Summary
Coltura cellulare primaria è una tecnica utile per analizzare specifiche popolazioni di cellule, particolarmente da embrioni di topo transgenico a stadi specifici dello sviluppo. Qui, ventricoli embrionali vengono sezionati e dissociato, e perle di anticorpi coniugati riconoscere e separare le cellule endoteliali per ulteriori analisi.
Abstract
Coltura cellulare ha notevolmente migliorato la nostra capacità di valutare le singole popolazioni di cellule in condizioni di coltura miriade. Mentre le linee cellulari immortalizzate offrono vantaggi significativi per la loro facilità di utilizzo, queste linee cellulari non sono disponibili per tutti i potenziali tipi di cellule. Isolando cellule primarie di una regione di interesse, in particolare da un topo transgenico, studi più sfumate possono essere eseguite. La tecnica di base consiste dissezione dell'organo o organo parziale di interesse (ad esempio il cuore o una regione specifica del cuore) e dissociare l'organo di singole cellule. Queste cellule vengono poi incubate con perline magnetiche coniugate ad un anticorpo che riconosce il tipo cellulare di interesse. Le cellule di interesse possono quindi essere isolati con l'uso di un magnete, con una breve incubazione tripsina dissociare le cellule dalle perline. Queste cellule isolate possono essere coltivate e analizzati come desiderato. Questa tecnica è stata originariamente progettata per adulto organo del mouses ma può essere facilmente ridotta per uso con organi embrionali, come dimostrato qui. Poiché il nostro interesse è nel sistema vascolare coronarico di sviluppo, abbiamo voluto studiare questa popolazione di cellule durante le fasi embrionali specifici. Così, il protocollo originale ha dovuto essere modificata per essere compatibile con le piccole dimensioni dei ventricoli embrionali e la bassa resa potenziale delle cellule endoteliali in queste fasi di sviluppo. Utilizzando questo approccio in scala ridotta, abbiamo valutato coronarica plesso rimodellamento ventricolare in cellule endoteliali embrionali transgeniche.
Introduction
L'avvento di linee cellulari immortalizzate ha rivoluzionato la biologia cellulare di base 1. Le linee cellulari attualmente disponibili sono derivati da una vasta gamma di organi e comprendono tutti i principali tipi di cellule. Tuttavia, le linee cellulari stabilizzate hanno alcune limitazioni. Il processo di immortalizzazione ovviamente cambia il comportamento delle cellule, in particolare rispetto alla durata di vita e la proliferazione, ma può anche influenzare l'espressione di proteine imprevisti, come le proteine citoscheletriche 2. Inoltre, anche se molte linee cellulari differenti sono disponibili, vi è diversità significativa tra anche un singolo tipo di cellula all'interno un intero organismo. Le cellule endoteliali in particolare mostrano comportamenti diversi in base al fatto che la linea arterie o vene e che tipo di flusso è presente nel recipiente 3. Ancor più pressante da una prospettiva evolutiva, tuttavia, è che la stragrande maggioranza delle linee cellulari disponibili sono derivati da tessuti adulti (vedi, ad esempio tegli collezione disponibile tramite ATCC). Queste linee cellulari adulte probabilmente non ricapitolano la natura dinamica dei loro precursori embrionali. La rapida evoluzione spazio-temporali pattern di espressione genica osservati durante lo sviluppo suggeriscono anche che una cellula endoteliale da un organo in un determinato stadio di sviluppo non può comportarsi allo stesso modo di una cellula endoteliale, da quello stesso organo, in una fase di sviluppo diverso.
Come alternativa all'utilizzo di linee cellulari immortalizzate disponibili in commercio, cellule primarie possono essere isolate dal tessuto specifico di interesse. Tra i vantaggi di questa tecnica, queste cellule primarie possono essere isolati da un organo specifico o anche parte di un organo in qualsiasi stadio di sviluppo specifico. Inoltre, queste cellule primarie possono essere isolati dalla grande varietà di animali transgenici disponibili, permettendo lo studio in vitro del gene knockout e knock-in, evitando altri problemi come l'efficienza di trasfezione. Non sorprende che moltitecniche sono stati pubblicati in dettaglio come isolare specifici tipi di cellule 4,5. In generale, queste tecniche implicano la raccolta della regione di interesse, dissociare le cellule, tagging il tipo cellulare specifico di interesse, e isolando quelle celle per ulteriori analisi.
Per studiare una popolazione precoce embrionale delle cellule endoteliali coronariche, abbiamo ridimensionato una tecnica 4 precedentemente pubblicato per l'uso con un organo più piccolo. Con questa procedura in scala ridotta, possiamo isolare le cellule endoteliali coronariche dal cuore embrionale in stadi embrionali specifici. Queste cellule possono quindi essere utilizzate in saggi tradizionali endoteliali, quali le analisi di migrazione. Fino ai primi di linee cellulari embrionali sempre più frequentemente, lavorando con le cellule primarie è una tecnica di inestimabile.
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Protocol
1. Preparare Beads anticorpi coniugati
- Un giorno prima della dissezione, unire l'anticorpo di scelta con le Dynabeads appropriate (ad esempio ratto IgG Dynabeads per un anticorpo cresciuto in ratto, 4 x 10 8 perline / ml) per le istruzioni del produttore. Per il BD ratto anti-CD31 anticorpo (0,5 mg / mL, per isolare le cellule endoteliali), è aggiunto 3 anticorpo microlitri per ogni 25 microlitri perline, per una concentrazione finale di 1,5 mg anticorpo anti-CD31 e 1 x 10 7 perline / 25 microlitri di buffer.
- Incubare perline e anticorpi notte a 4 ° C.
2. Preparazione del pannello di collagene
- Cellule isolate formano tubuli più rapidamente quando coltivate su un gel di collagene rispetto al solo una piastra rivestita di collagene. Pertanto, gel di collagene sono fatte la notte prima della dissezione, come descritto al punto 6. Sul ghiaccio in una cappa di coltura tissutale, combinare i seguenti reagenti (sufficiente per 19 pozzetti): 206,4 ml sterile H <sub> 2 O, 140,4 microlitri collagene di tipo I (4,08 mg / ml), 38,4 microlitri 10x M199, e 1,15 microlitri 5 M NaOH.
- Pipettare 20 ml di gel di collagene presente nei pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 384 pozzetti. Porre la piastra in una ° C di coltura tissutale incubatore 37 per 30 min.
- Aggiungere 80 microlitri DMEM a ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti a 37 ° C. Rimuovere il terreno di coltura e ripetere altre due volte.
- Dopo l'ultimo risciacquo, aggiungere 80 microlitri 10% FBS / DMEM a ciascun pozzetto e incubare una notte a 37 ° C. Rimuovere il mezzo di coltura prima di aggiungere le cellule isolate.
3. Accise e digerire il Cuore
- Eutanasia di un mouse timed-incinta al giorno embrionale desiderato utilizzando una tecnica di eutanasia approvato. Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la University of North Carolina a Chapel Hill.
- Con il mouse in posizione supina, liberalmente spruzzare il lato ventrale della femmina con il 70% di etanolo primadissezione. Utilizzando pinze per sollevare la pelle addominale inferiore e muscolo, allontanandosi dagli organi interni, tagliare aprire cavità inferiore addominale della femmina di visualizzare gli organi interni.
- Tenendo il collo dell'utero con una pinza, tagliare con cura caudale per la pinza e iniziare il sollevamento del corno uterino dalla cavità addominale. Mentre si solleva il corno uterino, tagliare qualsiasi tessuto connettivo che tiene il corno a posto. Per finire ablazione del corno uterino, tagliare il nodo del corno uterino con l'ovidotto per liberare il corno uterino.
- Collocare il corno uterino in una capsula di Petri contenente freddo 1x tampone fosfato salino (PBS) e sciacquare come necessario. Tagliare il corno uterino attraverso la linea mediana per esporre i sacchi embrionali allegati.
- Tagliare un sacco embrionale all'incrocio tra la placenta e l'embrione di evitare accidentalmente tagliare l'embrione e recuperare un embrione. Posizionare l'embrione in una seconda capsula di Petri con PBS freddo. Riportare la capsula di Petri con il corno uterino di ghiaccio.
- Decapitate l'embrione per migliorare l'accesso alla parete toracica. Se genotipizzazione è necessario, tagliare la coda per rimuoverla e salvare in una provetta Eppendorf posti su ghiaccio.
- Con l'embrione sul dorso, tagliare aprire la parete toracica per visualizzare il cuore e polmoni. Per evitare di tagliare il cuore, fare un taglio verticale lungo il lato della gabbia toracica, vicino a una zampa anteriore, seguito da un taglio orizzontale attraverso la parte inferiore delle costole, poi estrarre delicatamente la parete toracica e fuori del modo. Attraverso circa embrionale giorno 13.5, la parete toracica è trasparente, aiutando nella visualizzazione.
- Sollevare delicatamente il cuore con pinze e tagliare i vasi sotto. Quindi, tagliare sopra i grandi vasi di liberare il cuore. Se i vasi polmonari non sono tagliati, i polmoni possono essere rimossi con il cuore. Così, eliminano tessuti estranei, come i polmoni, se necessario.
- Separare e scartare i vasi atri e grande dai ventricoli. Utilizzando le forbici, tritare i ventricoli in piccoli pezzi (circa 1 mm 3 </ Sup>) e il luogo in circa 500 ml di collagenasi (1 mg / ml in PBS sterile). Conservare i campioni in ghiaccio fino a quando tutti i ventricoli sono stati macinati e messi in collagenasi.
- Ripetere i passaggi precedenti fino a quando i ventricoli sono stati rimossi da tutti gli embrioni, raccogliendo ogni cuore in un tubo Eppendorf separata. Se tutti gli embrioni hanno lo stesso genotipo, i cuori possono essere raggruppati in un unico tubo Eppendorf. Il numero di campioni trattati in una sola volta può essere limitato in base al magnete utilizzato per l'isolamento, la DynaMag (123-21D), qui usato in possesso di un massimo di 16 provette Eppendorf.
- Posizionare i ventricoli tritate a 37 ° C con dondolo per 45 min. Ogni 15 minuti, rimuovere delicatamente il campione e pipettare su e giù per dissociare meccanicamente le cellule.
4. Isolando le cellule endoteliali
- Far passare la soluzione ventricolo-collagenasi attraverso un 70 micron filtro per rimuovere macchie residue di cellule.
- Centrifugare le cellule a 400 xg per 10 min. Scartareil surnatante, sostituire con circa 200 ml 10% FBS in DMEM, e pipettare su e giù per dissociare le cellule.
- Ripetere il passaggio precedente una volta. Centrifugare le cellule a 400 xg per 10 min dopo il secondo 10% FBS / DMEM lavaggio. Risospendere le cellule in 50 microlitri 10% FBS / DMEM.
- Durante la fase di centrifugazione finale, preparare le perline.
- Porre il tubo Eppendorf contenente l'anticorpo e perline su un magnete per 1 min.
- Con il tubo in posizione sul magnete, rimuovere il surnatante. Togliere la provetta dal magnete e aggiungere circa 100 ml 10% FBS / DMEM.
- Posizionare il tubo sul magnete per 1 min. Rimuovere il surnatante, e lavare ancora con 10% FBS / DMEM. Ripetere per un totale di 3 lavaggi.
- Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le sfere di anticorpi coniugati a 10% FBS / DMEM (5 ml per campione).
- Per ciascun campione cellulare, aggiungere 5 ml di perline anticorpo-coniugate. Posizionare le sospensioni bead-cell a 4 ° C con dondolo for 30 min.
- In una cappa a flusso laminare, posizionare le provette Eppendorf contenenti cellule e perline anticorpi coniugati sul magnete per 1 min. Eliminare il surnatante, togliere i tubi dal magnete, e lavare con circa 100 l 10% FBS / DMEM. Ripetere l'operazione per 5 lavaggi.
- Dopo l'ultimo lavaggio, posizionare i tubi sul magnete per 1 min, rimuovere il supernatante, e rimuovere i tubi dal magnete. Aggiungere circa 100 microlitri DMEM.
- Porre i tubi sul magnete per 1 min, rimuovere il supernatante, e rimuovere i tubi dal magnete. Aggiungere 100-200 ml preriscaldata 0,25% tripsina-EDTA. Incubare i campioni a 37 ° C e 5% di CO 2 per 5 min.
- Posizionare i tubi sul magnete per 2 min. Trasferire accuratamente il supernatante contenente cella per provette Eppendorf. Centrifugare per 5 min a 400 x g.
- Rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in 80-100 microlitri mezzo di crescita e piatto in un 96 - o 384 pozzetti piatto di coltura trattata, a seconda del rendimento atteso(Circa 450-600 cellule dai ventricoli del E14.5-E16.5 embrioni). Per le cellule endoteliali, utilizzare endoteliale coltura mezzo di crescita (definito di seguito).
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Representative Results
Utilizzando un anticorpo specifico per endoteliale che riconosce CD31, le cellule endoteliali sono state isolate dai ventricoli del embrionali (E) 13.5 (Figura 1A) e 18,5 (Figure 1B-1D) embrioni. Quando cresciuto su un piatto di coltura trattata, queste cellule rimangono arrotondate e formerebbero un pattern di ciottoli se vicino confluenti (Figura 1A). Diluire il collagene è stato utilizzato anche per rivestire i pozzetti, e mentre le cellule endoteliali aderirà ad esso (Figura 1B), formano meno rispetto a quando le catene placcato su un gel di collagene (Figure 1C e 1D). Cellule endoteliali coltivate in un pozzetto contenente un gel di collagene (Figure 1C e 1D) interazioni cellula-cellula forma e catene di forma che iniziano ad espandersi quando coltivate su collagene, e questo processo si verifica più veloce quando coltivati in gel di collagene rispetto al collagene rivestite piastra. Queste catene endoteliali etichettano positivamente con il marcatore endoteliale iso-lectina ( Cellule endoteliali isolate da E18.5 ventricoli etichettano positivamente con PECAM (Figura 2A) e Flk1 (Figura 2B). Inoltre, vivono le cellule endoteliali isolate possono essere etichettati con il colorante endoteliale specifico fluorescente Syto-16. Figura 2D mostra cellule endoteliali che sono state isolate dai ventricoli di un E14.5 embrione ed etichettati con Syto-16. 
Figura 1. Le cellule endoteliali isolate da ventricoli embrionali del mouse formare catene quando coltivate su un gel di collagene. (A) Brightfield immagine 10x di isolati ventricolari cellule endoteliali dal vivo da un E13.5 cuore grown su un piatto di coltura trattata, anche dopo 48 ore, le cellule rimangono arrotondati (B) Brightfield immagine 10x di isolati ventricolari cellule endoteliali fissi da un cuore E18.5 cresciuto su un piatto rivestito di collagene;. dopo 24 ore, alcune cellule hanno cominciato allungamento (freccia), ma la maggior parte di loro rimangono arrotondato (punta di freccia). (C, D) le immagini confocale ventricolari isolate cellule endoteliali fissi da un E18.5 cuore coltivate su un gel di collagene, mostrata in campo chiaro (C), ed etichettate con iso -lectina (rosso). Frecce indicano alcune delle cellule lectina-positivi. Barre di scala in CD = 50 micron. 
Figura 2. Le cellule endoteliali isolate da ventricoli embrionali del mouse etichettano positivo per i marcatori endoteliali. (AC) le immagini confocale (40x) di isolati ventricolari cellule endoteliali fissi da un E18.5 cuore coltivate suun piatto di collageno-rivestito. Queste cellule etichettano positivamente per PECAM (A) e FLK-1 (B), il controllo negativo (C) non mostra fluorescenza. In AC, i nuclei sono etichettati con DAPI (blu). (D) Fluorescent overlay (10x) di isolati ventricolari cellule endoteliali dal vivo da un cuore E14.5 cresciuto su un gel di collagene. Le cellule sono state incubate con il marcatore endoteliale vivo Syto-16 (verde), e la migrazione è stata osservata tramite microscopia time-lapse.
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Discussion
Lavorare con le cellule embrionali primarie consente nuovi esperimenti per affrontare in fasi critiche dello sviluppo in vitro. Tuttavia, la procedura di isolamento non è banale. Passaggi critici per isolare qualsiasi tipo di cellule comprendono assicurare che le cellule sono ben separati su digestione collagenasi e poi che siano ben sospesi durante le fasi di lavaggio. Dissezione meccanica pipettando aiuta notevolmente separare le cellule durante la fase di collagenasi, e la fase di filtraggio rimuove grumi di cellule. Questi passaggi migliorano la purezza della popolazione e la resa.
La densità di placcatura è anche un problema significativo quando isolare cellule da un piccolo organo. Perché endoteliale tubo-formazione dipende dalla densità cellulare 7, ci siamo basati su piastre di coltura di tessuti da 384 pozzetti per aumentare la nostra densità di placcatura. Anche con questa considerazione, abbiamo dovuto modificare alcune analisi per ospitare una densità cellulare inferiore (Dyer e la Patterson, in proGress). Così, se il numero delle cellule è una preoccupazione, una cultura di dimensioni più ridotte e può diminuire il problema.
Un'altra limitazione di isolare cellule primarie è la specificità dell'anticorpo. Anche una proteina endoteliale specifico riconosciuto come CD31 volte è espresso da fibroblasti 8. Se il numero di cellule raccolte consente FAC ordinamento invece, allora le cellule endoteliali e fibroblasti potevano essere separati dalla intensità di fluorescenza. Tuttavia, una recente analisi di smistamento FAC di cellule endoteliali embrionali richiesto quattro intere E10.5 embrioni per produrre cellule endoteliali sufficiente per l'estrazione di mRNA, suggerendo che questa tecnica, anche se potente, può non essere appropriato per gli organi minori 9.
Così, se FAC ordinamento non è fattibile, altre tecniche possono essere impiegate per migliorare la purezza popolazione. Un processo di selezione in due fasi, in cui le cellule sono positivamente selezionate da un anticorpo e quindi negativamente selected dalla mancata legarsi ad un secondo anticorpo, è un approccio alternativo. Il marcatore fibroblasti specifico FSP-1 sarebbe un candidato particolare 10. In alternativa, il mezzo di coltura può essere ordinato senza L-valina, e D-valina può essere aggiunto preferibilmente; fibroblasti sono in grado di utilizzare D-valina e pertanto non sopravvivono 11,12.
Nonostante questi limiti e preoccupazioni, studiando le popolazioni di cellule embrionali primari consente una dettagliata analisi in vitro dei processi di sviluppo. Questa tecnica può essere applicata a qualsiasi organo o regione dell'embrione e permette un tipo cellulare da confrontare tra i diversi stadi embrionali. Con la scala appropriato, anche molto piccole popolazioni di cellule primarie possono essere ottenuti e analizzati. Queste analisi forniscono informazioni significative in quanto specifici sottoinsiemi di cellule si comportano e cambiano nel tempo.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Andrea Portbury per la lettura critica del manoscritto, il microscopio Servizio Laboratorio di UNC per l'assistenza con il time-lapse imaging, e il NIH (borsa # R01HL061656) per il supporto finanziario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercapt–thanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
| Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 | |
References
- Landecker, H. Culturing Life: How Cells Became Technologies. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).
- Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization. Oncogene. , (2012).
- Dyer, L. A., Patterson, C. Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity. Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).
- Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).
- Chang, L., Noseda, M. Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling. PNAS. 109, 5993-6998 (2012).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).
- Frauli, M., Ludwig, H. Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine. Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).
- Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media. Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).
- Arima, S., Nishiyama, K., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
