Summary
Primaire celkweek is een nuttige techniek voor het analyseren van specifieke populaties van cellen, in het bijzonder van transgene muis embryo's op specifieke ontwikkelingsstadia. Hierin zijn embryonale ventrikels ontleed en gedissocieerd en antilichaam-geconjugeerde kralen herkennen en scheiden de endotheelcellen voor verdere analyse.
Abstract
Celcultuur is sterk verbeterd ons vermogen om individuele populaties van cellen te analyseren onder talloze kweekomstandigheden. Terwijl geïmmortaliseerde cellijnen bieden aanzienlijke voordelen voor hun gebruiksgemak, deze cellijnen zijn beschikbaar voor alle mogelijke celtypes. Door het isoleren van primaire cellen uit een bepaalde regio van belang zijn uit een transgene muis, kan genuanceerder studies worden uitgevoerd. De basistechniek behelst het ontleden van de orgaan-of gedeeltelijke orgaan van belang (bijvoorbeeld het hart of een bepaalde regio van het hart) en dissociëren het orgel om enkele cellen. Deze cellen worden vervolgens geïncubeerd met magnetische beads geconjugeerd met een antilichaam dat het celtype herkent. De cellen plaats kan vervolgens worden geïsoleerd met behulp van een magneet met een korte trypsine incubatie dissociëren van de cellen van de bolletjes. De geïsoleerde cellen kunnen daarna worden gekweekt en geanalyseerd zoals gewenst. Deze techniek werd oorspronkelijk ontworpen voor volwassen muis orgels maar kan eenvoudig naar beneden worden geschaald voor gebruik met embryonale organen, zoals hierin aangetoond. Omdat ons belang in de coronaire vasculatuur, wilden wij deze populatie van cellen te bestuderen tijdens specifieke embryonale stadia. Dus het oorspronkelijke protocol moesten worden aangepast verenigbaar met de kleine omvang van de embryonale ventrikels en de lage potentiële opbrengst van endotheelcellen in deze ontwikkelingsstadia zijn. Gebruik makend van deze verkleinde aanpak, hebben we coronaire plexus remodeling beoordeeld in transgene embryonale ventriculaire endotheelcellen.
Introduction
De komst van onsterfelijk gemaakte cellijnen heeft een revolutie fundamentele celbiologie 1. De momenteel beschikbare cellijnen zijn afgeleid van een groot aantal organen en omvatten alle belangrijke celtypes. Echter, gevestigde cellijnen hebben een aantal beperkingen. Werkwijze immortalisatie verandert duidelijk het gedrag van de cellen, in het bijzonder met betrekking tot levensduur en proliferatie, maar kan ook invloed op de expressie van onverwachte eiwitten, zoals cytoskeleteiwitten 2. Bovendien, hoewel vele verschillende cellijnen zijn er aanzienlijke verschillen tussen zelfs een celtype van een compleet organisme. Endotheelcellen in bepaalde show diverse gedragingen op basis van of ze online slagaders of aders en wat voor soort stroom is aanwezig in het vat 3. Nog dringender vanuit een ontwikkelingsperspectief is echter dat de meeste van de beschikbare cellijnen zijn afgeleid van volwassen weefsel (zie bijvoorbeeld tHij collectie verkrijgbaar via ATCC). Deze volwassen cellijnen waarschijnlijk niet herhalen de dynamiek van de embryonale voorlopers. De snel veranderende spatiotemporele genexpressiepatronen waargenomen tijdens de ontwikkeling suggereren ook dat een endotheelcel van het ene orgaan op een bepaald ontwikkelingsstadium kan niet op dezelfde manier gedragen als een endotheel cel die hetzelfde orgaan in een ander ontwikkelingsstadium.
Als alternatief voor het gebruik commercieel beschikbare geïmmortaliseerde cellijnen, primaire cellen kunnen worden geïsoleerd uit het specifieke weefsel van belang. Onder de voordelen van deze techniek, kunnen deze primaire cellen worden geïsoleerd uit een specifiek orgaan of deel van een orgaan op specifieke ontwikkelingsfase. Verder kunnen deze primaire cellen worden geïsoleerd uit de grote verscheidenheid aan beschikbare transgene dieren, waarbij de in vitro studie van gen knockout en knock-in terwijl het vermijden andere problemen zoals transfectie efficiëntie. Niet verrassend, veeltechnieken zijn gepubliceerd die uitleggen hoe je isoleren specifieke celtypen 4,5. In het algemeen omvatten het verzamelen van deze technieken het gebied van belang, het dissociëren van de cellen, tagging het specifieke celtype van belang, en het isoleren van deze cellen voor verdere analyse.
Een vroege embryonale populatie van coronaire endotheelcellen bestuderen we verkleind een eerder gepubliceerde techniek 4 voor gebruik met een kleinere orgel. Met deze verkleinde procedure, kunnen we isoleren de coronaire endotheelcellen van het embryonale hart op specifieke embryonale stadia. Deze cellen kunnen vervolgens worden gebruikt in de traditionele endotheliale assays, zoals migratie analyse. Tot de vroege embryonale cellijnen steeds vaker, het werken met de primaire cellen is een onschatbare techniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereid antilichaam-geconjugeerd Beads
- Een dag voor dissectie, combineren het antilichaam van keuze van de geschikte Dynabeads (bijvoorbeeld rat IgG Dynabeads een antilichaam opgewekt in rat, 4 x 10 8 kralen / ml) volgens de instructies van de fabrikant. Voor de BD rat anti-CD31-antilichaam (0,5 ug / ul, gebruikt om endotheelcellen te isoleren), 3 gl antilichaam wordt toegevoegd per 25 ul kralen, voor een uiteindelijke concentratie van 1,5 ug anti-CD31 antilichaam en 1 x 10 7 kralen / 25 pi buffer.
- Incubeer kralen en antilichaam overnacht bij 4 ° C.
2. Voorbereiden van de Collageen Plate
- Geïsoleerde cellen vormen tubuli sneller wanneer gegroeid op een collageengel in tegenstelling tot slechts een collageen-gecoate plaat. Daarom zijn collageen gels die de avond voor de dissectie, zoals beschreven in 6. Op ijs in een weefselkweek kap, combineren de volgende reagentia (genoeg voor 19 putten): 206,4 pi steriel H <sub> 2 O, 140,4 ul collageen type I (4,08 mg / ml), 38,4 gl 10x M199 en 1,15 pl 5 M NaOH.
- Pipetteer 20 ul van dit collageen gel in de putjes van een 384-well weefselkweek platen. Plaats de plaat in een 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 30 minuten.
- Voeg 80 ul DMEM aan elk putje en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Verwijder het kweekmedium en herhaal twee keer meer.
- Na de laatste spoeling, voeg 80 ul 10% FBS / DMEM aan elk putje en incubeer overnacht bij 37 ° C. Verwijder het kweekmedium voorafgaand aan het toevoegen van de geïsoleerde cellen.
3. Accijnzen en Digest het Hart
- Euthanaseren een timed-zwangere muis op de gewenste embryonale dag met behulp van een goedgekeurde euthanasie techniek. Alle experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill.
- Met de muis in rugligging, royaal spuiten de ventrale zijde van de vrouw met 70% ethanol voorafgaand aandissectie. Met behulp van een tang om de onderbuik huid en spieren weg te tillen van de inwendige organen, opengesneden lagere buikholte van het vrouwtje om de interne organen te visualiseren.
- Houd de cervix met een tang, knip voorzichtig caudaal van de forceps en beginnen heffen de uterushoorn van de buikholte. Terwijl het opheffen van de baarmoeder hoorn, weggesneden eventuele bindweefsel dat de hoorn op zijn plaats houdt. Om te eindigen uitsnijden van de baarmoeder hoorn, snijd de kruising van de baarmoeder hoorn met de eileider naar de baarmoeder hoorn bevrijden.
- Plaats de baarmoeder hoorn in een petrischaal met koude 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en spoelen indien nodig. Knip de baarmoedertak via de middellijn naar de bijgevoegde embryonale zakken bloot.
- Knip een embryonale zak op de kruising van de placenta en het embryo te voorkomen dat per ongeluk het snijden van het embryo en halen een embryo. Plaats de embryo in een tweede petrischaal met koude PBS. Terug de petrischaal met de baarmoedertak om ijs.
- Decapitate de embryo toegang tot de borstwand verbeteren. Als genotypering is nodig, snijd de staart om het te verwijderen en op te slaan in een Eppendorf buis op ijs geplaatst.
- Met het embryo op zijn rug, opengesneden de borstwand naar het hart en de longen te visualiseren. Om te vermijden dat het hart, maak een verticale snede langs de kant van de ribbenkast, in de buurt van een voorpoot, gevolgd door een horizontale snede over de bodem van de ribben, dan, trek de borstwand omhoog en uit de weg. Omhoog door ongeveer embryonale dag 13,5, de borstwand is transparant, hulp in de visualisatie.
- Til het hart met behulp van een tang en snijd onder de schepen. Vervolgens snijd boven de grote vaten naar het hart te bevrijden. Indien de longvaten niet worden gesneden, kunnen de longen worden verwijderd met het hart. Zo verwijdert vreemde weefsels, zoals de longen, indien nodig.
- Scheiden en gooi de atria en de grote vaten van de ventrikels. Met een schaar, gehakt de ventrikels in kleine stukjes (ca. 1 mm 3 </ Sup>) en plaats in ongeveer 500 pi collagenase (1 mg / ml in steriele PBS). Blijf monsters op ijs totdat alle ventrikels zijn gehakt en geplaatst in collagenase.
- Herhaal de vorige stappen totdat de ventrikels zijn uitgesneden uit alle embryo's, het verzamelen van elk hart in een aparte Eppendorf buis. Als alle embryo's hebben hetzelfde genotype, kan harten worden samengevoegd in een enkele Eppendorf buis. Het aantal verwerkte in een keer monsters kan worden beperkt op basis van de magneet gebruikt voor isolatie, de DynaMag (123-21D) die hier kan maximaal 16 Eppendorf buizen.
- Plaats gehakt ventrikels bij 37 ° C gedurende 45 minuten schommelen. Elke 15 min, verwijder voorzichtig de monsters en pipet op en neer om mechanisch scheiden van de cellen.
4. Het isoleren van de endotheelcellen
- Voorbij het ventrikel-collagenase oplossing door een 70 um filter om resterende groepjes van cellen te verwijderen.
- Centrifugeer de cellen bij 400 g gedurende 10 minuten. Afdankende supernatant vervangen ongeveer 200 pi 10% FBS in DMEM en pipet op en neer om de cellen dissociëren.
- Eenmaal herhalen de vorige stap. Centrifugeer de cellen bij 400 g gedurende 10 minuten na de tweede 10% FBS / DMEM wassen. Resuspendeer de cellen in 50 ui 10% FBS / DMEM.
- Tijdens de laatste centrifugatie stap bereiden de kralen.
- Plaats de Eppendorf buis met het antilichaam en kralen op een magneet gedurende 1 minuut.
- Met de buis op zijn plaats op de magneet, de bovenstaande vloeistof. Haal de buis uit de magneet en voeg ongeveer 100 ul 10% FBS / DMEM.
- Plaats de buis op de magneet gedurende 1 minuut. Verwijder de bovenstaande vloeistof en opnieuw wassen met 10% FBS / DMEM. Herhalen voor een totaal van 3 wasbehandelingen.
- Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de antilichaam-geconjugeerde kralen in 10% FBS / DMEM (5 ul per monster).
- Aan elk celmonster, voeg 5 ul van het antilichaam-geconjugeerde kralen. Plaats de kraal-celsuspensies bij 4 ° C met schudden for 30 min.
- In een laminaire stroming kap, plaats de Eppendorf buizen met cellen en antilichaam-geconjugeerde kralen op de magneet gedurende 1 minuut. Verwijder de bovenstaande vloeistof, verwijder de buizen van de magneet, en was met ongeveer 100 ul 10% FBS / DMEM. Herhaal dit voor 5 wasbeurten.
- Na de laatste wasbeurt, plaatst de buizen op de magneet gedurende 1 min., de bovenstaande vloeistof, en verwijder de buizen van de magneet. Voeg ongeveer 100 ul DMEM.
- Plaats de buizen op de magneet gedurende 1 min., de bovenstaande vloeistof, en verwijder de buizen van de magneet. 100-200 voeg ul voorverwarmd 0,25% trypsine-EDTA. Incubeer de monsters bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 5 minuten.
- Plaats de buizen op de magneet gedurende 2 minuten. Overdracht van de cel-bevattende supernatant voorzichtig om verse Eppendorf buizen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g.
- Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 80-100 pi groeimedium en de plaat in een 96 - of 384-goed behandeld kweekschaal, afhankelijk van de verwachte opbrengst(Circa 450-600 cellen van de ventrikels van E14.5-E16.5 embryo's). Voor endotheelcellen, gebruiken endothelial growth kweekmedium (hieronder gedefinieerd).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van een endotheel-specifieke antilichaam dat CD31 herkent, werden endotheelcellen geïsoleerd uit de ventrikels van embryonale (E) 13.5 (figuur 1A) en 18,5 (figuren 1B-1D) embryo. Wanneer gekweekt op een onbehandelde cultuur schotel, deze cellen blijven afgerond en zou een geplaveide patroon te vormen indien in de buurt samenvloeiing (Figuur 1A). Verdun collageen is ook gebruikt voor het bekleden van de putjes, en terwijl de endotheliale cellen aan houden (Figuur 1B), vormen zij ketens minder dan wanneer uitgeplaat op een collageengel (figuren 1C en 1D). Endotheliale cellen gekweekt in een putje met een collageen gel (figuren 1C en 1D) vormen cel-cel interacties en vorm ketens die beginnen te vertakken wanneer gekweekt op collageen, en dit proces treedt sneller wanneer gegroeid op de collageengel vergeleken met collageen beklede plaat. Deze endotheliale ketens labelen positief met de endotheliale merker iso-lectine ( Endotheelcellen geïsoleerd uit E18.5 ventrikels labelen positief met PECAM (Figuur 2A) en Flk1 (figuur 2B). Verder leven geïsoleerde endotheelcellen codeerbaar met de endotheel-specifieke fluorescente kleurstof Syto-16. Figuur 2D toont endotheelcellen die werden geïsoleerd uit de ventrikels van een E14.5 embryo en voorzien Syto-16. 
Figuur 1. Endotheelcellen geïsoleerd uit embryonale muis ventrikels (A) Helderveld 10x afbeelding van levende geïsoleerde ventriculaire endotheelcellen van een E13.5 hart g vormen ketens wanneer gegroeid op een collageen gel.rown op onbehandelde kweekschaal, zelfs na 48 uur, cellen blijven afgerond (B) 10x Helderveld beeld van vaste geïsoleerde ventriculaire endotheelcellen vanuit E18.5 hart gekweekt op collageen gecoate schaal;. na 24 uur, een aantal cellen begonnen verlengen (pijl), maar de meesten van hen blijven afgeronde (pijlpunt). (C, D) confocale beelden van vaste geïsoleerde ventriculaire endotheelcellen van een E18.5 hart gekweekt op een collageen-gel, weergegeven in helderveld (C) en voorzien van iso -lectine (rood). Pijlen geven enkele van de lectine-positieve cellen. Schaalbalken CD = 50 urn. 
Figuur 2. Endotheelcellen geïsoleerd uit embryonale muis ventrikels labelen positief voor endotheliale markers. (AC) confocale beelden (40x) van vaste geïsoleerde ventriculaire endotheelcellen van een E18.5 hart geteeld opeen collageen-gecoate schaal. Deze cellen label positief voor PECAM (A) en Flk-1 (B), de negatieve controle (C) toont geen fluorescentie. In AC, worden de kernen gelabeld met DAPI (blauw). (D) TL overlay (10x) van levende geïsoleerde ventriculaire endotheelcellen vanuit E14.5 hart gekweekt op een collageengel. De cellen werden geïncubeerd met de live-endotheliale merker Syto-16 (groen), en migratie werd waargenomen met behulp van time-lapse microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Werken met primaire embryonale cellen stelt nieuwe experimenten aan te pakken in vitro kritische stappen van de ontwikkeling. De isolatie moet niet triviaal. Kritische stappen voor het isoleren van elk type cellen onder meer in dat de cellen goed worden gescheiden op collagenase spijsvertering en dan dat ze goed zijn opgehangen tijdens het wassen stappen. Mechanische dissectie door pipetteren enorm helpt scheiden de cellen tijdens de collagenase stap, en het filteren stap verwijdert groepjes van cellen. Deze stappen verbeteren populatie zuiverheid en opbrengst.
De uitplaatdichtheid is een belangrijke zorg bij het isoleren van cellen uit een klein orgaan. Omdat endothelial tube-vorming hangt af van de celdichtheid 7 gebruikten we 384-putjes weefselkweekplaten onze plating dichtheid te verhogen. Zelfs met deze overweging, moesten we een aantal analyses te wijzigen naar een lagere celdichtheid (Dyer en Patterson, in pro tegemoetGress). Dus, als het aantal cellen is een punt van zorg, een kleiner formaat cultuur goed kan het probleem verminderen.
Een andere beperking van het isoleren van primaire cellen is de specificiteit van het antilichaam. Zelfs een erkende endotheel-specifieke proteïne zoals CD31 gegoten wordt door fibroblasten 8. Als het aantal cellen geoogst maakt FAC sorteren plaats dan de endotheelcellen en fibroblasten kunnen worden gescheiden door de fluorescentie-intensiteit. Uit een recente FAC sortering analyse van embryonale endotheelcellen vereist vier volledige E10.5 embryo voldoende endotheelcellen voor mRNA extractie produceren, wat suggereert dat deze techniek, maar krachtige, niet geschikt voor kleinere organen 9 zijn.
Dus als FAC sorteren niet mogelijk, andere technieken kunnen worden toegepast voor het verbeteren populatie zuiverheid. Een twee stappen, waarbij de cellen positief met een antilichaam geselecteerd en vervolgens negatief selected door het niet binden aan een tweede antilichaam, een alternatieve benadering. De fibroblast-specifieke marker FSP-1 zou een bepaalde kandidaat 10 zijn. Alternatief, kan het kweekmedium worden verwezen zonder L-valine, en D-valine kan worden toegevoegd in plaats; fibroblasten geen D-valine gebruiken en dus niet overleven 11,12.
Ondanks deze beperkingen en problemen, het bestuderen van primaire embryonale celpopulaties zorgt voor een gedetailleerde in vitro analyse van ontwikkelingsprocessen. Deze techniek kan worden toegepast op elk orgaan of gebied van het embryo en kan een celtype te vergelijken tussen verschillende embryonale stadia. Met de juiste schaal, kunnen zelfs zeer kleine populaties van primaire cellen worden verkregen en geanalyseerd. Deze analyses zullen aanzienlijk inzicht in hoe specifieke subsets van cellen zich gedragen en veranderen in de tijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij willen Andrea Portbury bedanken voor het kritisch lezen van het manuscript, de microscoop Dienst Laboratorium van UNC voor hulp bij de time-lapse imaging, en de NIH (subsidie # R01HL061656) voor financiële steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercapt–thanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
| Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 | |
References
- Landecker, H. Culturing Life: How Cells Became Technologies. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).
- Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization. Oncogene. , (2012).
- Dyer, L. A., Patterson, C. Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity. Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).
- Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).
- Chang, L., Noseda, M. Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling. PNAS. 109, 5993-6998 (2012).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).
- Frauli, M., Ludwig, H. Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine. Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).
- Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media. Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).
- Arima, S., Nishiyama, K., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
