Summary
原代细胞培养是一个非常有用的技术分析特定的细胞群体，在特定的发展阶段，特别是从转基因小鼠胚胎。这里，胚胎脑室解剖的和离解，抗体共轭的有孔玻璃珠的识别和分离出来的血管内皮细胞进行进一步的分析。
Abstract
细胞培养，大大提高了我们的能力，评估个人的无数文化条件下的细胞群体。永生化的细胞系提供了其易用性的显着的优点，这些细胞系对所有潜在的细胞类型是不可用的。隔离从一个特定的感兴趣区域的，特别是来自转基因小鼠的原代细胞，可以进行更细致的研究。的基本技术包括解剖的器官或部分感兴趣的器官（ 例如心脏或心脏的特定区域）和单细胞解离的器官。与磁珠结合到感兴趣的细胞类型的抗体，该抗体识别这些细胞，然后进行培养。感兴趣的细胞然后可以使用磁铁进行分离，解离的细胞从有孔玻璃珠和一个短的胰蛋白酶孵育。在这些分离的细胞可以被培养，分析的需要。这种技术最初是专为成年小鼠器官，但也可以很容易地缩小与胚胎器官的使用，本文所证明。因为我们的兴趣是在发展中国家的冠状动脉血管，我们想研究这个细胞群体，在特定的胚胎阶段。因此，原始的协议进行修改，以兼容胚胎脑室的小尺寸和低电位在这些发育阶段的血管内皮细胞的产率。利用这种按比例缩小的方法，我们已经评估冠状动脉丛转基因胚胎心室重构的内皮细胞。
Introduction
永生细胞系的问世彻底改变基本细胞生物学1。当前可用的细胞系是来自于广泛的器官，包括所有的主要细胞类型。然而，建立的细胞系有一定的局限性。永生化的方法，明显改变细胞的行为，特别是相对于寿命和扩散，而且还可以影响意想不到的蛋白质的表达，如细 胞骨架蛋白2。此外，虽然有许多不同的细胞系，甚至一个单一的细胞类型内的整个有机体之间的显着的多样性。内皮细胞在特定的显示出不同的行为根据他们是否行动脉或静脉，是什么样的流量目前在容器3。更为迫切，但是，从发展的角度来看是可用的细胞系中，绝大多数是来自成人组织（ 如：T他收集可通过ATCC）。这些成人细胞株可能不复述他们的胚胎前体的动态性质。迅速变化的时空在开发过程中观察到的基因表达模式也表明，在给定的发育阶段从一个器官的血管内皮细胞，可能无法从该相同的器官，血管内皮细胞在不同发育阶段的行为方式相同。
作为一种替代方法，使用市售的永生化细胞系，原代细胞可以分离出感兴趣的特定组织。在这种技术的优点，这些原代细胞可以分离出特定的器官，或什至在任何特定的发育阶段的器官的一部分。此外，这些原代细胞可以从可用的转基因动物的各种各样的分离， 从而允许该基因敲除和爆震的同时避免了其他问题，如转染效率的体外研究。毫不奇怪，许多技术已出版，详细介绍了如何分离特定的细胞类型4,5。一般情况下，这些技术涉及收集感兴趣的区域，解离的细胞，感兴趣的特定的细胞类型进行标记，并分离这些细胞进行进一步的分析。
要研究冠状动脉内皮细胞的早期胚胎人口，我们缩减先前公布的技术4，使用一个较小的器官。有了这个比例缩小的过程中，我们可以分离出冠状动脉内皮细胞从胚胎心脏特异性胚胎阶段。这些细胞可以被用在传统的内皮细胞的检测，如迁移分析。直至早期胚胎细胞系变得更加普遍，工作与原代细胞是一个非常宝贵的技术。
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Protocol
1。准备抗体共轭珠
- 清扫前一天，选择的抗体相结合，用适当的磁珠（ 如鼠IgG抗体的磁珠大鼠，4×10 8珠/毫升），每制造商的指示。对于BD的大鼠抗CD31抗体（0.5微克/微升，用于分离内皮细胞），每25微升的有孔玻璃珠加入3微升的抗体，1.5微克的抗CD31抗体的终浓度为1×10 7的有孔玻璃珠/ 25μl的缓冲液中。
- 在4°C孵育过夜珠和抗体
2。准备胶原板块的
- 分离的细胞形成小管更迅速地生长时，在胶原凝胶，而不是仅仅是一种胶原包被的板。因此，胶原凝胶夹层的前一天晚上，6。冰在组织培养罩，结合下列试剂（够19井）：206.4微升无菌H <子> 140.4微升2 O，I型胶原（4.08毫克/毫升），38.4微升10X M199和1.15微升5 M氢氧化钠。
- 吸取20微升到384-孔组织培养板的孔中的骨胶原凝胶。将板在37℃组织培养孵化30分钟。
- 加入80微升的DMEM，每孔孵育15分钟，在37°C。取出培养基中，重复两次以上。
- 最后冲洗后，加入80微升10％FBS / DMEM中的每个孔，孵育过夜，在37℃下取出培养基，在此之前，加入分离的细胞。
3。消费税和消化的心
- 安乐死定时孕鼠在使用经批准的安乐死技术所需的胚胎一天。所有的实验都是在北卡罗莱纳大学教堂山分校的机构动物护理和使用委员会批准。
- 用鼠标在仰卧位，从优喷女性腹侧前用70％的乙醇清扫。使用镊子，抬起远离下腹部皮肤和肌肉内脏，剖开女性的下腹腔内脏可视化。
- 宫颈钳，小心地剪尾钳，从腹腔开始解除子宫角。虽然解除子宫角，剪去任何地方结缔组织持有的号角。要完成切除子宫角，与输卵管子宫角切结释放子宫角。
- 子宫角放置在培养皿中含有冷的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）漂洗根据需要。剖开子宫角，通过中线暴露所附的胚胎囊。
- 剖开交界处的胎盘和胚胎的胚囊，避免意外切割胚胎和胚胎检索。将胚胎在第二个培养皿用冷PBS。返回培养皿子宫角冰。
- ðecapitate胚胎提高访问胸壁。如果基因分型是必要的，割尾巴，将其删除，并保存在一个Eppendorf管置于冰上。
- 随着胚胎在它的后面，切开胸壁心脏和肺的可视化。为了避免切割心，使垂直切割沿侧的肋笼，附近的前肢，然后由水平切在底部的肋，然后，轻轻拉胸壁和出的方式。通过约胚胎13.5天，胸壁是透明的，可视化的帮助。
- 使用镊子小心地抬起心脏和削减以下的船只。然后，切成以上的大血管，释放心。如果不切肺血管可能会被删除，肺与心脏。因此，去除多余的组织，如肺部，如果必要的。
- 分离和丢弃从心室心房和大血管。用剪刀，肉切成小块（约1毫米3心室</支持>），并在约500μl的胶原酶（1毫克/毫升的无菌PBS中）。保持样品置于冰上，直到所有的心室已剁碎，并放置在胶原酶。
- 重复前面的步骤，直至心室已切除所有的胚胎，收集每一个心脏，在一个单独的Eppendorf管中。如果所有的胚胎具有相同的基因型，心中可能会集中在一个单一的Eppendorf管中。处理的样本的数目在一个单一的时间可能会受到限制，基于磁铁用于隔离; DynaMag（123-21D）这里使用的最多可容纳16 Eppendorf管中。
- 将肉末心室在37℃45分钟摇动。每15分钟，轻轻取出样品和吸管向上和向下机械分离细胞。
4。隔离的内皮细胞
- 通过脑室胶原酶溶液通过70微米的过滤器，以去除剩余的细胞团块。
- 离心细胞，在400×g离心10分钟。丢弃上清，更换约200微升10％FBS的DMEM，吸管向上和向下游离细胞。
- 一次重复前面的步骤。离心机的细胞在400×g离心10分钟后，第二个10％FBS / DMEM培养液洗涤。在50μl的10％FBS / DMEM培养液中重悬细胞。
- 在最后的离心步骤，准备珠。
- 将Eppendorf管中含有抗体和有孔玻璃珠上的磁铁，持续1分钟。
- 磁铁与管子的地方，去除上清。从磁铁取出试管，并添加约100微升10％FBS / DMEM。
- 管放置在磁体上，持续1分钟。除去上清液，并含10％FBS / DMEM培养液洗一遍。共洗3次重复上述步骤。
- 最后一次洗涤后，悬浮在10％FBS / DMEM培养液的抗体共轭的有孔玻璃珠（每个样品取5μl）。
- 到每个细胞样品，添加5μl的抗体共轭的有孔玻璃珠。将磁珠的细胞悬浮液在4℃下与摆动FOR 30分钟。
- 在层流罩中，将含有细胞和抗体结合的有孔玻璃珠上的磁铁1分钟的Eppendorf管中。取出上清液，从磁铁取出离心管，用约100微升10％FBS / DMEM。重复洗涤5次。
- 最后一次洗涤后，将管在磁体上，持续1分钟，除去上清液，并删除从磁体的管。新增约100微升DMEM。
- 将反应管在磁体上，持续1分钟，除去上清液，并取出离心管，从磁体。添加100-200微升0.25％胰蛋白酶-EDTA预热。孵育样品在37℃和5％CO 2中5分钟。
- 将反应管2分钟，在磁体上。含有细胞的上清小心转移到新鲜的Eppendorf管中。以400×g离心5分钟。
- 去除上清。重悬细胞在80-100微升生长培养基和板在96 - 或384以及处理过的培养皿中，根据预期收益率（约450-600细胞E14.5-E16.5胚胎脑室）。对于内皮细胞，使用内皮细胞生长培养基（定义见下文）。
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Representative Results
使用内皮特定的抗体，该抗体识别CD31，分离内皮细胞，胚胎（E）13.5（ 图1A）和18.5（ 图1B-1D）的胚胎从心室。当未处理的培养皿上生长，这些细胞保持圆形，将形成一个鹅卵石图案，如果附近汇合（ 图1A）。稀释胶原蛋白也被用于涂覆的孔，而内皮细胞将坚持（ 图1B），它们形成较少的链比镀上的胶原蛋白凝胶中（ 图1C和1D）。内皮细胞生长以及含有胶原凝胶（ 图1C和1D）形式细胞-细胞相互作用和开始分支生长时，在胶原蛋白的形式链，而这个过程在较胶原包被的骨胶原凝胶上生长时更快的速度发生板块。积极与这些内皮链标签的内皮标记物异凝集素（ 正从E18.5心室分离标签内皮细胞粘附分子（ 图2A）和Flk1的（ 图2B）。另外，住分离的内皮细胞可以被标记使用内皮特定的荧光染料祥发-16。 图2D显示了内皮细胞中分离出的E14.5胚胎心室与祥发-16标记的。 
图1。从小鼠胚胎脑室内皮细胞分离时形成链（A）明10倍的图像从E13.5心克过着与世隔绝心室内皮细胞生长在胶原凝胶。rown未处理的培养皿，甚至48小时后，细胞保持调整（B）的明视场图像的10倍的固定的离体大鼠心室从E18.5心脏血管内皮细胞生长在胶原包被的菜，24小时后，部分细胞已开始拉长（箭头），但大多停留四舍五入（箭头）。（C，D）固定孤立性心室从E18.5心的种植在胶原凝胶，在明（C）所示的内皮细胞共聚焦图像，并标有ISO外源凝集素（红色）。箭头指示部分的外源凝集素阳性细胞。 CD = 50微米的比例尺。 
图2。标签正从小鼠胚胎脑室内皮细胞内皮标记物（AC）固定隔离室从E18.5心脏生长的血管内皮细胞的共聚焦图像（40X）胶原涂层菜。这些细胞标记积极粘附分子（A）和Flk-1（B），阴性对照组（C）显示无荧光。在交流中，细胞核用DAPI（蓝色）标记（D）的荧光重叠（10）上生长的活孤立性心室从E14.5心脏内皮细胞的胶原凝胶。在细胞培养与活的内皮细胞标记物祥发-16（绿色），和使用时间推移显微镜观察迁移。
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Discussion
初级胚胎干细胞工作，让新颖的实验来解决发展在体外关键的步骤。然而，分离过程中是不平凡的。隔离任何类型的细胞的关键步骤包括确保细胞分离后，胶原酶消化，然后，他们悬浮在洗涤步骤。机械清扫通过移液大大有助于细胞分离在胶原酶步骤，过滤步骤除去细胞团块。这些措施提高人口的纯度和产量。
电镀密度也是一个显着的关注，从一个小器官分离细胞时。因为内皮细胞形成管依赖细胞密度7，我们依靠384孔组织培养板，电镀密度增加。即使有这样的考虑，我们不得不修改一些分析，以适应较低的细胞密度（Dyer和帕特森，亲GRESS）。因此，如果细胞数目是一个问题，一个较小尺寸的培养以及可能会减轻这个问题。
分离的原代细胞的另一个限制是抗体的特异性。即使是一个公认的内皮细胞特异性蛋白质如CD31有时，表现为成纤维细胞8。如果收获的细胞数允许为FAC，而不是分选，然后在血管内皮细胞和成纤维细胞可以分离的荧光强度。然而，最近的的FAC排序分析需要四个整个E10.5胚胎的胚胎内皮细胞产生足够的内皮细胞提取mRNA，表明这种技术，虽然功能强大，可能不适合较小的器官9。
因此，如果FAC排序是不可行的，以及其他的技术可以为提高人口纯度的。两步的选择过程中，细胞的阳性选择的一种抗体，然后负SEL连结失败绑定到第二个抗体影响，是一种替代的方法。成纤维细胞特异性标记FSP-1将是一个特定候选人10。另外，培养基中可排列的无L-缬氨酸，D-缬氨酸可以代替成纤维细胞是不能利用D-缬氨酸，因此不存活11,12。
尽管有这些限制和顾虑，可以在体外发育过程的分析进行了详细的研究初级胚胎细胞群。这种技术可以被应用到任何的胚胎的器官或区域，并允许在不同的胚胎阶段的细胞类型进行比较。原代细胞适当的缩放，即使是非常小的人口能够获得和分析。这些分析将提供重大洞察特定细胞亚群的行为，并随着时间的推移改变。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争经济利益。
Acknowledgments
我们想感谢Andrea波尔特布里的，批判性阅读的手稿，显微镜服务UNC援助与时间推移成像实验室，以及美国国立卫生研究院（授＃R01HL061656）的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercapt–thanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
| Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 | |
References
- Landecker, H. Culturing Life: How Cells Became Technologies. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).
- Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization. Oncogene. , (2012).
- Dyer, L. A., Patterson, C. Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity. Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).
- Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).
- Chang, L., Noseda, M. Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling. PNAS. 109, 5993-6998 (2012).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).
- Frauli, M., Ludwig, H. Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine. Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).
- Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media. Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).
- Arima, S., Nishiyama, K., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
