Summary

הכנה חצי שלמות מבודדת של האפיתל החושית שיווי משקל העכבר למיקרוסקופיה שני הפוטונים אלקטרופיזיולוגיה והרזולוציה גבוהה

Published: June 13, 2013
doi:

Summary

ניתוח של תפקוד תא שיער שיווי משקל הוא מסובך בשל מיקומם העמוק בתוך החלק הקשה ביותר של הגולגולת, העצם הטמפורלית petrous. רוב מחקרי תא שיער פונקציונליים השתמשו בחריפות תאי שיער מבודד. כאן אנו מתארים הכנה למחצה שלמה של האפיתל שיווי משקל עכבר למחקרי מיקרוסקופיה אלקטרו ושני פוטונים.

Abstract

לתפקד תאי שיער שיווי המשקל הבנה בתנאים רגילים, או איך טראומה, מחלה, הזדקנות ולשבש את הפונקציה הזו היא צעד חיוני בהתפתחות של גישות ו / או אסטרטגיות טיפוליות חדשניות מונעת. עם זאת, הרוב המכריע של מחקרים שמסתכלים על תפקוד שיווי משקל נורמלי לא היה ברמה התאית, אבל התמקד בעיקר במבחני התנהגות של תפקוד שיווי משקל כגון הליכה וניתוח ביצועי רפלקס vestibulo-עיניים. אמנם עבודה זו הניבה נתונים יקרי ערך לגבי מה שקורה כאשר דברים משתבשים, מעט מידע שלקט בנוגע לגורמים הבסיסיים של בעיות בתפקוד. מהמחקרים שיתמקדו בתהליכים התאיים וsubcellular העומדים בבסיס תפקוד שיווי משקל, רוב הסתמכו על החריפות בודדו תאי שיער, נטולי הקשרים סינפטיים ואת סביבת תאי תמיכה. לכן, אתגר טכני גדול כבר גישה לתאי שיער שיווי המשקל הרגישים להפליא בהכנהaration ששבש לפחות, מבחינה פיזיולוגית. כאן אנו מדגימים הכנה למחצה שלמה של האפיתל חושי שיווי משקל העכבר ששומר על מיקרו הסביבה המקומית הכולל תא שיער / מתחמים מביא עיקריים.

Introduction

למרות התרומה המשמעותית של מערכת שיווי המשקל לחיי היומיום שלנו, יש הבנה ברורה של התהליכים האחראים לירידה שנצפתה בתפקוד שיווי משקל עם גיל נשארת חמקמקה. אחת סיבות לחוסר הידע הזה הוא שהירידה בתפקוד שיווי משקל יש באופן בלעדי כמעט נחקרה באמצעות מבחני התנהגות, כוללים רפלקס vestibulo-העיני (VOR), חיווי מדויק של תפקוד שיווי משקל חיצוני, אך מספקת תובנות מוגבלות לשינויים של מרכיבים מהותיים . זהו מכשול עיקרי להבנה שלנו של תפקוד תא שיער שיווי משקל בבריאות, מחלה, או הזדקנות.

אמנם יש כבר מחקרים רבים של תאי שיער שיווי המשקל בודדים, חסרון גדול היה ההסתמכות על הכנות תא שיער חריפות, שבו תאי שיער ומסופים מביא אפילו גביע יוסרו מהסביבה הרגילה שלהם באמצעות טיפול מכאני ו / או האנזימטית. inevita גישות כגוןבליי לשבש את ארכיטקטורה העדינה בין תאי שיער וגביע, ושיער של תא ותא תמיכה. עם התפתחותה של הכנות למחצה ללא פגע 1-5, והכנת מבוך עכבר מבודדת 6, עכשיו יש הזדמנות ללמוד את הצורות השונות של תקשורת הסינפטית בתנאים שנראה דומה יותר לin vivo. ואכן, Lim et al. (2011) הראה הבדלים בולטים בכל זרמים סלולריים נרשמו מסוג החריפות מבודד אני תאי שיער שיווי המשקל בהשוואה לאלה שנשארו מוטבעים בתוך neuroepithelium. באופן ספציפי, הוא חשב אשלגן להצטבר בחלל בין התאית, בין תא השיער וגביע עצבים ולשנות באופן משמעותי תגובת תא שיער 7. מידע מסוג זה יהיה בלתי אפשרי להשגה ללא הכנה למחצה השלמה של האפיתל החושי שיווי המשקל שתואר כאן. אנו מדגימים את ההכנה למחצה השלמה של עכבר Crista 3, ולהראות תוצאות נציג המתקבלות מכל תא התיקון electrophysiology, וסידן הדמיה שני פוטונים.

Protocol

1. בעלי חיים עכברים התקבלו ממרכז מכרסמים האוסטרלי (ARC; פרת', אוסטרליה) ונערכו באוניברסיטת בית החיות בוש סידני על מחזור אור / חושך של 12 שעות נורמלי עם העשרה סביבתית. כל הניסויים שתוארו אושרו על ידי ועדת אתיקה של אוניברסי…

Representative Results

את המאפיינים אלקטרו של תאי שיער שיווי המשקל תלויים בארכיטקטורה המורכבת שבתוכה הם משובצים 7. ניתן לראות בתרשים 5, כי הכנת האפיתל שיווי המשקל חצי שלמותם ניתן להשתמש כדי להבדיל בין סוג I תאי שיער (איור 5 א), תאי שיער מסוג II (איור 5), וגביע עיק?…

Discussion

מנגנוני תחושת האיזון שלנו זכו לתשומת לב מוגבלת בהשוואה למערכות חושיות אחרות, למשל את מערכות ראייה ושמיעה. מהמחקרים שחקרו שינויים בתפקוד שיווי משקל או איזון, רוב התמקדו באמצעים התנהגותיים כולל את רפלקס vestibulo-העיני, עם ידע לא שלם מאבני הבניין הבסיסיים של מאזן תאי ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מימון עבור עבודה זו סופק על ידי מאטה גארנט ורודני וויליאמס קרן זיכרון לפרויקט מענק לר 'לים ומחנה AJ.

Materials

REAGENTS
Leibovitz medium L-15 Sigma Aldrich L4386-10X1L
BAPTA-1-oregon green Invitrogen O6806
EQUIPMENT
Stereo microscope Leica Microsystems A60S
Upright microscope Olympus BX51WI
Two-photon microscope Olympus/La Vision BX51WI/ TriMScope II
Dumont #5 SF Forceps FST 11252-00
Friedman-Pearson Rongeurs FST 16221-14
Standard Pattern Scissors FST 14001-12
InstraTECH A-D converter HEKA ITC-18
Sutter Micromanipulator Sutter MP-225/M
multiclamp amplifier Axon Instruments 700B
Data acquisition software (electrophysiology) Axograph N/A
Imspector Data acquisition software (two-photon) Max Planck innovation N/A

References

  1. Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
  2. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. , (2009).
  3. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. , (2009).
  4. Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. , (2010).
  5. Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. , (2010).
  6. Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
  7. Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
  8. Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
  9. Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170, 348-360 (2010).
  10. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  11. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
  12. Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
  13. Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
  14. Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).

Play Video

Cite This Article
Tung, V. W. K., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50471, doi:10.3791/50471 (2013).

View Video