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Neuroscience

Eine Isolierte Semi-intakt Vorbereitung der Maus Vestibuläre Sinnesepithel für Elektrophysiologie und hochauflösende Zwei-Photonen-Mikroskopie

doi: 10.3791/50471 Published: June 13, 2013

Summary

Analyse der vestibulären Haarzellen Funktion wird durch ihre Lage tief innerhalb der schwierigste Teil des Schädels, der Felsenbein kompliziert. Die meisten funktionalen Haarzellen Studien haben akut isolierten Haarzellen verwendet. Hier beschreiben wir eine semi-intakten Herstellung von Maus vestibulären Epithel für elektrophysiologische und Zwei-Photonen-Mikroskopie Studien.

Abstract

Verstehen vestibulären Haarzellen funktionieren unter normalen Bedingungen, oder wie Trauma, Krankheit und Altern stören diese Funktion ist ein wichtiger Schritt in der Entwicklung von präventiven Ansätze und / oder neue therapeutische Strategien. Allerdings haben die meisten Studien, die abnormale vestibulären Funktion nicht auf der zellulären Ebene gewesen, aber konzentrierte sich hauptsächlich auf Verhaltens-Assays Vestibularisausfall wie Ganganalysen und vestibulookulären Reflex Leistung. Während diese Arbeit wertvolle Daten über das, was passiert, wenn etwas schief geht ergeben hat, ist nur wenig Informationen über die zugrunde liegenden Ursachen der Funktionsstörung aufgelesen. Von den Studien, dass auf der zellulären und subzellulären Prozessen, die Vestibularfunktion zugrunde zu konzentrieren, haben die meisten auf akut isolierten Haarzellen, ohne ihre synaptischen Verbindungen und Unterstützung Zellumgebung verlassen. Daher ist eine große technische Herausforderung gewesen Zugriff auf die außerordentlich empfindlich vestibulären Haarzellen in einem prepTrennung, die am wenigsten gestört, physiologisch. Hier zeigen wir eine semi-intakten Präparat der Maus vestibulären Sinnesepithel, die die lokale Mikroumgebung behält einschließlich Haarzellen / primären afferenten Komplexe.

Introduction

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Trotz der bedeutenden Beitrag des vestibulären Systems zu unserem täglichen Leben, bleiben ein klares Verständnis der Prozesse, die für die beobachtete Abnahme in vestibulären Funktion mit dem Alter schwer zu fassen. Ein Grund für diesen Mangel an Wissen ist, dass Rückgang der vestibulären Funktion hat fast ausschließlich erforscht mit Verhaltensstörungen Assays, einschließlich der vestibulookulären Reflex (VOR), eine genaue Anzeige der extrinsische vestibulären Funktion, sondern bietet nur begrenzten Einblick in die Veränderungen der intrinsischen Komponenten . Dies ist ein wesentliches Hindernis für unser Verständnis der vestibulären Haarzellen Funktion in Gesundheit, Krankheit oder Alterung.

Zwar gibt es viele Studien einzelner vestibulären Haarzellen wurde ein entscheidender Nachteil war die Abhängigkeit von akuten Haarzellen Zubereitungen, in denen Haarzellen und sogar Kelch afferenten Terminals aus ihrer normalen Umgebung über mechanische und / oder enzymatische Behandlung entfernt werden. Solche Ansätze zwangsBly stören das empfindliche Mikroarchitektur zwischen Haarzellen und Kelch und Haarzellen und Stützzellen. Mit der Entwicklung von semi-intakten Präparate 1-5 und einem isolierten Maus Labyrinth Zubereitung 6, gibt es jetzt eine Möglichkeit, die verschiedenen Formen der synaptischen Kommunikation unter den Bedingungen, die stärker die in vivo ähneln studieren. Tatsächlich zeigte Lim et al. (2011) deutliche Unterschiede in ganzen Zellen Ströme von akut isoliert Typ I aufgezeichnet vestibulären Haarzellen zu denen, die eingebettet in die Neuroepithel blieb verglichen. Insbesondere wird angenommen, dass Kalium in den interzellulären Raum ansammeln, zwischen den Haarzellen und Kelch afferenten und signifikant verändern Haar-Zell-Antwort 7. Diese Art von Informationen wäre unmöglich, ohne die semi-intakten Vorbereitung des vestibulären Sinnesepithel hier beschriebenen zu erhalten. Wir zeigen die semi-intakten Präparat der Maus crista 3Und zeigen repräsentative Ergebnisse von whole-cell Patch Elektrophysiologie erhalten und Zwei-Photonen-Kalzium-Imaging.

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Protocol

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1. Tiere

  1. Die Mäuse wurden von der australischen Nagetier Centre (ARC; Perth, Australien) gewonnen und gehalten an der Universität von Sydney Bosch Tierlabor auf einem normalen 12-Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit ökologischen Bereicherung. Alle beschriebenen Experimente wurden von der University of Sydney Tier Ethikkommission genehmigt.
  2. Männliche und weibliche Mäuse (C57/Bl6) wurden für alle Experimente verwendet werden, da dieser Stamm häufig als Hintergrund für genetische Manipulation verwendet werden, und kann als äquivalent zu 8-9 Wildtyp werden.

2. Tissue Vorbereitung

  1. Bereiten 300 ml eines Glycerin-Basis künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF), bestehend aus (in mM): 26 NaHCO 3, 11 Glucose, 250 Glycerin, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 1,2 MgCl 2, CaCl 2 und 2,5. Vor der Zugabe von CaCl 2, Gas die Lösung mit Carbogen (95% O 2 und 5% CO 2), um festzustellen, apH von 7,4 und vermeiden Calciumpräzipitation (Bewölkung). Einfrieren der Lösung in einem -80 ° C-Gefrierschrank für 45 min, so daß eine Ice-Slurry gebildet wird.
  2. Tief betäuben Mäuse mit Ketamin (100 mg / kg) (Parnell, Alexandria, Australien) über eine intraperitoneale Injektion.
  3. Sobald Hinterbeine Extremität Prise Reflexe fehlen decapitate Mäusen mit scharfen Schere aus rostfreiem Stahl und eine sagittalen Hautschnitt mit einer Rasierklinge (gerundet # 22), um den Schädel freizulegen. An dieser Stelle und in Schritten von 2,3 bis 2,8 die Schädelhöhle, Gehirn, und die zugrunde liegenden Vestibularapparat sollte so kühl wie möglich durch die regelmäßige Anwendung von eiskaltem ACSF über das Gewebe gehalten werden.
  4. Mit dem spitzen Arm Standard Muster Schere (FST, North Vancouver, Kanada) machen einen kleinen Schnitt in den Schädel bei Lambda und entlang der Sagittalnaht. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn nicht "gezogen" durch die Schermesser bei diesem Schritt.
  5. Vorsichtig schälen Scheitelbeine weg seitlich und Os occipitale posteriorly mit flachen Kurve Pearson rongeurs (FST).
  6. Eine kleine Spatel aus rostfreiem Stahl wird dann verwendet, um heben das Gehirn von der Oberfläche des mittleren und hinteren Schädelgrube, und die freigelegte vestibulocochlea Nerven (CNVIII) schneiden in der Mitte zwischen dem Innenohr und Hirnstamm mit einer feinen Schere Iris. Schneiden diesen Nerv minimiert unnötige Spannung auf Axone der Primärafferens und deren Verbindungen mit Haarzellen.
  7. Nach Durchtrennung des CN VIII wird das Gehirn in toto entfernt.
  8. Die vestibuläre Labyrinth ist jetzt deutlich sichtbar in der mittleren Schädelgrube, mit dem Cochlea zeigt anteromedial. Rongeur beiden Seiten des vestibulären Labyrinth vor sanft Ausschneiden durch Ergreifen des vorderen Bogengang und Ziehen seitlich.
  9. Tauchen Sie die ausgeschnitten Labyrinthe (Abbildung 1) in einem Seziertisch Schale mit den eiskalten, kontinuierlich vergast ACSF in Abschnitt 2.1 beschrieben. Unter einem Stereomikroskop, halten das Labyrinth zuder Boden der Schale durch Ergreifen des Cochlea. Verwenden feinen Pinzette entfernt zu kratzen an der Knochen über der vorderen Bogengang Ampulle. Sobald ein kleines Loch in den Knochen erreicht beginnen Fingern an die Knochen von der Ampulle. Vorsicht ist geboten, nicht auf die Zange durch den Knochen drücken, da dies Schäden an der zugrunde liegenden häutigen Labyrinths und Sinnesepithel verursachen kann. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis sowohl die Front-und benachbarten horizontalen halbkreisförmigen häutige Kanäle und Ampullen ausgesetzt sind (Abbildung 2).

Abbildung 1
Abbildung 1. Die isolierten Maus vestibulären Labyrinth. A. Links) Schematische Darstellung der isolierten Maus vestibulären Labyrinth. Wichtige Bezugspunkte für den Zugriff auf den vestibulären Sinnesepithel sind die Cochlea, vordere und horizontalen Bogengänge Laboreled. Sternchen zeigen den Bogengang Ampulle mit dem vestibulären Sinnesepithel. B. Rechts) Photomicrograph des isolierten vestibulären Labyrinth aus einem 1-Monate alten Maus.

Abbildung 2
Abbildung 2. Die Exposition der Membranöse vestibulären Labyrinth. Die Knochen über der vorderen und horizontalen Bogengang Ampullen wurden entfernt, um die schwarz / braun gesprenkelte membranöse Ampullen und zugehörige ampullären Nerven (CNVIII) offenbaren zerkratzt. Das Schema in der unteren Platte stellt die Strukturen in den hervorgehobenen Bereich der Mikroaufnahme und zeigt die Beziehung der halbkreisförmigen Kanal Kanäle der Ampullen und CNVIII.

  1. Mit feinen Pinzette vorsichtig heben Sie die Ampullen und zugehörige utricle vom knöchernen Labyrinth, um sicherzustellen, dass der zentrale Bereich der Ampullen (Contaligt ist, das sensorische Epithel) nicht beschädigt wird. In einigen Fällen kann der proximale Teil des halbkreisförmigen membranöse Kanal müssen möglicherweise mit Iris Schere geschnitten werden, um die Ampulle aus dem Knochen zu lösen.
  2. Übertragen Sie die Triade, die beiden Ampullen und utricle in eine Petrischale mit Leibovitz L-15 Kulturmedium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) gefüllt. Verwenden Sie ein Glasfaserkabel zu "Hintergrundbeleuchtung" das Gewebe. Dies ermöglicht die übersichtliche Visualisierung der Crista, die das sensorische Epithel innerhalb der Ampullen.
  3. Vorsichtig einen Einschnitt in der gesprenkelten "Dach" der utricle mit den feinen Iris Schere. Setzen Sie diesen Einschnitt durch das Dach des vorderen und dann die horizontale Ampullen. Als den Einschnitt so nahe an der Kante des sensorischen Epithels möglichst ohne sie zu berühren (Fig. 3A). Stellen Sie sicher, dass es keine Stücke von Membran über der Sinnesepithel (3B)
  4. Übertragen Sie die isolierten halb intakt Vorbereitung zu einem kleinen Glass-Boden Aufnahme Kammer mit L-15 Medien gefüllt. Belasten die Herstellung mit einem Raster aus feinen Nylonfasern, die an einem abgeflachten U-förmigen Platindraht (3B). Idealerweise werden die Fasern des Gitters nicht überlagern Sinnesepithel jedoch in einigen Fällen, in denen mehr Stabilität erforderlich ist, eine einzelne Faser Durchschneiden Sinnesepithel vielleicht bevorzugt.

Abbildung 3
Abbildung 3. Die isolierte semi-intakten Vorbereitung des vestibulären Sinnesepithel. A. Schematische Darstellung der semi-intakten Vorbereitung und Elektroden-Konfiguration. Die Ampulle über der Crista wurde "de-Dach", um die Oberfläche des Sinnesepithel (grün) freizulegen. B. Photomicrograph der semi-intakten 'Dreiklang' Vorbereitung zeigt die vordere (ac) und horizontalen (hc) Crista (utricle verdecktHinterbeine ac). Beachten Sie die Nylonfaser verwendet werden, um die Herstellung der Basis der Aufnahme Kammer zu sichern. Maßstab:. 100 um C. Eine Aufnahme Elektrode auf einem einzelnen vestibulären Haarzellen positioniert. Maßstab: 15 um.

3. Elektrophysiologie

  1. Perfundieren die semi-intakten Präparat mit kontinuierlich Sauerstoff L-15-Medium. Der Datenträger enthält einen pH-Indikator (Phenolrot) und die Farbe des Mediums sollte in den Aufnahmen überwacht werden. Der pH-Wert mit Sauerstoff sollte 7,3-7,4 sein und entsprechen einer roten Farbe.
  2. Bereiten Aufnahme Pipetten von 1,5 mm (1,19 mm ID) Borosilikatglas mit einem Zwei-Schritt-Protokoll (Wärme Stufe 1: 72, und Wärme Schritt 2: 50) auf einem Feinpipettenziehvorrichtung (Narishige, Japan, Modell PP-830), um ein zu erreichen endgültige Impedanz von 3-4 MOhm.
  3. Füllen Sie den Schaft der Pipette mit 3-4 mm Kaliumfluorid-basierte interne Lösung, die (in mm) 110 KF, KCl 12, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 1,8 MgCl 2,3 D-Glukose und 2 Na-ATP, pH 7,4 mit KOH.
  4. Wickeln der Schaft der Pipette 2-3 mal und bis zur Spitze wie möglich mit einer dünnen Parafilm, um die Elektrode zu isolieren und zu reduzieren Pipette Kapazität.
  5. Positionieren Sie die Pipette über die Sinnesepithel unter Low-Power-Vergrößerung (5X) auf einem aufrechten Mikroskop (Olympus BX51). Wechseln Sie zu hohe Leistung (40X) und visualisieren einzelnen vestibulären Haarzellen mit einem angeschlossenen CCD-Kamera.
  6. Position Pipette an der Membran eines visualisierten Haarzellen (3C) mit einem Mikromanipulator (Sutter Instruments, Kalifornien, USA). Sobald ein Gigaohm Dichtung erreicht, Bruch der Zellmembran mit einer kleinen Menge von Unterdruck durch eine Saugöffnung auf der Pipettenhalter aufgebracht.
  7. Machen whole-cell voltage clamp Aufnahmen unter Verwendung von Standardverfahren 8-9.

4. Zwei-Photonen-Mikroskopie

  1. Vorbereiten einer 0,9% igen Kochsalzlösung, enthaltend 5 mM Oregon Green488 BAPTA-1 (OGB 1-; hexakaliumsalz; Invitrogen, Deutschland).
  2. Während noch unter Wasser, legen Sie die "de-Dach" semi-intakten Dreiklang Vorbereitung auf ein kleines Stück Filterpapier (4x4 mm, 0,8 um dick, Millipore, Deutschland) sicherzustellen, dass die Sinnesepithel ungehindert von oben ist.
  3. Das Filterpapier und Vorbereitung auf die Salzlösung bedeckt Basis Platinelektrode (7 ul) eines Elektroporators bestehend aus der Kombination von einem Impulsgeber und einem breitbandigen Verstärker, und die Abdeckung mit weiteren 5 ul 5 mM Lösung des synthetischen Calcium Indikator-Farbstoff Oregon Green 488 BAPTA-1 (Abbildung 4).

Fig. 4
Abbildung 4. Masse Elektroporation. A. schematische Darstellung Querschnitt Elektroporation Konfiguration. Der semi-intakten Zubereitung (*) auf einem Stück Filterpapier in Calcium dy eingetaucht platzierte (Oregon Green 488 BAPTA-1) und Strom zwischen 2 Platin-Elektroden aufgebracht. Adaptiert von Briggman und Euler, 2011 10.

  1. Bringen Sie die obere Platinelektrode parallel mit der Basis-Elektrode in einem Abstand von etwa 2 mm, darauf achten, daß die Ausrichtung der Vorbereitung stören, wenn sie mit der Oregon Green 488 BAPTA-1-Lösung wird zu kontaktieren.
  2. Übergeben Sie einen kurzen Stromimpuls in der Zubereitung (Parameter für den aktuellen, +13 V, 10 ms Impulsbreite, Frequenz 1 Hz, 10 Rechteckpulse) 10-11.
  3. Auf dem Boden einer Glasboden Aufnahme Kammer mit L-15-Medium gefüllt ist, legen Sie einen kleinen Klecks Silikonöl und Position der semi-intakten Vorbereitung auf sie, wieder dafür, dass die Sinnesepithel ungehindert von oben ist. Um Stabilität in Bildgebung zu gewährleisten, ersetzen Sie die Nylon-Gitter über die Zubereitung wie oben beschrieben (siehe Punkt 2.13).
  4. Mit der Zwei-Photonen-Mikroskop machen optischen Aufnahmen spontanneous Calcium Aktivität im sensorischen Epithel (Abbildung 7) mit Standard Bildgebungsprotokolle 10-11.

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Representative Results

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Die elektrophysiologischen Eigenschaften des vestibulären Haarzellen sind abhängig von der komplexen microarchitecture 7, in dem sie eingebettet sind. 5 zeigt, dass die semi-intakten Epithel vestibulären Herstellung verwendet werden, um zwischen Typs unterschieden werden können I Haarzellen (5A), Typ II Haarzellen (5B), und der Kelch primären afferenten (5C) auf der Grundlage charakteristische Ganzzell Leitwerte. Diese Merkmale beinhalten eine ausgeprägte "sag" während Depolarisation und große "kollabiert" Tail-Ströme in der Typ-I-Haarzellen, und das Vorhandensein von transienten innen Natriumströme darstellt Aktionspotentiale in den Kelch primären afferenten (Pfeil in Fig. 5C).

Die Zubereitung kann auch verwendet werden, um die Auswirkungen des Alterns auf die einzelnen vestibulären Haar Zelltypen quantifiziert werden. Abbildung 6 vergleicht die Leitfähigkeit (FBBILDUNG 6A) und Inaktivierung Eigenschaften (6B) vom Typ II vestibulären Haarzellen in Reaktion auf Depolarisation von einer negativen Ruhepotential bei jungen und älteren Mäusen treten. Für den Typ II Haarzellen - am wenigsten empfindlich Subtyp-signifikante Unterschiede wurden in keinem der beiden Parameter beobachtet (siehe Diskussion).

Zusätzlich zur Analyse der whole-cell-Eigenschaften, die semi-intakten Zubereitung eignet sich auch für großflächige Analyse der subzellulären Mechanismen Haar Zellfunktion. Abbildung 7 zeigt die Differential Lokalisierung von Calcium zu der Typ-I-Haarzellen und Kelch primären Afferenten sowie die subzelluläre Organisation führt in diesen Zellen. 7A zeigt die Änderung in Calcium-Fluoreszenz in einem einzelnen Typ I Haarzellen der Zugabe von 100 mM KCl. Der zeitliche Verlauf dieser Änderung ist in 7B dargestellt. Wichtig ist, dass die VorbereitungIonen ermöglicht die Untersuchung von Haar-Zell-Aktivität in subzellulären Auflösung, in mehrere Zellen gleichzeitig und in einem "fast normalen" Umgebung (7C) - ein Feature nicht möglich mit isolierten Haarzellen und einzelne Zelle Elektrophysiologie.

Abbildung 5
Abbildung 5. Whole cell Ströme von Haarzellen in der Maus vestibulären Sinnesepithel aufgezeichnet. A. Whole cell Ströme aus einer Typ-I-vestibulären Haarzellen durch große "kollabiert" Tail-Ströme (Pfeil) gekennzeichnet aufgezeichnet. B. Whole cell Ströme aus einer Typ-II-vestibulären aufgezeichnet Haarzellen. Beachten Sie das Fehlen von Tail-Ströme. C. Whole cell recording aus einem Kelch primären afferenten durch transiente Natrium-vermittelten Ströme (Pfeil) nach Depolarisation von einem negativen Ruhepotential (-120 mV) gekennzeichnet. Alle Zellen were bei -60 mV gehalten.

Abbildung 6
Abbildung 6. Vergleich von Sensitivität und Inaktivierung bei Typ II Haarzellen aus jungen und älteren Mäusen. A. I / V-Beziehungen für Typ II Haarzellen aus jungen (1 Monat) und älteren (9 Monate) Mäusen in Reaktion aufgezeichnet steigender Depolarisation Dauer. B. Die durchschnittliche Leitfähigkeit und Inaktivierung Verhältnis von Typ-II-Haarzellen in jungen und alten Mäusen auf den 100 ms I / V-Kurven basiert.

Abbildung 7
Abbildung 7. Zwei-Photonen-Kalzium-Imaging des semi-intakten Maus vestibulären Sinnesepithel Vorbereitung. A. Top links) Zwei-Photonen-Aufnahmen zeigt BAPTA-1 Oregon Green Calcium Aktivierung in Reaktion auf normalen L-15 Perfusat(Oben) oder L-15, enthaltend 100 mM KCl (unten). Pfeile zeigen eine einzelne Haar Zelle vor und nach der Zugabe von KCl. B. Top rechts) Calcium Fluoreszenz Profil der Zelle in einem. C. hervorgehoben Bodenplatte) Zwei-Photonen-Aufnahme des Sinnesepithel zeigt Oregon Green 488 BAPTA-1 Laden einzelner Haarzellen Bodenplatte Einschub:. Subzelluläre Lokalisation von Calcium zu dem Typ I Haarzellen Zytoplasma (Pfeil) oder den Kelch primären afferenten Umgebung eine Art Ich Haarzellen (Doppelpfeil).

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Discussion

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Die zugrunde liegenden Mechanismen unseren Gleichgewichtssinn haben begrenzte Aufmerksamkeit im Vergleich mit anderen sensorischen Systemen erhalten, z. B. die visuelle und auditive Systeme. Von den Studien, die Veränderungen in der vestibulären oder Balance-Funktion untersucht haben, haben die meisten auf verhaltensorientierten Maßnahmen einschließlich der vestibulookulären Reflex konzentriert, mit unvollständigen Kenntnis der fundamentalen Bausteine ​​der Balance-den vestibulären Haarzellen sich. Diese Studien, die auf den Haarzellen konzentriert haben, haben fast immer getan mit akut isolierten Haarzellen aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt. In diesem Artikel zeigen wir eine semi-intakten Präparat der Maus vestibulären Sinnesepithel, die auf dieser Grundlage Studien erweitert.

Während vestibulären Haarzellen relativ robust sind, ist die Nützlichkeit der semi-intakten Herstellung kritisch abhängig von der Geschwindigkeit der Exzision. Typischerweise wird eine Zubereitung lebensfähig bleiben bei room Temperatur für einen Zeitraum von etwa 2-5 Stunden nach der Exzision. Daher Minimierung der Zeit aus, wenn das Tier eingeschläfert, um die Aufnahme gemacht ist von größter Bedeutung. Die Exzision kann relativ einfach und schnell für ein 3-Wochen alten Maus (5-7 min insgesamt), bekommt aber zunehmend schwieriger in einem älteren Tier (bis zu 25 min in 9 Monate alten Mäusen). In diesen älteren Tieren ist Dissektion Temperatur eine kritische Determinante - sichergestellt wird, dass die Herstellung kontinuierlich in eiskaltem Sauerstoff ACSF normalen Abbauprozesse gebadet werden gesperrt.

Wie in Abschnitt 3.1 beschrieben wurde das Präparat kontinuierlich perfundiert mit Sauerstoff Leibovitz-Medium, L-15, und Whole-Cell-Voltage-Clamp-Aufnahmen wurden mit Glas-Mikroelektroden mit KF 12 interne Lösung gefüllt. Diese Kombination von externen und internen Umgebungen hat sich gezeigt, stabiler und länger andauernde Aufnahmen als andere kaliumhaltigen Einbauten und / oder Ringer-stellenbasierten extrazellulären Lösungen 13-14. Diese Stabilität ist von entscheidender Bedeutung für die lange Protokolle erforderlich, um elektrophysiologische Eigenschaften und Calcium Dynamik Haarzellen mit Patch-Clamp-und Zwei-Photonen-Techniken bzw. zu untersuchen.

Das grundlegende Ziel des semi-intakten Präparat ist ein Modell für die Untersuchung der vestibulären Haarzellen, die so wenig wie möglich gestört wird bereitzustellen. Während der Vorbereitung bietet klare Vorteile gegenüber akut isolierten Haarzellen - zum Beispiel, werden die volle Dynamik des ganzen Zelle nur Ströme zeigte mit dem semi-intakten Präparat 3, 7 - Störungen können nicht vermieden werden. Erstens ist es schwierig, die Wirkung des Entfernens der "Dach" der Ampulle (und vermutlich auch die beigefügte cupula) auf spontane Haarzellen Signalisierung zu bewerten. Unter normalen physiologischen Bedingungen, Haarzellen auf Biegen des cupula / Haarbündels Komplex reagieren. Ohne diese komplex es ist denkbar, dass spontane Haar cell Signalisierung möglicherweise nicht repräsentativ für in vivo-Bedingungen. Zweitens elektrophysiologischen Ableitungen in der Halbleiter-Herstellung sind größtenteils intakt, um Messungen der spontanen Aktivität oder Antworten auf simulierten natürlichen Aktivität (dh Gleichstrom Injektionen in den Haarzellen oder mechanische Biegung Haarbündel) begrenzt. Daher ist es nicht möglich, die zugrunde liegenden Haarzellen Eigenschaften in Reaktion auf real-life-Aktivierung (dh Kopfbewegungen) studieren. Dennoch stellt die semi-intakten Präparat ein neues Werkzeug, um uns helfen zu verstehen Haar-Zell-Funktion, und eröffnet eine Reihe von Möglichkeiten für die zukünftige Forschung.

Ein großer Vorteil, dass die semi-intakten Präparat über akut isolierten Haarzellen Vorbereitungen bietet, ist, dass es ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von mehreren Haarzellen und / oder deren verbundenen Primärafferens. Mit Dual-oder Multi-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung Techniken dieses Feature stellt ein Mittel zur Beurteilungdirekt Haarzellen / primären afferenten Signalisierung, etwas, das nicht mit herkömmlichen isolierten Präparaten erzielt werden kann. Darüber hinaus mit Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht die semi-intakten Präparat für die gleichzeitige Messung von sub-zellulären Funktion über das volle Ausmaß der sensorischen Epithel. Dies bedeutet, dass Informationen über Calcium-Signale und zelluläre Stoffwechsel schnell und in Kontext abgegrenzt. Schließlich mit Mäusen ermöglicht gezielte genetische Manipulation (zB grün fluoreszierenden Protein markiert, um Calretinin Expression als Marker für Typ I Haarzellen und Kelch Primärafferens). Der semi-intakten Herstellung ein Verfahren, um die Aktivität von Haarzellen und Primärafferens differentiell zu studieren, und gleichzeitig. Dies allein würde eine Fülle von neuen Informationen darüber, wie vestibulären Haarzellen und Primärafferens interagieren zu erkennen und dann codieren Informationen an das Gehirn über Kopf und Körper Position übertragen werden.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Die Finanzierung dieser Arbeit wurde durch einen Garnett Passe und Rodney Williams Memorial Foundation Projektstipendium R. Lim und AJ Camp zur Verfügung gestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Leibovitz medium L-15 Sigma Aldrich L4386-10X1L
BAPTA-1-oregon green Invitrogen O6806
EQUIPMENT
Stereo microscope Leica Microsystems A60S
Upright microscope Olympus BX51WI
Two-photon microscope Olympus/La Vision BX51WI/ TriMScope II
Dumont #5 SF Forceps FST 11252-00
Friedman-Pearson Rongeurs FST 16221-14
Standard Pattern Scissors FST 14001-12
InstraTECH A-D converter HEKA ITC-18
Sutter Micromanipulator Sutter MP-225/M
multiclamp amplifier Axon Instruments 700B
Data acquisition software (electrophysiology) Axograph N/A
Imspector Data acquisition software (two-photon) Max Planck innovation N/A

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References

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Tung, V. W. K., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50471, doi:10.3791/50471 (2013).More

Tung, V. W. K., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50471, doi:10.3791/50471 (2013).

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