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Neuroscience

Un isolato semi-intatte Preparazione del mouse vestibolare epitelio sensoriale di Elettrofisiologia e ad alta risoluzione microscopia a due fotoni

doi: 10.3791/50471 Published: June 13, 2013

Summary

Analisi della funzione delle cellule dei capelli vestibolare è complicata dalla loro posizione in profondità all'interno della parte più dura del cranio, l'osso temporale petroso. La maggior parte dei studi sulle cellule dei capelli funzionali hanno usato acutamente cellule ciliate isolate. Qui si descrive una preparazione semi-intatte di topo epitelio vestibolare per studi di microscopia elettrofisiologici e due fotoni.

Abstract

Comprendere le cellule ciliate vestibolari funzionano in condizioni normali, o come un trauma, malattia, invecchiamento e interrompere questa funzione è un passo fondamentale per lo sviluppo di approcci di prevenzione e / o di nuove strategie terapeutiche. Tuttavia, la maggior parte degli studi che stanno visualizzando funzione vestibolare anormale non sono stati a livello cellulare, ma si è concentrata principalmente sulle analisi comportamentali della disfunzione vestibolare, come le analisi del cammino e le prestazioni riflesso vestibolo-oculare. Anche se questo lavoro ha prodotto dati importanti su ciò che accade quando le cose vanno male, poca informazione viene estratta per quanto riguarda le cause di disfunzione. Tra gli studi che si concentrano sui processi cellulari e sub-cellulari che sono alla base la funzione vestibolare, la maggior parte hanno fatto affidamento su cellule ciliate acutamente isolati, privi delle loro connessioni sinaptiche e l'ambiente delle cellule di sostegno. Pertanto, una sfida tecnica è stata accesso alle cellule ciliate vestibolari squisitamente sensibili in un prepparazione che è meno perturbato, fisiologicamente. Qui mostriamo una preparazione semi-intatto del mouse vestibolare epitelio sensoriale che mantiene il micro-ambiente locale tra cui cellule capelli / complessi afferenti primari.

Introduction

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Nonostante il significativo contributo del sistema vestibolare per la nostra vita di tutti i giorni, una chiara comprensione dei processi responsabili del declino osservato in funzione vestibolare con l'età rimane elusiva. Uno dei motivi di questa mancanza di conoscenza è che il declino della funzione vestibolare è quasi esclusivamente stata esplorata mediante saggi comportamentali, tra cui il riflesso vestibolo-oculare (VOR), un indicatore preciso della funzione vestibolare estrinseca, ma offre spunti limitati nei cambi di componenti intrinseche . Questo è uno dei principali ostacoli per la nostra comprensione della funzione delle cellule dei capelli vestibolare in salute, la malattia, o l'invecchiamento.

Mentre ci sono stati molti studi di cellule ciliate vestibolari singole, una grave lacuna è stata il ricorso a preparazioni di cellule dei capelli acuti, dove le cellule dei capelli e dei terminali afferenti anche calice vengono rimossi dal loro ambiente normale mediante trattamento meccanico e / o enzimatica. Approcci come inevitaBly disturbare il delicato microarchitettura tra cellule dei capelli e calice, e capelli cellula e cellula di supporto. Con lo sviluppo di preparati semi-intatte 1-5, e un isolato mouse preparazione labirinto 6, ora vi è la possibilità di studiare le varie forme di comunicazione sinaptica in condizioni che avvicinano maggiormente a quelle in vivo. Infatti, (2011) Lim et al. Ha mostrato notevoli differenze nelle correnti cellule intere registrati da tipo acuto isolato I cellule ciliate vestibolari rispetto a quelli che sono rimasti inseriti all'interno del neuroepitelio. Specificamente, potassio è pensato ad accumularsi nello spazio intercellulare, tra la cella capelli e calice afferente, e modifica significativamente capelli risposta cellulare 7. Questo tipo di informazioni sarebbe impossibile da ottenere senza la preparazione semi-intatte dell'epitelio sensoriale vestibolare qui descritto. Dimostriamo la preparazione semi-intatto del mouse crista 3, E mostrare i risultati rappresentativi ottenuti da cellule intere di patch elettrofisiologia e di imaging di calcio a due fotoni.

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Protocol

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1. Animali

  1. I topi sono stati ottenuti dal Centro di roditore australiano (ARC, Perth, Australia) e ha tenuto presso l'Università di Sydney Bosch Animal Facility su un normale ciclo luce / buio di 12 ore con l'arricchimento ambientale. Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati dalla University of Sydney Comitato etico degli animali.
  2. Topi maschi e femmine (C57/BL6) sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti da questo ceppo sono comunemente utilizzati come sfondo per la manipolazione genetica, e può essere considerato equivalente al tipo selvatico 8-9.

2. Preparazione del tessuto

  1. Preparare 300 ml di glicerolo un fluido cerebrospinale artificiale basata (ACSF) costituito (in mM): 26 NaHCO3, 11 glucosio, glicerolo 250, 2.5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 1.2 MgCl2 e 2,5 CaCl 2. Prima dell'aggiunta di CaCl 2, la soluzione con gas carbogeno (95% O 2 e 5% CO 2) per stabilire apH di 7.4 e di evitare la precipitazione di calcio (nuvolosità). Congelare la soluzione in un congelatore -80 ° C per 45 minuti in modo che l'impasto ghiaccio si forma.
  2. Profondamente anestetizzare topi con ketamina (100 mg / kg) (Parnell, Alessandria d'Egitto, Australia) tramite una iniezione intra-peritoneale.
  3. Una volta arti posteriori riflessi di presa sono topi decapitare assenti utilizzando taglienti forbici in acciaio inox e fare una incisione cutanea sagittale con una lama di rasoio (arrotondato # 22) per esporre il cranio. A questo punto e in tutta passaggi 2,3-2,8 volta cranica, cervello e apparato vestibolare sottostante deve essere il più fresco possibile mediante l'applicazione regolare di ghiaccio-freddo ACSF sopra il tessuto.
  4. Utilizzando il braccio a punta di forbici stile internazionale (FST, North Vancouver, Canada) fare una piccola incisione nel cranio a Lambda e tagliare lungo la sutura sagittale. Verificare che il cervello non è "trascinato" dalla lama di taglio durante questa fase.
  5. Rimuovere con cautela le ossa parietali di distanza lateralmente e l'osso occipitale posterorly utilizzando superficiale curva Pearson rongeurs (FST).
  6. Una piccola spatola inox viene quindi utilizzato per sollevare delicatamente il cervello dalla superficie della fossa cranica media e posteriore, e il nervo vestibulocochlea esposta (CNVIII) tagliato a metà tra l'orecchio interno e il tronco cerebrale con un paio di forbici iris multa. Tagliare questo nervo riduce al minimo la tensione indebita assoni delle afferenze primarie e le loro connessioni con le cellule dei capelli.
  7. In seguito a resezione del CN VIII del cervello viene rimossa in toto.
  8. Il labirinto vestibolare è ora chiaramente visibile nella fossa cranica media, con la coclea di puntamento anteromedialmente. Rongeur lati del labirinto vestibolare prima asportare delicatamente afferrando il canale semicircolare anteriore e tirando lateralmente.
  9. Immergere i labirinti espunto (figura 1) in un piatto dissezione contenente il ghiaccio-freddo, ACSF continuamente gasati descritto nel paragrafo 2.1. Allo stereomicroscopio, tenere premuto il labirinto dila base del piatto afferrando la coclea. Utilizzare una pinza sottile a graffiare via alla osso sovrastante il canale semicircolare anteriore ampolla. Una volta che un piccolo foro nell'osso è raggiunto iniziare a premere l'osso dal ampolla. Si deve usare cautela per non spingere la pinza attraverso l'osso come questo può danneggiare il labirinto membranoso sottostante ed epitelio sensoriale. Continuare questa procedura fino a quando sia l'anteriore e condotti membranosi semicircolari orizzontali adiacenti e ampolle sono esposti (Figura 2).

Figura 1
Figura 1. L'isolato mouse labirinto vestibolare. A. Pannello di sinistra) Rappresentazione schematica del isolato mouse labirinto vestibolare. Importanti punti di riferimento per l'accesso dell'epitelio sensoriale vestibolare, la coclea, anteriore e orizzontale canali semicircolari sono labeLED. Gli asterischi indicano l'ampolla canale semicircolare contenente l'epitelio sensoriale vestibolare. B. Destra del pannello) Microfotografia del isolato labirinto vestibolare da un 1-mese-vecchio mouse.

Figura 2
Figura 2. L'esposizione del labirinto vestibolare membranosa. L'osso sovrastante le ampolle canale semicircolare anteriore e orizzontali sono stati graffiato via per rivelare il nero / marrone maculato di ampolle membranosa e nervi ampollari associati (CNVIII). Lo schema nel pannello inferiore rappresenta le strutture nella regione evidenziata della microfotografia e mostra il rapporto dei condotti canali semicircolari al ampolle e CNVIII.

  1. Utilizzando una pinza sottile, sollevare delicatamente le ampolle e associati utricle lontano dal labirinto osseo, assicurando che la regione centrale del ampolle (contara zione l'epitelio sensoriale) non sia danneggiata. In alcuni casi può essere necessario tagliare con le forbici iris per rilasciare le ampolle dall'osso parte prossimale del condotto membranoso semicircolare.
  2. Trasferire la triade contenente le due ampolle e utricle in una capsula di Petri riempite con L-15 di coltura di Leibovitz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Utilizzare una fibra ottica di "retroilluminazione" il tessuto. Questo permette chiara visualizzazione del crista contenente l'epitelio sensoriale all'interno del ampolle.
  3. Fare attenzione un'incisione nella maculato "tetto" del otricolo con le belle forbici iris. Continuare questa incisione attraverso il tetto del anteriore e poi le ampolle orizzontale. Effettuare l'incisione più vicino al bordo dell'epitelio sensoriale possibile senza contatto (Figura 3A). Assicurarsi che non ci siano pezzi di membrana sovrastante l'epitelio sensoriale (Figura 3B)
  4. Trasferire il isolata semi preparazione intatto per un piccolo bicchieres camera di registrazione a fondo pieno di L-15 media. Appesantire la preparazione con una griglia di fibre di nylon sottili depositati ad un filo di platino a forma di U appiattita (Figura 3B). Idealmente, le fibre della griglia non devono sovrapporsi dell'epitelio sensoriale, tuttavia in alcuni casi in cui è richiesta una maggiore stabilità, una singola fibra sezionando dell'epitelio sensoriale forse preferito.

Figura 3
Figura 3. L'isolato preparazione semi-intatta del epitelio sensoriale. A. Rappresentazione schematica vestibolare della preparazione semi-intatto e configurazione degli elettrodi. L'ampolla sovrastante la cresta è stato "de-tetto" per esporre la superficie dell'epitelio sensoriale (verde). B. Microfotografia del semi-intatte preparazione 'triade' che mostra la parte anteriore (AC) e orizzontale (hc) Crista (utricle oscurato esserecerva ac). Notare la fibra di nylon utilizzato per fissare la preparazione alla base della camera di registrazione. Barra della scala:. 100 micron C. Un elettrodo di registrazione posizionata su una singola cella capelli vestibolare. Barra della scala: 15 micron.

3. Elettrofisiologia

  1. Profumato alla preparazione semi-intatte con continuamente ossigenato L-15. Il supporto contiene un indicatore di pH (rosso fenolo) e il colore del mezzo devono essere monitorate per le registrazioni. Il pH di ossigeno dovrebbe essere 7,3-7,4 e corrispondere a un colore rosso.
  2. Preparare la registrazione pipette da 1,5 millimetri (1.19 mm ID) in vetro borosilicato utilizzando un protocollo a due fasi (fase di calore 1: 72, e passo di calore 2: 50) su una micropipetta estrattore (Narishige, Giappone, modello PP-830) per ottenere una impedenza finale di 3-4 MW.
  3. Riempire il gambo della pipetta con 3-4 mm di soluzione interna a base di fluoruro di potassio contenente (in mM) KF 110, KCl 12, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 1.8 MgCl2,3 D-glucosio e 2 Na-ATP, pH 7,4 con KOH.
  4. Avvolgere il gambo della pipetta 2-3 volte e più in basso alla punta possibile con una sottile striscia di parafilm per isolare l'elettrodo e ridurre pipetta capacitanza.
  5. Posizionare la pipetta sopra l'epitelio sensoriale sotto ingrandimento a bassa potenza (5X) su un microscopio in posizione verticale (Olympus BX51). Passare a elevata potenza (40X) e visualizzare le cellule ciliate vestibolari individuali con una fotocamera collegata CCD.
  6. Posizione pipetta sulla membrana di una cellula capelli visualizzate (Figura 3C) utilizzando un micromanipolatore (Sutter Instruments, California, USA). Una volta che una guarnizione gigaohm è raggiunto, la rottura della membrana cellulare con una piccola quantità di pressione negativa applicata attraverso una porta di aspirazione sul supporto pipetta.
  7. Effettuare registrazioni clamp di tensione a cellula intera utilizzando tecniche standard di 8-9.

4. Microscopia a due fotoni

  1. Preparare una soluzione salina allo 0,9% contenente 5 mM Oregon Verde488 BAPTA-1 (OGB-1; sale hexapotassium, Invitrogen, Germania).
  2. Mentre ancora sommerso, posizionare la "de-tetto" preparazione triade semi-intatto su un piccolo pezzo di carta da filtro (4x4 mm, 0,8 micron di spessore; Millipore, Germania) garantendo che l'epitelio sensoriale è ostruita da sopra.
  3. Trasferire la carta da filtro e preparazione sulla base di soluzione salina coperta elettrodo di platino (7 ml) di un electroporator costituito dalla combinazione di un generatore di impulsi e un amplificatore a larga banda, e coprire con un ulteriore 5 pl di soluzione 5 mM di calcio sintetici colorante indicatore Oregon verde 488 Bapta-1 (figura 4).

Figura 4
Figura 4. Elettroporazione Bulk. A. schematica che mostra sezione trasversale di configurazione elettroporazione. La preparazione semi-intatta (*) è collocato su un pezzo di carta da filtro immersa in dy calcioe (Oregon verde 488 Bapta-1) e la corrente applicata tra due elettrodi di platino. Adattato da Briggman e Euler, 2011 10.

  1. Portare la parte superiore platino elettrodo parallelo con l'elettrodo di base ad una distanza di circa 2 mm, facendo attenzione a non disturbare l'orientamento della preparazione, quando il contatto con il verde 488 BAPTA-1 soluzione di Oregon è fatto.
  2. Passare un breve impulso di corrente in tutta la preparazione (Parametri per la corrente; +13 V, 10 msec larghezza di impulso, 1 Hz, 10 impulsi a onda quadra) 10-11.
  3. Sul fondo di una camera di registrazione fondo di vetro riempita con L-15, posizionare una goccia di olio siliconico e posizionare la preparazione semi-intatte su di esso, assicurando che il nuovo epitelio sensoriale è ostruita da sopra. Per assicurare la stabilità durante l'imaging, sostituire la griglia di nylon sopra la preparazione come descritto sopra (vedi punto 2.13).
  4. Utilizzando il microscopio a due fotoni effettuare registrazioni ottiche di spontaattività calcio nea nell'epitelio sensoriale (figura 7) utilizzando protocolli di imaging standard 10-11.

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Representative Results

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Le proprietà elettrofisiologiche di cellule cigliate vestibolari sono dipendenti dalla microarchitettura complesso entro cui sono inserite 7. Figura 5 mostra che il semi-intatte preparazione epitelio vestibolare può essere utilizzata per distinguere tra cellule pilifere tipo I (Figura 5A), cellule hair tipo II (Figura 5B), e il calice primario afferente (Figura 5C) sulla base di caratteristiche conduttanze cellula intera. Queste caratteristiche includono un pronunciato "sag" durante la depolarizzazione e grandi "collasso" correnti di coda del tipo I delle cellule dei capelli, e la presenza di correnti di sodio verso l'interno che rappresentano potenziali d'azione nel calice primaria afferente (freccia in Figura 5C).

La preparazione può anche essere usata per quantificare l'impatto dell'invecchiamento sui singoli tipi di cellule vestibolari capelli. Figura 6 confronta la conduttanza (FIGURA 6A) e inattivazione caratteristiche (Figura 6B) di II cellule ciliate vestibolari di tipo in risposta al passaggio depolarizzazione da un potenziale di riposo negativo a giovani e meno giovani topi. Per il tipo II cellule ciliate - differenze il meno sensibile sottotipo-significativi non sono stati osservati in uno dei due parametri (vedi discussione).

Oltre alla analisi delle proprietà di cellule intere, la preparazione semi-intatte si presta anche ad analisi su larga scala dei meccanismi subcellulari base della funzione delle cellule dei capelli. Figura 7 mostra la localizzazione differenziale di calcio al tipo cellule cigliate I e calice primaria afferenti, nonché l'organizzazione cellulare sub calcio all'interno di queste cellule. figura 7A mostra il cambiamento di fluorescenza di calcio in un tipo di cellula individuo I capelli per l'aggiunta di 100 mM KCl. La durata di questo cambiamento è tracciata in Figura 7B. È importante sottolineare che il preparatione consente l'indagine dell'attività delle cellule capelli alla risoluzione subcellulare, in più celle contemporaneamente e in un ambiente "quasi normale" (Figura 7C) - una caratteristica non possibile utilizzando cellule ciliari isolate e elettrofisiologia singola cellula.

Figura 5
Figura 5. Correnti di cellule intere registrati da cellule ciliate nel topo epitelio vestibolare sensoriale. A. correnti cellulari totali registrate da una cellula di tipo I capelli vestibolare caratterizzato da grande "collasso" coda correnti (Freccia). B. correnti cellulari totali registrate da un tipo II vestibolare cellule dei capelli. Si noti l'assenza di correnti di coda. C. registrazione cella intero da un afferente primario calice caratterizzato da transienti correnti di sodio-mediate (Freccia) in seguito a depolarizzazione da un potenziale di riposo negativo (-120 mV). Tutte le cellule were tenuto a -60 mV.

Figura 6
Figura 6. Confronto di sensibilità e di inattivazione in tipo II cellule ciliate da giovani e meno giovani topi. A. rapporti I / V per il tipo di cellule ciliate II immessi da giovane (1 mese) e più anziani (9 mesi) topi in risposta alla crescente durata depolarizzazione. B. Il rapporto di conduttanza e l'inattivazione media di cellule ciliate di tipo II in giovani e vecchi topi sulla base dei 100 msec curve I / V.

Figura 7
Figura 7. Due fotoni di imaging di calcio del mouse semi-intatte vestibolare preparazione epitelio sensoriale. A. Pannello in alto a sinistra) microscopio a due fotoni che mostrano-1 BAPTA Oregon attivazione di calcio verde in risposta alla normale L-15 perfusato(Top) o L-15 contenente 100 mM KCl (in basso). Frecce indicano una cella capelli individuale prima e dopo l'aggiunta di KCl. B. Pannello superiore destra) Calcio profilo fluorescenza della cella evidenziata in A. C. Pannello inferiore) microscopio a due fotoni dell'epitelio sensoriale che mostra Oregon verde 488 Bapta-1 carico delle cellule ciliate singoli Pannello inferiore riquadro:. Localizzazione subcellulare di calcio di tipo I capelli citoplasma cellulare (freccia) o il calice primario afferente circostante un tipo Ho cella capelli (doppie frecce).

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Discussion

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I meccanismi alla base il nostro senso di equilibrio hanno ricevuto scarsa attenzione rispetto ad altri sistemi sensoriali, ad esempio, i sistemi visivi e uditivi. Tra gli studi che hanno indagato i cambiamenti nella funzione vestibolare o di equilibrio, la maggior parte sono concentrati su misure comportamentali tra cui il riflesso vestibolo-oculare, con una conoscenza incompleta degli elementi costitutivi fondamentali del-la bilancia cellule ciliate vestibolari stesse. Quegli studi che si sono concentrati sulle cellule dei capelli sono quasi sempre fatto utilizzando cellule ciliate acutamente isolate rimossi dal loro ambiente nativo. In questo articolo si dimostra una preparazione semi-intatto del mouse epitelio vestibolare sensoriale che si espande su questi studi di fondazione.

Mentre cellule ciliate vestibolari sono relativamente robuste, l'utilità della preparazione semi-intatto è criticamente dipendente dalla velocità di escissione. In genere, una preparazione rimarrà valida a rootemperatura m per un periodo di circa 2-5 ore dopo l'asportazione. Pertanto, riducendo al minimo il tempo impiegato da quando l'animale è eutanasia di registrazione è fondamentale. L'escissione può essere relativamente facile e veloce per un tre settimane vecchio mouse (min totale 5-7), ma diventa sempre più difficile in un animale più vecchio (fino a 25 min a 9 mesi i topi). In questi animali più vecchi, temperatura dissezione è un determinante critico - facendo in modo che la preparazione è continuamente bagnata ghiacciate ossigenati ACSF normali processi catabolici sono inibiti.

Come descritto nella sezione 3.1 la preparazione è stata continuamente perfuso con ossigenati medio di Leibovitz, L-15, e cellule intere tensione registrazioni clamp sono stati realizzati usando microelettrodi di vetro riempite di soluzione interna KF 12. Questa combinazione di ambienti esterni ed interni ha dimostrato di fornire registrazioni più stabili e di più lunga durata rispetto agli altri interni a base di potassio e / o di Ringersoluzioni extracellulari a base di 13-14. Questa stabilità è cruciale per le lunghe protocolli necessari per studiare le proprietà elettrofisiologiche e le dinamiche del calcio delle cellule ciliate che utilizzano rispettivamente patch-clamp e tecniche di due fotoni.

L'obiettivo fondamentale della preparazione semi-intatta è di fornire un modello per lo studio delle cellule ciliate vestibolari che è disturbato il meno possibile. Mentre la preparazione fornisce chiari vantaggi rispetto acutamente cellule ciliari isolate - per esempio, la dinamica interi di correnti intere cellule vengono rivelati solo utilizzando la preparazione semi-intatte 3, 7 - interruzioni non possono essere evitati. Innanzitutto, è difficile valutare l'impatto della rimozione del "tetto" del ampolla (e presumibilmente la cupula allegata) sulla segnalazione cellulare capelli spontanea. In condizioni fisiologiche normali, cellule ciliate rispondono a flessione del cupula / capelli complesso fascio. Senza di questo complesso è concepibile che cel capelli spontaneal segnalazione può non essere rappresentativa delle condizioni in vivo. In secondo luogo, registrazioni elettrofisiologiche nella preparazione semi-intatte sono per lo più limitati a misure di attività spontanea o una risposta a un'attività naturale simulata (cioè iniezioni di corrente continua in cella capelli o meccanico flessione di fasci di capelli). Quindi non è possibile studiare le proprietà delle celle capelli sottostanti in risposta all'attivazione di vita reale (cioè i movimenti della testa). Tuttavia, la preparazione semi-intatte rappresenta un nuovo strumento per aiutarci a capire la funzione delle cellule dei capelli, e si apre una serie di strade per la ricerca futura.

Un vantaggio importante che la preparazione semi-intatte fornisce più acutamente isolati preparazioni di cellule dei capelli è che permette di registrazioni simultanee da cellule ciliate multiple e / o dei loro afferenti primari associati. Utilizzando tecniche di registrazione di patch clamp doppi, o multi-cella questa funzione fornisce un mezzo per valutaredirettamente cellula capelli / Segnalazione afferenti primari, qualcosa che non può essere raggiunto con preparazioni tradizionali isolate. Inoltre, utilizzando la microscopia a due fotoni, la preparazione semi-intatte consente la misurazione simultanea di funzione sub-cellulare attraverso la piena portata dell'epitelio sensoriale. Ciò significa che le informazioni riguardanti la segnalazione di calcio e il metabolismo cellulare possono essere maturati rapidamente e nel contesto. Infine, utilizzando topi consente mirata manipolazione genetica (ad esempio proteina fluorescente verde etichettato all'espressione calretinina come marker per le cellule di tipo I capelli e gli afferenti primari calice). La preparazione semi-intatte fornisce un metodo per studiare l'attività delle cellule ciliate e gli afferenti primari differenzialmente, e simultaneamente. Questo da solo, avrebbe fornito una ricchezza di nuove informazioni per quanto riguarda come le cellule ciliate vestibolari e gli afferenti primari interagiscono per individuare e quindi codificare le informazioni da trasmettere al cervello per quanto riguarda la testa e la posizione del corpo.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito da un Garnett Passe e Rodney Williams Memorial Foundation sovvenzione di progetto a R. Lim e AJ Campo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Leibovitz medium L-15 Sigma Aldrich L4386-10X1L
BAPTA-1-oregon green Invitrogen O6806
EQUIPMENT
Stereo microscope Leica Microsystems A60S
Upright microscope Olympus BX51WI
Two-photon microscope Olympus/La Vision BX51WI/ TriMScope II
Dumont #5 SF Forceps FST 11252-00
Friedman-Pearson Rongeurs FST 16221-14
Standard Pattern Scissors FST 14001-12
InstraTECH A-D converter HEKA ITC-18
Sutter Micromanipulator Sutter MP-225/M
multiclamp amplifier Axon Instruments 700B
Data acquisition software (electrophysiology) Axograph N/A
Imspector Data acquisition software (two-photon) Max Planck innovation N/A

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References

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Tung, V. W. K., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50471, doi:10.3791/50471 (2013).More

Tung, V. W. K., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50471, doi:10.3791/50471 (2013).

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