Summary
Primær cellekultur er en nyttig teknikk for å analysere spesifikke populasjoner av celler, spesielt fra transgene mus embryoer på bestemte utviklingsstadier. Heri, er embryonale ventriklene dissekert og distanserte, og antistoff-konjugert perler gjenkjenne og skille ut de endotelceller for videre analyse.
Abstract
Cellekultur har kraftig forbedret vår evne til å vurdere enkelte populasjoner av celler etter utallige kultur forhold. Mens udødeliggjort cellelinjer gi betydelige fordeler for sin brukervennlighet, disse cellelinjene er utilgjengelige for alle potensielle celletyper. Ved å isolere primære celler fra et bestemt område av interesse, spesielt fra en transgen mus, kan mer nyanserte studier utføres. Den grunnleggende teknikken innebærer dissekere organ eller delvis organ av interesse (f.eks hjerte eller en bestemt region av hjertet) og dissociating orgelet til enkeltceller. Disse cellene blir deretter inkubert med magnetiske perler er konjugert til et antistoff som gjenkjenner den celletype av interesse. Cellene av interesse kan deretter bli isolert ved bruk av en magnet, med en kort inkubasjon trypsin dissosiere cellene fra kulene. Disse isolerte celler kan deretter bli dyrket og analysert som ønsket. Denne teknikken ble opprinnelig utviklet for voksen mus organs men kan lett skaleres ned for bruk med embryonale organer, som demonstrert heri. Fordi vår interesse ligger i å utvikle koronar blodkar, ønsket vi å undersøke dette populasjon av celler under bestemte embryonale stadier. Således hadde den opprinnelige protokoll for å bli modifisert for å være kompatibel med den lille størrelsen på de embryonale ventrikler og lave potensial utbytte av endotelceller på disse utviklingsstadier. Utnytte denne nedskalert tilnærming, har vi vurdert koronar plexus ombygging i transgene embryonale ventrikulære endotelceller.
Introduction
Ankomsten av udødeliggjort cellelinjer har revolusjonert grunnleggende cellebiologi en. De for tiden tilgjengelige cellelinjer er avledet fra et bredt spekter av organer og omfatter alle de store celletyper. Imidlertid etablerte cellelinjer har noen begrensninger. Prosessen med immortalization tydeligvis endrer oppførselen av cellene, spesielt med hensyn til levetid og proliferasjon, men kan også påvirke ekspresjonen av uventede proteiner, slik som proteiner cytoskeletal 2. I tillegg, selv om mange forskjellige cellelinjer er tilgjengelige, er det vesentlig diversitet blant til og med en enkelt celle type innenfor en hel organisme. Endotelceller særlig vise ulike atferd basert på om de stiller arterier eller årer og hva slags flyt er til stede i fartøyet tre. Enda mer presserende fra et utviklingsperspektiv, er imidlertid at de aller fleste av de tilgjengelige cellelinjer er avledet fra voksent vev (se f.eks tHan samlingen tilgjengelig via ATCC). Disse voksne cellelinjer sannsynlig ikke rekapitulere de dynamiske egenskapene til sine embryonale forløpere. De raskt skiftende tid og rom genuttrykksmønster observert under utvikling tyder også på at en endotelceller fra ett organ på et gitt utviklingsstadiet ikke kan oppføre seg på samme måte som en endotelceller fra at samme organ på et annet utviklingstrinn.
Som et alternativ til å bruke kommersielt tilgjengelige immortaliserte cellelinjer, kan primære celler isoleres fra den spesifikke vev av interesse. Blant fordelene med denne teknikken, kan disse primære celler isoleres fra et bestemt organ eller en del av et organ til enhver spesifikk utviklingsstadiet. Videre kan disse primære celler isoleres fra et stort utvalg av tilgjengelige transgene dyr, slik at in vitro-undersøkelse av genet knockout og knock-in og unngå andre problemer som transfeksjon effektivitet. Ikke overraskende, mangeteknikker har blitt publisert informasjon om hvordan å isolere bestemte celletyper 4,5. Generelt involverer disse teknikker samle regionen av interesse, dissosiere cellene, merking den spesifikke celletype av interesse, og å isolere disse cellene for ytterligere analyse.
For å studere en tidlig embryonisk populasjon av koronare endoteliale celler, skalert vi ned en tidligere publisert teknikk 4, for bruk med en mindre organ. Med denne nedskalert prosedyre, kan vi isolere koronar endotelceller fra embryonale hjertet på bestemte embryonale stadier. Disse cellene kan deretter brukes i tradisjonelle endoteliale assays, for eksempel flytteanalyser. Inntil tidlig på embryonale cellelinjer blir mer utbredt, som arbeider med de primære celler er en uvurderlig teknikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Forbered Antistoff-konjugerte perler
- En dag før disseksjon, kombinere antistoff av valget med de riktige Dynabeads (f.eks rotte IgG Dynabeads for et antistoff oppvokst i rotte, 4 x 10 8 perler / ml) per produsentens instruksjoner. For BD rotte anti-CD31-antistoff (0,5 ug / mL, som brukes for å isolere endotelceller), blir 3 pl antistoff tilsatt for hver 25 pl perler, for en endelig konsentrasjon på 1,5 ug anti-CD31-antistoff og 1 x 10 7 perler / 25 pl buffer.
- Inkuber perler og antistoff over natten ved 4 ° C.
2. Klargjøring av kollagen Plate
- Isolerte celler danner tubuli raskere når dyrket på en kollagen gel i motsetning til bare en kollagen-belagt plate. Derfor er kollagen geler gjort natten før disseksjonen, som beskrevet i 6.. På isen i en vev kultur hette, kombinerer du følgende reagenser (nok til 19 brønner): 206,4 ul steril H <sub> 2 O, 140,4 pl kollagen type I (4,08 mg / ml), 38,4 pl 10x M199, og 1,15 pl 5 M NaOH.
- Pipetter 20 ul av dette kollagen gel inn i brønnene til en 384-brønners vevkulturplate. Sett platen i en 37 ° C-vevskultur-inkubator i 30 min.
- Tilsett 80 mL DMEM til hver brønn og inkuber i 15 min ved 37 ° C. Fjern kulturmediet og gjentas to ganger mer.
- Etter siste skylling, tilsett 80 mL 10% FBS / DMEM til hver brønn og inkuberes over natten ved 37 ° C. Fjern kulturmediet før tilsetning av isolerte celler.
3. Avgiftsdirektoratet og fordøye the Heart
- Avlive en tidsstyrt gravid musen på ønsket embryonale dag med en godkjent dødshjelp teknikk. Alle forsøkene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of North Carolina at Chapel Hill.
- Med musen i ryggleie, liberalt spray ventrale siden av den kvinnelige med 70% etanol førdisseksjon. Ved å anvende pinsett til å løfte den nedre abdominal hud og muskel bort fra de indre organer, skjære opp den kvinnelige nedre underlivs hulrom for å visualisere de indre organer.
- Holder livmorhalsen med tang, må du kutte kaudal til tang og begynne å løfte livmor horn fra bukhulen. Mens du løfter livmor horn, skjære bort bindevev som holder hornet på plass. Å fullføre excising livmor horn, kuttet krysset av livmor horn med oviduct å frigjøre livmor horn.
- Plasser uterine horn i en petriskål inneholdende kald 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) og skyll etter behov. Klipp opp livmor horn via midtlinjen for å eksponere de vedlagte embryonale sekker.
- Klipp opp en embryonale sac ved krysset mellom morkaken og fosteret for å unngå uhell kutte embryo og hente et embryo. Plasser embryoet i en andre petriskål med kald PBS. Returnere petriskål med livmor horn til is.
- Decapitate embryoet å bedre tilgangen til brystveggen. Hvis genotyping er nødvendig, klippe halen å fjerne det og lagre i en Eppendorf rør plasseres på is.
- Med fosteret på ryggen, kutte åpne brystveggen å visualisere hjertet og lungene. For å unngå å skjære hjertet, gjør et vertikalt snitt langs siden av brystkassen, nær en forbena, etterfulgt av en horisontal kutt over bunnen av ribbeina, deretter dra forsiktig i brystveggen opp og ut av veien. Opp gjennom ca embryonale dag 13.5, er brystveggen gjennomsiktig, hjelpe på visualisering.
- Løft forsiktig hjerte med tang og kutte fartøyene under. Deretter kuttet over de store fartøyene å frigjøre hjertet. Ved pulmonal fartøyene ikke er kuttet, kan lungene fjernes med hjertet. Således fjerner overflødig vev, slik som lungene, om nødvendig.
- Separer og kast atriene og flott skip fra ventriklene. Ved hjelp av saks, hakke ventriklene i små biter (ca 1 mm 3 </ Sup>) og plasser i ca 500 mL collagenase (1 mg / ml i steril PBS). Hold prøvene på is inntil alle ventriklene har blitt plassert i hakket og kollagenase.
- Gjenta de forrige trinnene til ventriklene har blitt fjernet fra alle embryoer, samle hvert hjerte i en egen Eppendorf tube. Hvis alle embryoer har samme genotype, kan hjerter samles i en enkelt Eppendorf-rør. Antallet prøver behandlet på én gang kan være begrenset basert på magneten brukes for isolasjon, den DynaMag (123-21D) som er brukt her har maksimalt 16 Eppendorf-rør.
- Plasser de hakket ventriklene ved 37 ° C med gående i 45 min. Hvert 15 min, fjern forsiktig prøvene og pipetter opp og ned for å mekanisk dissosiere cellene.
4. Isolere endotelceller
- Pass ventrikkelen-collagenase løsningen gjennom et 70 mikrometer filter for å fjerne gjenværende klumper av celler.
- Sentrifuger cellene ved 400 xg i 10 min. Kastsupernatanten, erstatt med omtrent 200 ul 10% FBS i DMEM, og pipetter opp og ned for å dissosiere cellene.
- Gjenta det forrige trinnet en gang. Sentrifuger cellene ved 400 xg i 10 min etter den andre 10% FBS / DMEM vask. Resuspender cellene i 50 mL 10% FBS / DMEM.
- Under den avsluttende sentrifugeringstrinnet, forberede perlene.
- Plasser Eppendorf rør som inneholder antistoff og perler på en magnet for 1 min.
- Med røret på plass på magneten, fjern supernatanten. Fjerne røret fra magneten og tilsettes ca 100 ul 10% FBS / DMEM.
- Plasser røret på magneten i 1 min. Fjern supernatanten og vask igjen med 10% FBS / DMEM. Gjenta til totalt tre vaskinger.
- Etter den siste vaskingen, resuspender antistoff-konjugerte perler i 10% FBS / DMEM (5 mL per prøve).
- Til hver celleprøve, tilsett 5 pl av antistoff-konjugerte perler. Plasser de perle-cellesuspensjoner ved 4 ° C med vuggende FOr 30 min.
- I en laminær hette, plasserer Eppendorf rør som inneholder celler og antistoff-konjugert perler på magneten i 1 min. Fjern supernatanten, fjerne rørene fra magneten, og vask med ca 100 ul 10% FBS / DMEM. Gjenta for fem gangers vask.
- Etter den siste vaskingen, plasser rørene på magneten i 1 min, fjern supernatanten og fjerne rørene fra magneten. Legg ca 100 mL DMEM.
- Plasser rørene på magneten i 1 min, fjern supernatanten og fjerne rørene fra magneten. Legg 100-200 ul forvarmet 0,25% trypsin-EDTA. Inkuber prøvene ved 37 ° C og 5% CO2 i 5 min.
- Plasser rørene på magneten i 2 min. Nøye overføre celle-holdig supernatant til ferske Eppendorf-rør. Sentrifuger i 5 min ved 400 x g.
- Fjern supernatanten. Resuspender cellene i 80-100 pl vekstmedium og plate i et 96 - eller 384-brønners behandlet kultur tallerken, avhengig av det forventede utbytte(Ca 450-600 celler fra ventriklene av E14.5-E16.5 embryo). For endotelceller, bruk endotelial vekst dyrkingsmedium (definert nedenfor).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruke en endotelial-spesifikt antistoff som gjenkjenner CD31, ble endotelceller isolert fra ventriklene av embryonale (E) 13,5 (figur 1A) og 18,5 (figur 1B-1D) embryoer. Når dyrket på en ubehandlet kultur fatet, disse cellene forblir avrundet og vil danne en brostein mønster hvis nær konfluent (figur 1A). Fortynne kollagen har også blitt brukt til å belegge brønner, og mens endotelceller vil følge det (figur 1B), danner de færre kjedene enn når belagt på en kollagen gel (Tall 1C og 1D). Endotelceller dyrket i en brønn inneholdende en kollagen gel (figurene 1C og 1D) danner celle-celle interaksjoner og danner kjeder som begynner å grenen når dyrket på kollagen, og denne prosessen skjer raskere når dyrket på kollagen gel sammenlignet med kollagen-belagt plate. Disse endotelceller kjedene merke positivt med endotelial markør iso-lektin ( Endotelceller isolert fra E18.5 ventriklene merke positivt med PECAM (Figur 2A) og Flk1 (figur 2B). Videre bor isolerte endotelceller kan merkes ved hjelp av endotelial-spesifikke fluorescerende fargestoff Syto-16. Figur 2D viser endotelceller som ble isolert fra ventriklene i en E14.5 embryo og merket med Syto-16. 
Figur 1. Endotelceller isolert fra embryonale mus ventriklene danne kjeder når dyrket på en kollagen gel. (A) Lysfelt 10x bilde av levende isolerte ventrikulære endotelceller fra en E13.5 hjerte grown på en ubehandlet kultur fatet, selv etter 48 timer, celler forblir avrundet (B) Lysfelt 10x bilde av faste isolerte ventrikulære endotelceller fra en E18.5 hjerte dyrket på en kollagen-belagt parabolen;. etter 24 timer, har noen celler begynt elongating (pil), men de fleste av dem er fortsatt avrundet (pilspiss). (C, D) Confocal bilder av faste isolerte ventrikulære endotelceller fra en E18.5 hjerte dyrket på en kollagen gel, vist i lysfelt (C) og merket med iso -lektin (rød). Pilene viser noen av de lektin-positive celler. Scale barer i CD = 50 mikrometer. 
Figur 2. Endotelceller isolert fra embryonale mus ventriklene merke positivt for endotelceller markører. (AC) Confocal bilder (40x) av faste isolerte ventrikulære endotelceller fra en E18.5 hjerte dyrket påen kollagen-belagt parabolen. Disse cellene merkelapp positivt for PECAM (A) og Flk-1 (B), den negative kontroll (C) viser ingen fluorescens. I AC, blir kjernene som er merket med DAPI (blå). (D) Fluorescent overlegg (10x) av levende isolerte ventrikulære endotelceller fra en E14.5 hjerte dyrket på en kollagen-gel. Cellene ble inkubert med live endotelial markør Syto-16 (grønn), og migrasjon ble observert ved hjelp av time-lapse mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Arbeide med primære embryonale celler gjør romanen eksperimenter for å ta in vitro kritiske trinn i utviklingen. Imidlertid er isoleringsprosedyre ikke trivielt. Kritiske trinn for å isolere en hvilken som helst type celler herunder at cellene er godt atskilt ved kollagenase fordøyelse og så at de er godt suspenderes i vasketrinnet. Mekanisk disseksjon ved pipettering bidrar sterkt skille cellene i løpet av collagenase trinnet, og filtrering trinnet fjerner klumper av celler. Denne fremgangsmåten forbedrer befolkningen renhet og utbytte.
Plating tetthet er også en betydelig bekymring når isolere celler fra et lite orgel. Siden endotelial rør-dannelse er avhengig av celletetthet 7, basert vi på 384-brønns vevskulturplater å øke vår plating tetthet. Selv med denne vurderingen, har vi måttet endre noen analyser for å imøtekomme en lavere celle tetthet (Dyer og Patterson, i proGress). Dermed, hvis celle nummer er en bekymring, en mindre størrelse kultur godt kan minske problemet.
En annen begrensning med å isolere primærceller er spesifisiteten av antistoffet. Selv en anerkjent endotelial-spesifikt protein som CD31 er noen ganger uttrykt av fibroblaster åtte. Hvis det høstede cellenummer muliggjør FAC sortering i stedet, så endotelceller og fibroblaster kan bli separert ved fluorescensintensiteten. Imidlertid kreves en fersk FAC sortering analyse av embryonale endotelceller fire hele E10.5 embryo å produsere nok endotelceller for mRNA utvinning, noe som tyder på at denne teknikken, men kraftig, kan ikke være hensiktsmessig for mindre organer ni.
Således, hvis FAC sortering ikke er mulig, kan andre teknikker anvendes for å forbedre renheten befolkning. En to-trinns utvelgelsesprosess, der cellene er positivt valgt av en antistoff og deretter negativt selected ved unnlatelse av å binde seg til et andre antistoff, er en annen løsning. Fibroblast-spesifikk markør FSP-1 vil det være en bestemt kandidat 10.. Alternativt kan dyrkningsmediet bestilles uten L-valin, D-valin og kan tilsettes i stedet; fibroblaster ikke er i stand til å utnytte D-valin og således ikke overlever 11,12.
Til tross for disse begrensningene og bekymringer, studere primære embryonale celle populasjoner gir en detaljert in vitro analyser av utviklingsprosesser. Denne teknikken kan brukes til hvilket som helst organ eller område av embryoet og tillater en celletype som skal sammenlignes tvers embryonale stadier. Med riktig skalering, kan til og med svært små populasjoner av primære celler oppnås og analyseres. Disse analysene vil gi betydelig innsikt i hvordan bestemte undergrupper av cellene oppfører seg og endres over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Andrea Portbury for kritisk lesing av manuskriptet, mikroskopet service Laboratorium for UNC for å få hjelp med time-lapse imaging, og NIH (tilskudd # R01HL061656) for finansiering støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercapt–thanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
| Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 | |
References
- Landecker, H. Culturing Life: How Cells Became Technologies. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).
- Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization. Oncogene. , (2012).
- Dyer, L. A., Patterson, C. Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity. Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).
- Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).
- Chang, L., Noseda, M. Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling. PNAS. 109, 5993-6998 (2012).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).
- Frauli, M., Ludwig, H. Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine. Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).
- Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media. Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).
- Arima, S., Nishiyama, K., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
