Summary

Un isolato semi-intatte Preparazione del mouse vestibolare epitelio sensoriale di Elettrofisiologia e ad alta risoluzione microscopia a due fotoni

Published: June 13, 2013
doi:

Summary

Analisi della funzione delle cellule dei capelli vestibolare è complicata dalla loro posizione in profondità all'interno della parte più dura del cranio, l'osso temporale petroso. La maggior parte dei studi sulle cellule dei capelli funzionali hanno usato acutamente cellule ciliate isolate. Qui si descrive una preparazione semi-intatte di topo epitelio vestibolare per studi di microscopia elettrofisiologici e due fotoni.

Abstract

Comprendere le cellule ciliate vestibolari funzionano in condizioni normali, o come un trauma, malattia, invecchiamento e interrompere questa funzione è un passo fondamentale per lo sviluppo di approcci di prevenzione e / o di nuove strategie terapeutiche. Tuttavia, la maggior parte degli studi che stanno visualizzando funzione vestibolare anormale non sono stati a livello cellulare, ma si è concentrata principalmente sulle analisi comportamentali della disfunzione vestibolare, come le analisi del cammino e le prestazioni riflesso vestibolo-oculare. Anche se questo lavoro ha prodotto dati importanti su ciò che accade quando le cose vanno male, poca informazione viene estratta per quanto riguarda le cause di disfunzione. Tra gli studi che si concentrano sui processi cellulari e sub-cellulari che sono alla base la funzione vestibolare, la maggior parte hanno fatto affidamento su cellule ciliate acutamente isolati, privi delle loro connessioni sinaptiche e l'ambiente delle cellule di sostegno. Pertanto, una sfida tecnica è stata accesso alle cellule ciliate vestibolari squisitamente sensibili in un prepparazione che è meno perturbato, fisiologicamente. Qui mostriamo una preparazione semi-intatto del mouse vestibolare epitelio sensoriale che mantiene il micro-ambiente locale tra cui cellule capelli / complessi afferenti primari.

Introduction

Nonostante il significativo contributo del sistema vestibolare per la nostra vita di tutti i giorni, una chiara comprensione dei processi responsabili del declino osservato in funzione vestibolare con l'età rimane elusiva. Uno dei motivi di questa mancanza di conoscenza è che il declino della funzione vestibolare è quasi esclusivamente stata esplorata mediante saggi comportamentali, tra cui il riflesso vestibolo-oculare (VOR), un indicatore preciso della funzione vestibolare estrinseca, ma offre spunti limitati nei cambi di componenti intrinseche . Questo è uno dei principali ostacoli per la nostra comprensione della funzione delle cellule dei capelli vestibolare in salute, la malattia, o l'invecchiamento.

Mentre ci sono stati molti studi di cellule ciliate vestibolari singole, una grave lacuna è stata il ricorso a preparazioni di cellule dei capelli acuti, dove le cellule dei capelli e dei terminali afferenti anche calice vengono rimossi dal loro ambiente normale mediante trattamento meccanico e / o enzimatica. Approcci come inevitaBly disturbare il delicato microarchitettura tra cellule dei capelli e calice, e capelli cellula e cellula di supporto. Con lo sviluppo di preparati semi-intatte 1-5, e un isolato mouse preparazione labirinto 6, ora vi è la possibilità di studiare le varie forme di comunicazione sinaptica in condizioni che avvicinano maggiormente a quelle in vivo. Infatti, (2011) Lim et al. Ha mostrato notevoli differenze nelle correnti cellule intere registrati da tipo acuto isolato I cellule ciliate vestibolari rispetto a quelli che sono rimasti inseriti all'interno del neuroepitelio. Specificamente, potassio è pensato ad accumularsi nello spazio intercellulare, tra la cella capelli e calice afferente, e modifica significativamente capelli risposta cellulare 7. Questo tipo di informazioni sarebbe impossibile da ottenere senza la preparazione semi-intatte dell'epitelio sensoriale vestibolare qui descritto. Dimostriamo la preparazione semi-intatto del mouse crista 3, E mostrare i risultati rappresentativi ottenuti da cellule intere di patch elettrofisiologia e di imaging di calcio a due fotoni.

Protocol

1. Animali I topi sono stati ottenuti dal Centro di roditore australiano (ARC, Perth, Australia) e ha tenuto presso l'Università di Sydney Bosch Animal Facility su un normale ciclo luce / buio di 12 ore con l'arricchimento ambientale. Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati dalla University of Sydney Comitato etico degli animali. Topi maschi e femmine (C57/BL6) sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti da questo ceppo sono comunemente utilizzati come sfondo per la manipol…

Representative Results

Le proprietà elettrofisiologiche di cellule cigliate vestibolari sono dipendenti dalla microarchitettura complesso entro cui sono inserite 7. Figura 5 mostra che il semi-intatte preparazione epitelio vestibolare può essere utilizzata per distinguere tra cellule pilifere tipo I (Figura 5A), cellule hair tipo II (Figura 5B), e il calice primario afferente (Figura 5C) sulla base di caratteristiche conduttanze cellula intera. Queste caratterist…

Discussion

I meccanismi alla base il nostro senso di equilibrio hanno ricevuto scarsa attenzione rispetto ad altri sistemi sensoriali, ad esempio, i sistemi visivi e uditivi. Tra gli studi che hanno indagato i cambiamenti nella funzione vestibolare o di equilibrio, la maggior parte sono concentrati su misure comportamentali tra cui il riflesso vestibolo-oculare, con una conoscenza incompleta degli elementi costitutivi fondamentali del-la bilancia cellule ciliate vestibolari stesse. Quegli studi che si sono concentrati sul…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito da un Garnett Passe e Rodney Williams Memorial Foundation sovvenzione di progetto a R. Lim e AJ Campo.

Materials

REAGENTS
Leibovitz medium L-15 Sigma Aldrich L4386-10X1L
BAPTA-1-oregon green Invitrogen O6806
EQUIPMENT
Stereo microscope Leica Microsystems A60S
Upright microscope Olympus BX51WI
Two-photon microscope Olympus/La Vision BX51WI/ TriMScope II
Dumont #5 SF Forceps FST 11252-00
Friedman-Pearson Rongeurs FST 16221-14
Standard Pattern Scissors FST 14001-12
InstraTECH A-D converter HEKA ITC-18
Sutter Micromanipulator Sutter MP-225/M
multiclamp amplifier Axon Instruments 700B
Data acquisition software (electrophysiology) Axograph N/A
Imspector Data acquisition software (two-photon) Max Planck innovation N/A

References

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Tung, V. W. K., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50471, doi:10.3791/50471 (2013).

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