Summary
Primær cellekultur er en nyttig teknik til at analysere specifikke populationer af celler, især fra transgene mus embryoner på bestemte udviklingstrin. Heri er embryonale ventrikler dissekeret og dissocieret, og antistof-konjugerede perler genkende og adskille endothelcellerne til yderligere analyse.
Abstract
Cellekultur har i høj grad forbedret vores evne til at vurdere de enkelte populationer af celler under myriader dyrkningsbetingelser. Mens udødeliggjorte cellelinjer giver betydelige fordele for deres brugervenlighed, disse cellelinjer er utilgængelige for alle potentielle celletyper. Ved at isolere primære celler fra et bestemt område af interesse, især fra en transgen mus, kan mere nuancerede undersøgelser skal udføres. Den grundlæggende teknik indebærer dissekere organet eller delvis organ af interesse (f.eks hjerte eller en specifik region i hjertet) og adskille orglet til enkelte celler. Disse celler inkuberes derefter med magnetiske perler konjugeret til et antistof, som genkender celletype af interesse. Cellerne af interesse kan derefter isoleres ved anvendelse af en magnet, med en kort trypsin inkubation dissociere cellerne fra perlerne. Disse isolerede celler kan derefter dyrkes og analyseres som ønsket. Denne teknik blev oprindeligt designet til voksne mus orgels men kan let skaleres ned til brug med embryonale organer, som demonstreret heri. Fordi vores interesse er i udviklingslandene koronar kar, vi ønskede at studere denne population af celler i bestemte fosterstadiet. Således den oprindelige protokol skulle ændres for at være forenelig med den lille størrelse af de embryonale hjertekamrene og den lave potentielle udbytte af endotelceller på disse udviklingsstadier. Udnytte denne nedskaleret tilgang har vi vurderet koronar plexus remodeling i transgene embryonale ventrikulære endotelceller.
Introduction
Fremkomsten af udødeliggjorte cellelinier har revolutioneret grundlæggende cellebiologi 1.. De nuværende tilgængelige cellelinier afledt fra en bred vifte af organer og omfatter alle de vigtigste celletyper. Men etablerede cellelinjer har nogle begrænsninger. Processen med immortalisering naturligvis ændrer opførslen af celler, især med hensyn til levetid og proliferation, men kan også påvirke ekspressionen af uventede proteiner, såsom cytoskeletproteiner 2. Desuden, selv om mange forskellige cellelinier er tilgængelige der er stor spredning blandt selv en enkelt celletype i en hel organisme. Endotelceller viser især forskellige adfærd baseret på om de linje arterier eller vener og hvilken form for strømning er til stede i beholderen 3.. Endnu mere presserende fra et udviklingsmæssigt perspektiv, er imidlertid, at størstedelen af de tilgængelige cellelinier afledt fra voksent væv (se f.eks tHan samling tilgængelig via ATCC). Disse voksne cellelinjer sandsynligt ikke gentage den dynamiske karakter af deres embryonale forstadier. De hurtigt skiftende spatiotemporale genekspressionsmønstre observeret under udviklingen antyder også, at en endotelcelle fra et organ på et givet udviklingstrin ikke kan opføre sig på samme måde som en endotelcelle fra samme organ på et andet udviklingstrin.
Som et alternativ til anvendelse af kommercielt tilgængelige udødeliggjorte cellelinier, kan primære celler isoleres fra de specifikke væv af interesse. Blandt fordelene ved denne teknik, kan disse primære celler isoleres fra et specifikt organ eller blot en del af et organ på noget bestemt udviklingsstadiet. Endvidere kan disse primære celler isoleres fra den brede vifte af tilgængelige transgene dyr, tillader in vitro-undersøgelse af gen-knockout og knock-in og samtidig undgå andre problemer såsom transfektionseffektivitet. Ikke overraskende mangeteknikker er blevet offentliggjort beskriver hvordan at isolere specifikke celletyper 4,5. Generelt indebærer disse teknikker indsamler regionen af interesse, dissocierende cellerne, tagging den specifikke celletype af interesse, og isolere disse celler til yderligere analyse.
At studere en tidlig embryonisk population af koronare endotelceller, vi skaleret ned en tidligere offentliggjort teknik 4 til anvendelse med en mindre orgel. Med denne nedskaleret procedure, kan vi isolere de koronare endotelceller fra embryonale hjerte på bestemte fosterstadiet. Disse celler kan derefter bruges i traditionelle endotel assays, såsom migration analyser. Indtil begyndelsen af embryonale cellelinjer bliver mere udbredt, der arbejder med de primære celler er en uvurderlig teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Forbered Antistof-konjugerede perler
- En dag før dissektion, kombinere antistoffet af valg med de passende Dynabeads (f.eks rotte IgG Dynabeads for et antistof i rotte, 4 x 10 8 perler / ml) pr fabrikantens anvisninger. For BD rotte-anti-CD31-antistof (0,5 ug / ul, anvendt til at isolere endothelceller), er 3 pi antistof tilsat til hver 25 gl perler, til en slutkoncentration på 1,5 ug anti-CD31-antistof og 1 x 10 7 perler / 25 ul puffer.
- Inkuber perler og antistof natten over ved 4 ° C.
2.. Forberedelse af Collagen Plate
- Isolerede celler danner tubuli hurtigere, når de dyrkes på en kollagengel i modsætning til blot en kollagen-overtrukne plade. Derfor kollagengeler gjorde natten før dissektion, som beskrevet i 6.. På is i en vævskultur hætte, kombinere følgende reagenser (nok til 19 brønde): 206,4 ul sterilt H <sub> 2 O, 140,4 pi collagen type I (4,08 mg / ml), 38,4 pi 10x M199, og 1,15 pi 5 M NaOH.
- Afpipetteres 20 pi af denne kollagengel i brøndene på en 384-brønds plade til vævsdyrkning. Pladen anbringes i et 37 ° C vævskultur inkubator i 30 min.
- Der tilsættes 80 pi DMEM til hver brønd og inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C. Fjern kulturmediet og gentag to gange mere.
- Efter den sidste skylning, tilsættes 80 pi 10% FBS / DMEM til hver brønd og inkuberes natten over ved 37 ° C. Fjern kulturmediet før tilsætning af de isolerede celler.
3.. Skattestyrelsen og fordøje Heart
- Aflive en tidsbestemt gravid musen på den ønskede embryonale dag ved hjælp af en godkendt eutanasi teknik. Alle forsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug udvalg ved University of North Carolina i Chapel Hill.
- Med musen i liggende stilling, spray liberalt den ventrale side af kvinde med 70% ethanol førdissektion. Ved hjælp af pincet til at løfte den nedre abdominale hud og muskel væk fra de indre organer, skar hun nedre bughule at visualisere de indre organer.
- Holding livmoderhalsen med en pincet, forsigtigt skære caudale til pincet og begynde at løfte livmoderhorn fra bughulen. Mens du løfter livmoderhorn, skæres væk enhver bindevæv, der holder hornet på plads. At afslutte udtagelse uterushornet, skære krydset af uterushornet med æggelederen at befri uterushornet.
- Placer uterushornet i en petriskål indeholdende kold 1x phosphatpufret saltvand (PBS) og skylles efter behov. Skar livmoderhorn via midterlinjen at blotlægge de vedlagte embryonale sække.
- Skær åbne en embryonale sæk ved krydset af placenta og fosteret for at undgå uheld skære embryo og hente et foster. Placer embryo i en anden petriskål med kold PBS. Retur petriskålen med livmoderhorn til is.
- Decapitate embryonet at forbedre adgangen til brystvæggen. Hvis genotypebestemmelse er nødvendigt, skæres halen for at fjerne den og gemme i et Eppendorf rør, der anbringes på is.
- Med embryonet på ryggen, skar brystvæggen at visualisere hjertet og lungerne. For at undgå at skære i hjertet, lave en lodret snit langs siden af brystkassen, nær en forelimb, efterfulgt af en vandret snit på tværs i bunden af ribbenene, og derefter forsigtigt trække brystvæggen op og ud af vejen. Op gennem ca embryonale dag 13,5, brystvæggen er gennemsigtig, medvirken i visualisering.
- Løft forsigtigt hjertet ved hjælp af pincet og skære skibene nedenfor. Derefter skæres over de store skibe at frigøre hjertet. Hvis de pulmonale kar ikke er skåret, kan lungerne fjernes med hjertet. Således fjerne uvedkommende væv, ligesom lungerne, hvis det er nødvendigt.
- Adskil og kassér atrier og store fartøjer fra hjertekamrene. Med saks, hjertekamrene hakkekød i små stykker (ca. 1 mm 3 </ Sup>) og anbringes i 500 pi collagenase (1 mg / ml i sterilt PBS). Opbevare prøver på is indtil alle hjertekamrene er blevet hakket og anbragt i collagenase.
- Gentag de forrige trin, indtil hjertekamrene er blevet skåret fra alle embryoner, indsamling hver hjerte i en separat Eppendorf rør. Hvis alle fostre har samme genotype kan hjerter samles i et enkelt Eppendorf rør. Antallet af prøver behandlet på en enkelt gang, kan være begrænset på grundlag af magnet bruges til isolering, det DynaMag (123-21D), der anvendes her, holder højst 16 Eppendorf-rør.
- Placer hakket hjertekamrene ved 37 ° C med rocking i 45 min. Hver 15 min, forsigtigt fjerne prøverne og pipette op og ned til mekanisk dissociere cellerne.
4.. Isolere endotelcellerne
- Pass ventriklen-collagenase løsning gennem en 70 um filter til at fjerne tilbageværende klumper af celler.
- Centrifuger cellerne ved 400 xg i 10 min. Kassérsupernatanten, erstatte med ca 200 pi 10% FBS i DMEM, og pipette op og ned for at dissociere cellerne.
- Gentag det forrige trin én gang. Centrifuger cellerne ved 400 xg i 10 minutter efter den anden 10% FBS / DMEM vask. Cellerne i 50 pi 10% FBS / DMEM.
- Under den afsluttende centrifugeringstrin forberede perlerne.
- Anbring Eppendorf-rør indeholdende antistoffet og perler på en magnet i 1 min.
- Med røret på plads på magneten, supernatanten fjernes. Glasset fjernes fra magneten og tilsæt ca 100 gl 10% FBS / DMEM.
- Glasset anbringes på magnet for 1 min. Fjern supernatanten og vask igen med 10% FBS / DMEM. Gentag for i alt 3 vaske.
- Efter den sidste vask resuspenderes antistof-konjugerede perler i 10% FBS / DMEM (5 pi per prøve).
- Til hver celleprøve, 5 pi af de antistof-konjugerede perler tilføje. Placer perle-cellesuspensioner ved 4 ° C med rokkende for 30 min.
- I en laminar flow hætte, placere Eppendorf-rør indeholder celler og antistof-konjugerede perler på en magnet i 1 min. Fjern supernatanten fjernes rørene fra magneten, og vask med ca 100 gl 10% FBS / DMEM. Gentag for 5 gange.
- Efter den sidste vask, placere rørene på en magnet i 1 min, supernatanten fjernes, og fjerne rørene fra magneten. Tilsæt ca 100 pi DMEM.
- Anbring glassene på en magnet i 1 min, supernatanten fjernes, og fjerne rørene fra magneten. Tilføj 100-200 ml forvarmet 0,25% trypsin-EDTA. Inkuber prøverne ved 37 ° C og 5% CO2 i 5 minutter.
- Anbring glassene på magnet for 2 min. Omhyggeligt overføre celle-holdige supernatant til friske Eppendorf-rør. Centrifuger i 5 minutter ved 400 x g..
- Fjern supernatanten. Cellerne i 80-100 pi vækstmedium og pladen i en 96 - eller 384-godt behandlet kultur fad, afhængigt af det forventede udbytte(Ca. 450-600 celler fra hjertekamrene af E14.5-E16.5 embryoner). For endotelceller bruge endotelvækstfaktor dyrkningsmedium (defineret nedenfor).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug af en endotel-specifikt antistof, der genkender CD31, blev endotelceller isoleret fra hjertekamrene til embryonale (E) 13,5 (figur 1A) og 18,5 (fig. 1B-1D) embryoner. Når der dyrkes på en ubehandlet kultur fad, disse celler forbliver afrundet og vil danne et brosten mønster hvis nær sammenflydende (figur 1A). Fortyndet kollagen er også blevet anvendt til at coate brøndene, og mens endothelcellerne vil klæbe til det (figur 1B), danner de færre kæder end når udpladet på en kollagengel (fig. 1C og 1D). Endotelceller dyrket i en brønd indeholdende en kollagengel (fig. 1C og 1D) danner celle-celle interaktioner og danner kæder, som begynder at forgrene ved dyrkning på kollagen, og denne proces sker hurtigere, når de dyrkes på kollagengelen sammenlignet med collagen-coatede plade. Disse endotheliale kæder mærke positivt med endotel markør iso-lectin ( Endotelceller isoleret fra E18.5 ventrikler mærke positivt med PECAM (figur 2A) og Flk1 (figur 2B). Endvidere lever isolerede endothelceller kan mærkes med endotel-specifikke fluorescerende farvestof syto-16. Figur 2D viser endotelceller, der var isoleret fra ventrikler en E14.5 embryo og mærket med syto-16. 
Figur 1. Endotelceller isoleret fra embryonale mus ventriklerne danner kæder, når de dyrkes på en kollagengel. (A) Lysfelt 10x billede af levende isolerede ventrikulære endotelceller fra en E13.5 hjerte grown på en ubehandlet kultur skålen, selv efter 48 timer, forbliver cellerne afrundet (B) Lysfelt 10x billede af faste isolerede ventrikulære endotelceller fra en E18.5 hjerte dyrket på et kollagen-belagt skål,. efter 24 timer, har nogle celler påbegyndt forlængede (pil), men de fleste af dem bliver afrundet (pilespids). (C, D) Konfokale billeder af faste isolerede ventrikulære endotelceller fra en E18.5 hjerte dyrket på en kollagengel, vist i lysfelt (C) og mærket med iso -lectin (rød). Pile angiver nogle af de lectin-positive celler. Skalapanelerne i cd = 50 um. 
Figur 2. Endotelceller isoleret fra embryonale mus hjertekamrene mærke positivt for endotel markører. (AC) Konfokale billeder (40x) af faste isolerede ventrikulære endotelceller fra en E18.5 hjerte dyrket påen collagen-coatet skålen. Disse celler mærke positivt til PECAM (A) og Flk-1 (B), den negative kontrol (C) viser ingen fluorescens. I AC er kernerne mærket med DAPI (blå). (D) Fluorescent overlay (10x) af levende isolerede ventrikulære endotelceller fra en E14.5 hjerte dyrket på et kollagen gel. Cellerne blev inkuberet med live endotel markør syto-16 (grøn) og migration blev observeret ved anvendelse af time-lapse mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Arbejde med primære embryonale celler giver nye eksperimenter for at tage fat in vitro kritiske trin i udviklingen. Imidlertid isolation procedure er ikke trivielt. Kritiske trin til at isolere enhver type celler bl.a. sikre, at cellerne er godt adskilt på collagenasefordøjelse og så at de er godt suspenderet under vasketrinnene. Mekanisk dissektion ved pipettering i høj grad hjælper separere cellerne ved collagenase trin, og filtrering trin fjerner klumper af celler. Disse trin forbedring af befolkningens renhed og udbytte.
Klædningen tæthed er også et væsentligt problem, når isolere celler fra en lille orgel. Fordi endotel rør-dannelse er afhængig af celletætheden 7, påberåbt vi 384-brønds vævskulturplader at øge vores udpladningsdensitet. Selv med denne betragtning, har vi måttet ændre nogle analyser til at rumme en lavere celledensitet (Dyer og Patterson, i proGress). Så hvis celleantal er en bekymring, en mindre størrelse kultur vel kan mindske problemet.
En anden begrænsning ved isolering primære celler er specificiteten af antistoffet. Selv en anerkendt endotel-specifikt protein, såsom CD31 er undertiden udtrykkes af fibroblaster 8. Hvis den høstede celle nummer tillader FAC sortering stedet, så de endotelceller og fibroblaster kunne adskilles ved fluorescensintensitet. Men en nylig FAC sortering analyse af embryonale endotelceller kræves fire hele E10.5 embryoer til at producere nok endotelceller til mRNA udvinding, hvilket tyder på, at denne teknik, men kraftfuld, muligvis ikke egnet for mindre organer 9.
Så hvis FAC sortering ikke er muligt, kan andre teknikker anvendes til at forbedre befolkningens renhed. En totrins udvælgelsesproces, hvor cellerne er positivt selekteret ved ét antistof og derefter negativt selected af manglende binde til et andet antistof, er en alternativ fremgangsmåde. Fibroblast-specifik markør FSP-1 ville være en bestemt kandidat 10. Alternativt kan dyrkningsmediet bestilles uden L-valin, og D-valin kan tilsættes i stedet, fibroblaster er i stand til at udnytte D-valin og dermed ikke overlever 11,12.
På trods af disse begrænsninger og bekymringer giver studerer primære embryonale cellepopulationer for en detaljeret in vitro analyse af udviklingsprocesser. Denne teknik kan anvendes på ethvert organ eller område af embryonet og tillader en celletype, der skal sammenlignes på tværs af forskellige fosterstadiet. Med passende skalering, kan selv meget små populationer af primære celler skal indhentes og analyseres. Disse analyser vil give betydelig indsigt i, hvordan specifikke delmængder af celler opfører sig og ændre sig over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Andrea Portbury for kritisk læsning af manuskriptet, mikroskop service Laboratorium UNC for assistance med time-lapse imaging og NIH (tilskuddet # R01HL061656) til finansiering support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercapt–thanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
| Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 | |
References
- Landecker, H. Culturing Life: How Cells Became Technologies. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).
- Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization. Oncogene. , (2012).
- Dyer, L. A., Patterson, C. Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity. Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).
- Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).
- Chang, L., Noseda, M. Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling. PNAS. 109, 5993-6998 (2012).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).
- Frauli, M., Ludwig, H. Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine. Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).
- Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media. Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).
- Arima, S., Nishiyama, K., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
