivering af naive T-celler ved cytokiner 13.. Endvidere overførsel af cDNA eller mRNA under elektroporationinvolverer depolarisering af plasmamembranen, som selv giver funktioner af T-celleaktivering, og kan endda mobilisere Ca 2 +-signalering og aktivere NFAT proteiner (upubliceret observation og ref. 14). Tilsvarende for retroviral transduktion, har den naive T-celler, der skal aktiveres i 18-40 timer. I løbet af denne tid sker en opdeling af kernemembranen under celledeling og muliggør efterfølgende genomisk integration af den retrovirale vektor 15.. Disse metoder er derfor ikke i stand til at løse den tidlige molekylære regulering af indledende T-celle møde med antigen, der er den afgørende fase af hjælper-T-celle differentiering.

Adenoviral transduktion er kendt for at give forbigående ektopisk genekspression i en række humane celletyper, der udtrykker den humane Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Den fortsætter uden krav om celleaktivering eller cellecyklusfremadskriden. Overfladen ekspression af CAR er afgørende for effektiv virus fastgørelse og internalisering, og transgene ekspression af den trunkerede version, CARΔ1 under en T-celle-specifik promotor blev fundet at gøre musethymocytter og T-celler er modtagelige for adenovirusinfektion 16. Vigtigt er transgenet ikke ændre thymocyt udvikling eller in vitro differentiering af naive CD4 T-celler i forskellige undergrupper (data ikke vist, ref 17..). Adenovirus-medieret transduktion af T-celler er tidligere blevet anvendt til overekspression 17,18 og knock-down-tilgange 19,20. De transgene T-celler kan oprenses fra kommercielt tilgængeligt DO11.10 TG, CARΔ1 tg (Taconic, Inc. og ref 17..). Vigtigere er, adenoviral transduktion muliggør høj ekspression af et gen af ​​interesse i naive T-celler uden at inducere tydelige tegn på aktivering. T-cellerne forbliver naive (CD44 lav, CD62L høj) og hvile (CD25 -, CD69 -) efter infectipå og kan aktiveres og differentierede til Treg minder om ikke-inficerede celler.

Produktion af rekombinante adenovira kan opnås efter transfektion af HEK293A celler med adenovirale plasmider (figur 1). Disse plasmider indeholder typisk human type 5 adenovirus genomet med E1-og E3 deleteret at gøre rekombinante adenovira replikation-inkompetente 21. HEK293A celler supplerer replikation mangel, som de er blevet udødeliggjort gennem stabil integration af klippet adenovirus 22.. Da adenovirusvektorer er store (~ 40 kb) og følgelig ikke velegnet til traditionel restriktionsenzym-medieret kloning, anvendte vi Gateway systemet. Genet af interesse er først klonet ind i en mindre post vektor, hvorfra det let kan overføres til den adenovirale destination vektor via lambda rekombinationsreaktion (LR) 23. Vi konstrueret pCAGAdDu vektorenved at kombinere CAG promotor (kylling actinpromotoren og CMV-enhanceren) med en ekspressionskassette indeholdende LR flankerer den prokaryote CCDB selektionsmarkør 24. Denne ekspressionskassette fusioneret til et internt ribosomindgangssted (IRES) element, der tillader coekspression af eukaryote infektion markør forstærket grønt fluorescerende protein (eGFP), der er fusioneret til en sekvens indeholdende bovint væksthormon poly (A)-signal. Vi valgte CAG cis-regulatoriske sekvenser, da prototypisk CMV-promotoren blev fundet at være meget aktiveringen afhængige og derfor ugunstig for genekspression i naive T-celler.

Her giver vi en protokol til effektiv in vitro Treg differentiering og en fremgangsmåde til at transducere naive CD4 T-celler uden aktivering (fig. 2). Metoden giver mulighed for ektopisk genekspression eller vælte foregående CD4 T-celle differentiering på naive tilstand. Det gør det muligt at teste virkningen af ​​en overexpressed gen af ​​interesse i den tidlige signaleringsbegivenheder upon indledende TCR stimulering indtil T-celle delmængde engagement. Vores validering eksperimenter også give et grundlag for at etablere tilsvarende adenovirus anvendelse i differentieringen af ​​andre T-celle delmængder såsom Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, eller TFH celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Kloning af et gen af ​​interesse i en indtastning Vector

  1. Klone genet af interesse ind i en post vektor. PCR-amplifikation af genet efterfulgt af stump-ende-ligering ind i en topoisomerase-koblet vektor (f.eks pENTR / D-TOPO) eller restriktionsenzym-medieret kloning kan anvendes til denne procedure.

2.. Overførsel af genet af interesse i pCAGAdDu Destination Vector

  1. Overfør genet af interesse fra posten vektor i destinationen vektor af LR rekombination (f.eks Gateway LR Clonase II Enzyme Mix). Dette vil skabe den adenovirale ekspressionsvektor (figur 1).
  2. Linearisere 10 ug af den adenovirale ekspressionsvektor i en Pacl restriktionsfordøjelse, udfælde DNA og resuspender den i vand ved en koncentration på 3 ug pr 100 gl. Linearisering frigiver de virale omvendte repetitioner (ITR), som er nødvendige for replikation og indkapsling af viral DNA i viruspartikler.

3.. Generering af Primary Virus Lysate

  1. Seed 1 x 10 5 HEK293A celler i 2 ml cellekulturmedier (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) i en brønd af en 6-brønds plade og inkuber cellerne i 6-14 timer ved 37 ° C i en 10% CO 2 inkubator for at tillade dem at overholde. Cellerne bør derefter være på omkring 50% konfluens.
  2. Lipofection: Overførsel 6. pi jetPEI reagens i 94 pi 50 uM NaCl, vortex kortvarigt. Tilføj den blandede opløsning til 100 ul lineariseret adenovirusvektor medens der blev hvirvelbehandlet og inkuber denne transfektion blandes i 15 - 30 minutter ved stuetemperatur.

Udfør alle følgende trin under de relevante biosikkerhed betingelser for adenovirusinfektion!

  1. Dispensere opløsningen dråbevis på HEK293A celleholdig brønd og inkuber cellerne ved 37 ° C og 10% CO2. Når du bruger en fluorescens markør, evaluere transfeIndsatsen effektivitet visuelt efter 12-36 timer ved hjælp af en inverteret fluorescensmikroskop. Tilsæt 0,5 ml frisk medium hver 3. dag.
  2. Check hver 2 - 3 dage med en lys eller fluorescens mikroskop for cytopatiske virkninger (CPE), der er områder med forstørrede og afrundede celler, der begynder at løsne sig. Det er betegnende for en effektiv virus generation. Ved forekomst af bredere zoner af CPE (figur 3), vil det tage 24 - 72 hr, før alle celler er smittet.
  3. Når alle celler viser tegn på CPE, men før en samlet adskillelse af celler sker, frigøre cellerne ved forsigtig pipettering og overførsel celler med supernatanten (SN, 3 - 5 ml) til en 15 ml polystyren rør.
  4. Fryse cellerne i SN på tøris i 15 - 20 minutter og tø dem hurtigt ved 37 ° C bagefter at sprænge cellerne. Gentag denne fryse-og-tø-cyklus (F / TC) to gange mere. Hold primære virus lysatet på is til brug inden for en dag eller fryse det ved -80 ° C til langtidsopbevaring. Enhver yderligere F/ TC vil reducere virustiter med 30 - 50%.

4.. Virus Amplification

  1. Frø og vokse HEK293A celler til 90% konfluens på en 14 cm vævsdyrkningsskål.
  2. Inficere cellerne med halvdelen af ​​den primære virus lysat (1,5 - 2,5 ml) og inkuber cellerne i mindst 36 timer. Næsten alle celler inficeret så, hvilket kan bestemmes ved fluorescensmikroskopi. For re-forstærkning af et allerede forstærket (dvs. mere koncentreret) virus bestand, inficere HEK293A ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 50 (se 6.3).
  3. Cellerne skal høstes, når alle af dem viser CPE men før udstationering. Med en effektiv virus produktion denne tilstand er nået inden for 48 timer efter infektion. (Hvis det tager op til en uge, overveje en anden runde af amplifikation ved at øge mængden af ​​adenovirus materiel for infektionen beskrevet i 4.2.)
  4. Frigør cellerne ved forsigtig pipettering og overførsel celler og SN til en 50 ml polystyrenrør. Spin celler ned ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
  5. Fjern SN og pellet resuspenderes i en passende mængde medium eller SN (ca. 1 ml).
  6. Udfør 3 F / TC at sprænge cellerne og centrifugeres ved 800 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Tag SN der indeholder viruspartiklerne (dvs. koncentreret virus lysat), og alikvot virus lysat at opbevare det ved -80 ° C.

5.. Virustiter Bestemmelse

  1. Seed 10 5 A549-celler per brønd i 5 brønde af en 12-brønds plade i 1 ml medium og lad cellerne adhærere i 6 timer.
  2. Brug 1 ml af koncentreret adenovirus (optøet på is) for at udføre en seriel fortynding i medium (1:5000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) og tilsæt 10 pi per brønd. Efterlad en brønd uinficeret at justere gating i flowcytometri.
  3. Efter 36 timer, tag SN, vaskes med PBS og frigøre celler (f.eks ved trypsinisering). For smittefarligt forholdsregler, anbefales det at fastsætte calen i 100 pi 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur og vaskes med PBS én gang.
  4. Udfør en FACS analyse af infektion markør udtryk. Plot 'pi viruslysat anvendes «mod det absolutte antal inficerede celler (figur 4). Bestem det lineære område af infektion og beregne titeren pr ml ufortyndet virus fra standardkurven over lineære område med x = 1,000 pi.

6.. T-celle Infektion

  1. Isoler naive / hvilende CD4 T-celler fra DO11.10 TG, CARΔ1 tg mus ved anvendelse MACS (Naive CD4 + T-celle Isolation Kit II) eller FACS sortering (CD4 + CD25-CD62L + CD44-).
  2. For små eksperimenter, pipette en passende mængde viruslysat at opnå en MOI på 50 i en brønd på en 96-godt rund bundplade.
  3. Tilføj op til 4 x 10 5 T-celler i et endeligt infektion volumen på 50 pi i T-celle medium (RPMI1640, 10% FBS, 5% PenStrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x MEM Essentialvitamin, 1x L-Glutamin, 1.250.000 mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
    Eksempel:
    En MOI på 50 skal anvendes til at inficere 3 x 10 5 T-celler; den virale titer er 3 x 10 9 ml -1
    Virus volumen = MOI x T-celle nummer / virustiter = 50 x (3 x 10 5) / (3 x 10 9 ml -1) = 0,005 ml

Bemærk: For smitte af større celle numre, opskalerings bruge en MOI på 50 i en infektion volumen på 165 ul pr 10 6 naive T-celler i en polystyrenrør med løs kop (op tp 3 ml per rør).

  1. Cellerne inkuberes i 90 minutter ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
  2. Spin ned cellerne ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur, take off SN, resuspender i 200 pi PBS. Centrifugeres igen og tage ud SN.

(Valgfrit: cellerne kan vaskes igen for at fjerne virus mere effektivt)

  1. Resuspender cellernei 200 pi T-celle medium uden stimulerende antistoffer og uden IL-2 eller andre cytokiner og hvile dem i 40 timer ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator for at tillade ekspression af genet af interesse før aktivering.

7.. T-celleaktivering og polarisering

  1. Pipette en mængde af anti-CD3-og anti-CD28-koblede perler, der svarer til celle nummer (f.eks 4 x 10 5) i en lille reagens kop, tilsæt 10-fold volumen PBS og læg dem på en magnet for 2 min . Tag supernatanten og resuspender perlerne i 200 pi polariserende medium (tregs: T-celle medium + 1 ng / ml TGFp, 100 U / ml IL-2).

Bemærk: Celler kan også aktiveres ved hjælp af vævskulturplader coatet med anti-CD28 og anti-CD3-antistoffer, eller i en DO11.10 T-celle-receptor-specifik måde ved hjælp af bestrålede BALB / c-splenocytter pulset med ovalbumin 323-339 peptidantigen.

  1. Centrifuge den hvilede celler som før, tag SN og resuspender celler i 200 pi polariserende medium indeholdende anti-CD3-og anti-CD28-antistof-koblede perler. Inkuber i 72 timer ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator uden at ændre medie.

8.. T-celle fiksering og farvning for Flowcytometri

  1. Vask cellerne: Spin ned celler ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur, take off SN, resuspender i 200 pi PBS. Centrifugeres igen og tage ud SN. Udfør alle følgende vasketrin i overensstemmelse hermed.
  2. Cellerne i 100 pi fixable døde cellefarvning opløsning og inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C.
  3. Vask cellerne, resuspenderes i 100 pi PBS, tilsættes 100 pi 4% paraformaldehyd i PBS, inkuberes 15 minutter ved stuetemperatur.
  4. Vask cellerne, resuspenderes dem i 200 pi iskold 70% methanol i PBS og inkuberes i 30 minutter på is.

Bemærk: Celler kan behandles fra nu af uden biologisk forholdsregler!

  1. Forbered 60 pi mester-mix på 60 pi PBS + 10 ug / ml Fc-blok (anti-FCR3 at blokere uspecifik binding). Vask cellerne, resuspenderes dem i 40 pi PBS + anti-FCR3 og inkuberes 15 minutter ved stuetemperatur.
  2. Tilsæt 20 ul PBS + anti-FCR3 indeholdende 1 ug PE-koblet anti-Foxp3 antistof, bland godt og inkuber ved 4 ° C natten over.
  3. Vask cellerne to gange i PBS og analysere celler på et flowcytometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Virusproduktion

For generation af high virustitere er timingen af ​​HEK293A cellehøst i den primære virus produktion eller virus forstærkning afgørende. Repræsentative fluorescerende og fasekontrast billeder med visuelle tegn på virus produktion er vist i figur 3.. CPE blev observeret 10 dage efter transfektion af HEK293A celler med en kontrolgruppe pCAGAdDu vektor uden indsats. CPE er kendetegnet ved fremkomsten af ​​områder med forstørrede og round-up celler, der begynder at frigøre og udviser høj ekspression af infektionen markør GFP. Omfanget af CPE er indikativ for en effektiv virus generation. Cellekulturplader viser lignende CPE kan høstes inden 24 - 72 hr, og en rå virus lysat kan dannes ved fryse-og-tø. Virustiteren kan derefter bestemmes ved seriel fortynding af virus lysat give mulighed for sammenligning af infektioner med en lige MOI (figur 4). Inden for det lineære område, than regressionsanalyse ligning kan anvendes til at beregne antallet af infektiøse partikler per ml ufortyndet virus lysat. I eksemplet = 1 pi titeren for x er 30016535 gl -1 ≈ 3 x 10 10 ml -1.

Evaluere virkningen af ​​adenovirusinfektion på T celle aktivering og differentiering

Virkningerne af adenovirus transduktion på målceller er blevet evalueret ved at inficere naive CD4 T-celler med stigende MOI hjælp af en adenoviral kontrol vektor, som kun udtrykker IRES-GFP (figur 5a). Infektionen effektivitet blev målt ved FACS-analyse til bestemmelse GFP positive celler i faste T celleprøver 72 timer efter induktion af Treg differentiering. Satsen for GFP-positive celler steg med MOI anvendes til infektion og nåede 84% infektion ved en MOI på 50 år. Vi får ikke meget højere procentdele af inficerede T-celler ved anvendelse af MOI større end 50 (data ikke vist). Selvom infeIndsatsen effektivitet kan variere afhængigt af genet af interesse, kan man typisk inficere mere end 50% af cellerne ved en MOI på 50 år. Ved MOI mellem 1 og 50 cellelevedygtigheden blev ikke påvirket (figur 5b). Vigtigere er det, stimulering og differentiering af naive T-celler i tregs var ens i det inficerede forhold til de ikke-inficerede celler (fig. 5c). En vigtig egenskab af adenovirus transduktion er dens evne til at inficere naive og hvilende T-celler uden at give eller kræver T-celleaktivering. Dette er indlysende fra analysen af ​​markører for T-celleaktivering (CD25, CD69, CD44) og markør af naive (CD62L) T-celler i prøver med eller uden adenovirus infektion og hvile i 40 timer ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator (figur 6). Før in vitro T-celle aktivering med anti-CD3-og anti-CD28-koblede perler, var de inficerede og uinficerede T-celler ligeledes CD25 lav, CD69 lav og CD44 low men CD62L høj, viser deres naive og hviletilstand (figur 6, øvre paneler). Ved T-celleaktivering, viste de inficerede celler opregulering af aktiveringen markører CD25, CD69 og nedregulering af CD62L næsten umulig at skelne fra inficerede celler (fig. 6, lavere paneler). Således er aktiveringen status af T-celler ikke ændret ved adenovirusinfektion. Hvilefase er forbundet med tab på 60 til 70% af cellerne på grund af fravær af vækstfaktorer eller cytokiner, sammenlignet med 10 - 20% døde celler 40 timer efter aktivering uden at hvile. Dette blev taget i betragtning, når de vælger det oprindelige celle nummer på 3 x 10 5 celler.

Evaluering af Overekspression niveau af et gen af ​​interesse

For at vurdere mængden af ​​overekspression opnås ved adenoviral genoverføring, vi har forsøgt at bestemme microRNA-155 (miR-155) ekspressionsniveauer i naive T-celler, som vire inficeret med miR-155-udtrykkende eller kontrol adenovirus eller blev efterladt uinficeret. Vi valgte miR-155, da denne modne miRNA udtrykkes på moderate niveauer i naive T-celler og bliver stærkt induceret ved T-celleaktivering. Desuden har en afgørende rolle i T-celle-afhængige humorale responser 25,26.

Niveauet af microRNA overekspression blev evalueret ved qPCR. Efter infektion blev cellerne hvilede for 40 timer, aktiveres for 40 timer, eller hvilede 40 hr efterfulgt af 40 hr aktivering. Efter 40 timers hvile, den naive T-celler inficeret med miR-155 koder virus viste en cirka 17 gange overekspression af miR-155 sammenlignet med celler inficeret med kontrol virus eller ikke-inficerede celler (fig. 7). Denne næsten matches i hvilket omfang det endogene miR-155 er induceret efter T-celleaktivering (fig. 7 og ref. 25,27). Uanset denne stærke induktion af det endogene miR-155 niveauer, celler inficeret med miR-155 adenovirus stadig viste omkring fire gange stigning i ekspression af miR-155 ved aktivering sammenlignet med kontrol virus-inficerede eller ikke-inficerede celler. Det observerede niveau af ektopisk overekspression var sammenlignelig for andre microRNA (data ikke vist). Bemærk, at for store indsatser kan overekspression være mindre effektive.

Analyse af T-celledifferentiering

Dataanalysen kan udføres på flere måder. Analyse af differentiering i GFP positive gate af et gen af interesse (dvs. i de inficerede celler) sammenlignet med differentiering i samme GFP positive gate af kontrolceller (inficerede celler ved hjælp af en vektor uden gen af interesse), er tilstrækkeligt til at påvise væsentlige forskelle. At studere mere subtile virkninger af et gen af interesse, har vi sammenlignet differentieringen i inficerede celler med den for ikke-inficerede celler fra den samme brønd (figur 8). Disse tjener som en intern control og kan anvendes til at beregne den "relative differentiering" indeni en brønd. Hvis en virus har ingen effekt på differentiering, vil "relative differentiering" ideelt set være 1.. Den relative differentiering for kontrol virus i vores hænder har en rækkevidde på 0,9 til 1,1. Relativ differentiering bør kun anvendes til at sammenligne gen-interesse-inficerede prøver at styre virusinficerede prøver.

Figur 1
Figur 1. Skematisk repræsentation af adenovirus generation. Indtastning vektorer (pENTR) indeholder rekombination donorsteder (attL1, attL2), som flankerer et gen af interesse. Destinationen vektor pCAGAdDu indeholder rekombinationssitene målstederne (AttR1, attR2) flankerer toksin CCDB genet for negativ selektion i E. coli, der er erstattet af genet af interessegennem LR rekombination. Destinationen vektor indeholder også en menneskelig type 5 adenovirusgenom uden E1/E3 gener, der er blevet slettet for at generere replikationsdeficiente rekombinante adenovirus. PacI linearisering frigiver vendes gentagelser (ITR), før transfektion ind HEK293A celler, der bærer adenovirusgener at generere smitsomme adenoviruspartikler, der resulterer i cytopatiske virkninger. Adenovirus er høstet fra producerende celler ved fryse-og-tø cykler. Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. Skematisk fremstilling af T-celle-infektion og differentiering. Naive T-celler blev inficeret med et adenovirus lysat i 1,5 timer, vasket med PB S og hvilede i T-celle medium i 40 timer ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator. Cellerne blev derefter aktiveret i 72 timer med anti-CD28 og anti-CD3-antistof-koblede perler i nærvær af TGFp og IL-2. Faste og farvede celler blev analyseret ved FACS, og ekspressionen af ​​Foxp3 i inficerede versus ikke-inficerede celler blev bestemt.

Figur 3
Figur 3. Cytopatisk virkning af adenovirus-producerende HEK293A celler. Forekomst af CPE på dag ti efter transfektion af 10 5 HEK293A celler med 3 ng lineariseret pCAGAdDu vektor. Det venstre panel viser fasekontrast billedet, den højre panel viser grøn fluorescens.

55/50455fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50455/50455fig4.jpg "/>
Figur 4.. Bestemmelse af titeren af adenovirus lysater ved infektion af A549-celler. 10 5 A549-celler blev inficeret med den indikerede virus fortynding, inkuberet i 48 timer og analyseret for ekspression af infektionen markør GFP ved flowcytometri. Antallet af GFP-positive celler er afbildet mod den anvendte mængde virus. Titeren af ​​ufortyndet virus beregnes ud fra standardkurven over lineære område med x = 1,000 pi.

Figur 5
Figur 5. Adenovirus infektion ved en MOI på 1 - 50 har ingen effekt på T-celle-levedygtighed eller Treg differentiering naive T-celler oprenset fra DO11.10 TG, CARΔ1 tg mus blev inficeret med adenovirus på forskellige MOI.i 90 minutter, vasket med PBS og hvilede i 40 timer i T-celle-medium. Celler blev aktiveret i Treg polariserende betingelser i 72 timer. Faste og farvede celler blev analyseret for inkorporering af døde celler farvestof (b), udtryk for infektionen markør GFP (a), og for differentiering markør Foxp3 (c). Klik her for at se større figur .

Figur 6
Figur 6.. Adenovirusinfektion ændrer ikke aktiveringsstatus af T-celler Naive T-celler fra DO11.10 tg;. CARΔ1 tg mus blev inficeret med adenovirus ved en MOI på 50 for 90 min (linjer) eller venstre uinficeret (områder), vasket med PBS og hvilede for 40 timer. Celler blev analyseret for EXPREssion af aktivering markører før (øverste paneler) og efter (nederste paneler) 40 hr af aktivering i Treg polariserende forhold.

Figur 7
Figur 7. . Relative miR-155 overekspression før og efter T-celleaktivering naive T-celler fra DO11.10 TG, CARΔ1 tg mus blev inficeret ved en MOI på 50 med microRNA-155 (miR-155)-ekspression eller kontrol adenovirus eller venstre inficerede. Cellerne blev derefter hvile i 40 timer, aktiveres for 40 timer, eller hvilede 40 hr efterfulgt af 40 timers aktivering. Angivelse af microRNA-155 blev bestemt i forhold til SnoRNA202 af qPCR.

Figur 8
positive (dvs. inficerede celler) udtrykkes i forhold til den procentdel af Foxp3 + celler i GFP negative (ikke-inficeret celler). Relativ differentiering lig 1, hvis den overudtrykte gen af ​​interesse havde ingen virkning på Treg differentiering. Værdier over 1 indikerer en fremmende virkning på differentiering, mens værdier under 1 indikerer en hæmmende virkning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Virus Generation og titrering

For at opnå optimale transfektion resultater vises kvaliteten og mængden af ​​lineariseret vektor vigtigste. Vi har ikke observere negative virkninger på den primære lysat produktion fra en indledende overvækst af kulturen da infektionen vil hurtigt videre, når effektiv virus produktionen finder sted. Dog kan virusproduktion ved HEK293A celler upåvirket af lange skær, der sænker effektiviteten. Nogle åbne læserammer blev faktisk fundet at interferere med virusproduktion. Disse virale bestande kan typisk blive reddet gennem flere runder af forstærkning, og kun få åbne læserammer blev fundet at være uforenelig med virus produktion. Fra vores erfaring, vil forekomsten af CPE inden 48 timer efter infektion for virus amplifikation giver typisk en viruslysatet på omkring 1 x oktober 09-05 x 10 10 infektiøse partikler / ml.

Adenovirusinfektion af naive T-celler

Adenoviral infektion af naive T-celler ændrer ikke aktiveringsstatus af T-celler før og efter stimulering. Dette gør transduktion systemet et kraftfuldt eksperimentel værktøj til at studere T-celle differentiering fra indledende TCR-stimulation på. Vi har fastslået effektiv ektopisk ekspression af gener af interesse efter infektion og »hvilende« af T-celler for 40 timer, på et tidspunkt, hvor cellen er stadig naiv og ikke viser tegn på aktivering. Dette betyder, at under den efterfølgende T-celleaktivering, er genet af interesse allerede overudtrykt og kan udøve sin indflydelse på T celle differentiering fra begyndelsen. Således adenoviral transduktion har en klar fordel i forhold til elektroporation eller retroviral transduktion, der kræver aktivering og udtrykke et gen af interesse kun efter indledende TCR signalering 15,28. Men hvis sene aspekter af differentiering skal analyseres og ekspressionen af ​​genet af interesse er ikke nødvendig inden første T-celle activation kan naive T-celler samt stimuleres direkte efter adenoviral transduktion. Da adenovirusinfektion er meget effektiv, kan det udvides til at studere samarbejdsaktiviteter to gener af interesse ved at udføre dobbelt infektioner med adenovirus, der udtrykker andre smittemarkører såsom Thy1.1 eller hCD2. Sidstnævnte er også tilgængelig for antistof overflade farvning og kan omgå vanskeligheder i markør konservering under fiksering. I aktiverede T-celler, dog adenovirusinfektion har en meget lavere effektivitet, og elektroporation eller retrovirale transduktion metoder kan være gunstige. Anden advarsel for adenovirus ansøgning er den forbigående karakter af udtryk. Adenovirus opretholdes som et episom knyttet til nukleare matrix af cellen og blive fortyndet som T-celler prolifererer, hvilket fører til tab af markør genekspression inden for fem til syv dage efter T-celleaktivering (data ikke vist,. Ref 17). Desuden-adenovirus transducerede celler er readily anerkendt og elimineres af et intakt immunsystem, hvilket begrænser dets anvendelse in vivo, for eksempel i adoptiv overføring eksperimenter af T-celler i mus. En anden potentiel anvendelse af adenovirale systemet kunne være infektion i Treg celler isoleret fra DO11.10 tg; CARΔ1 tg mus for at studere Treg funktion eller slægt stabilitet aspekter.

Validering af Adenovirus Virkninger på inficerede celler

Adenovirusinfektion var effektiv og havde næsten ingen indflydelse på T-celle levedygtighed og Treg differentiering. Ved en MOI på 50, opnåede vi det bedste infektion effektivitet uden iagttagelse negative virkninger af adenovirusinfektion på T-celler. Dette skal ligeledes etableres, når systemet anvendes på andre cellekultur eller differentiering tilstand, typisk ved titrering forsøg med tom adenovirus uden ekspression af genet af interesse. Hvis adenovirusinfektion som sådan påvirker resultatet af eksperimentet,sammenligning af genet af rentebærende adenovirus med tomme adenovirus stadig er relevant at afdække virkningerne af den overførte gen af ​​interesse. Hvis der ikke er nogen virkning af adenoviral infektion, kan den målte parameter også sammenlignes mellem inficerede og inficerede celler fra samme prøve.

Dataanalyse

Den som er beskrevet her tillader en samtidig analyse af differentiering markør Foxp3 sammen med infektionen markør GFP, så en "relativ differentiering" kan bestemmes. Denne analyse af to populationer i én prøve har højere følsomhed for subtile effekter end bulkpopulation sammenligninger mellem to prøver, da det tager godt to-såvel variationer i betragtning. Dog vil kun effekter iboende til inficerede celler være anerkendt af denne metode, mens godt dækkende virkninger f.eks påvirkninger udøves af et udskilt faktor, ville blive forsømt. Relativ differentiering bør kontrolleres i hvereksperiment ved herunder kontrol-inficerede celler til at udelukke virkninger af infektionen sig på differentiering. For at opnå optimale resultater, skal næsten lige rate af inficerede til ikke-inficerede celler i én prøve være rettet til, mens højere smittede er gunstige i løs sammenligninger mellem flere prøver.

Afslutningsvis genoverførsel til naive T-celler ved hjælp af adenovirus kombineret med in vitro differentiering protokoller er et kraftfuldt system til at undersøge den molekylære basis for Treg differentiering. Dette kan tillade generering af viden til at udnytte den dominerende tolerance tillagt ved tregs i terapeutiske tilgange mod allergiske og autoimmune sygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Lirui Du til konstruktion af pCAGAdDU vektor og Oliver Gorka for levering af fikseringen protokollen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Invitrogen K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix Invitrogen 11791020
PacI New England Biolabs R057S
jetPEI Polyplus-transfection 101-10N
HEK293A Cell Line Invitrogen R705-07
A549 ATCC CCL-185
6-well plates BD Falcon 353046
14 cm tissue culture dish Nunc 168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr Taconic Farms Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II Miltenyi Biotech 130-094-131
DMEM Invitrogen 41966-052
FBS PAN Biotech 1502-P110704
PenStrep Invitrogen 15140-122
RPMI 1640 Lonza BE12-167F
NaPyruvate Lonza BE13-115E
NEAA 100x Lonza BE13-114E
L-Glutamine Invitrogen 25030
HEPES Buffer Solution (1 M) Invitrogen 15630-056
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x) Lonza 13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation Invitrogen 114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1 R&D Systems 240B
Proleukin S (18 x 106IE) Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit Invitrogen L-23105
Mouse BD Fc BlockT BD Pharmingen 553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE eBioscience 12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay Roche Applied Biosystems 4427975
LightCycler 480 Probes Master Roche Applied Biosystems 04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Roche Applied Biosystems 4366596

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
  2. Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).
  3. Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).
  4. Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation. Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).
  5. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  6. Laurence, A., Amarnath, S., et al. STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease. Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).
  7. Terabe, M., Berzofsky, J. A. Immunoregulatory T cells in tumor immunity. Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).
  8. Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors. European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).
  9. Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
  10. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  11. Chen, W., Jin, W., et al. Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).
  12. Xu, W., Lan, Q., et al. Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation. PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).
  13. Circosta, P., Granziero, L., et al. T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR. Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).
  14. Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).
  15. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).
  16. Leon, R. P., Hedlund, T., et al. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).
  17. Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).
  18. Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model. BMC Immunology. 3, 4 (2002).
  19. Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation. The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).
  20. Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression. Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).
  21. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).
  22. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
  23. Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).
  24. Bernard, P., Couturier, M. Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).
  25. Thai, T. -H., Calado, D. P., et al. Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155. Science. 316 (5824), 604-608 (2007).
  26. Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function. Science. 316 (5824), 608-611 (2007).
  27. Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).
  28. Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. , (2011).

Tags

Immunologi cellebiologi molekylærbiologi medicin Biomedical Engineering Bioengineering Infection Genetics Mikrobiologi Virology T-lymfocytter regulatoriske CD4-positive T-lymfocytter Regulatory Adenovirus Human MicroRNA antigener differentiering T-lymfocyt genoverførsel Techniques transduktion Genetic Transfection Adenovirus genoverførsel microRNA overekspression banke ned CD4 T-celler, regulatoriske T-celle virus celle flowcytometri
Adenoviral transduktion af Naive CD4 T-celler til at studere Treg Differentiering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warth, S. C., Heissmeyer, V.… More

Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation. J. Vis. Exp. (78), e50455, doi:10.3791/50455 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter