En isolert Semi-intakt Utarbeidelse av Mouse Vestibular Sensorisk Epitel for Electrophysiology og høy oppløsning To-foton mikroskopi
Summary
Analyse av vestibulære hår celle funksjon er komplisert av deres plassering dypt i den vanskeligste delen av skallen, den petrous timelige bein. De fleste funksjonelle hår celle studier har brukt akutt isolerte hårcellene. Her beskriver vi en semi-intakt utarbeidelse av mus vestibular epitel for elektrofysiologiske og to-foton mikroskopi studier.
Abstract
Forstå vestibulære hårcellene fungere under normale forhold, eller hvordan traumer, sykdom og aldring forstyrre denne funksjonen er et viktig steg i utviklingen av forebyggende tilnærminger og / eller nye terapeutiske strategier. Imidlertid har de fleste studier som ser på unormal vestibularfunksjonen ikke vært på cellenivå, men fokusert primært på atferdsmessige analyser av øredysfunksjon som ganglag analyser og vestibulo-okulær refleks ytelse. Mens dette arbeidet har gitt verdifulle data om hva som skjer når ting går galt, er lite informasjon hentet om de underliggende årsakene til dysfunksjon. Av de studier som fokuserer på cellulære og subcellular prosessene som ligger bak vestibularfunksjonen, har mest stolt på akutt isolert hårceller, blottet for sine synaptiske forbindelser og støtte celle miljø. Derfor har en stor teknisk utfordring vært tilgang til de utsøkt sensitive vestibulære hårcellene i en preparation som er minst forstyrret, fysiologisk. Her kan vi demonstrere en semi-intakt utarbeidelse av musen vestibular sensorisk epitel som beholder den lokale mikro-miljøet, inkludert hårcelle / primære afferente komplekser.
Introduction
Til tross for betydelig bidrag til det vestibulære system til vår hverdag, en klar forståelse av prosessene som er ansvarlige for den observerte nedgangen i vestibularfunksjonen med alderen forblir unnvikende. En årsak til denne mangelen på kunnskap er at nedgangen i vestibularfunksjonen har nesten utelukkende blitt utforsket ved hjelp av atferdsmessige analyser, inkludert vestibulo-okulær refleks (VOR), en presis indikator på ytre vestibularfunksjonen, men gir begrenset innsikt i endringene av iboende komponenter . Dette er et stort hinder for vår forståelse av vestibulære hår celle funksjon i helse, sykdom eller aldring.
Mens det har vært mange studier av individuelle vestibulære hårcellene, har en stor brist vært avhengigheten av akutte hår celle preparater, hvor hårcellene og selv beger afferente terminaler er fjernet fra deres normale miljø via mekanisk og / eller enzymatisk behandling. Slike tilnærminger inevitaBly forstyrre den delikate mikroarkitektur mellom hårcelle og beger, og hår celle og støtte celle. Med utviklingen av halvt-intakte preparater 1-5, og en isolert mus labyrint fremstilling 6, er det nå en mulighet for å studere de forskjellige former av synaptiske kommunikasjon under betingelser som likner mer på de in vivo. Faktisk viste Lim et al. (2011) markerte forskjeller i hele cellen strømmer opp fra akutt isolert type I vestibulære hårcellene sammenlignet med de som forble innebygd i neuroepithelium. Nærmere bestemt er kalium tenkt å akkumulere i det intercellulære rom, mellom hårcelle og beger afferent, og vesentlig endre hårcelle respons 7.. Denne type informasjon vil være umulig å oppnå uten at det semi-intakt fremstilling av den vestibulære sensorisk epitel beskrevet her. Vi viser den halvt intakt utarbeidelse av musen crista 3, Og viser representative resultatene fra hel-celle patch elektrofysiologi, og to-foton kalsium bildebehandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mekanismene bak vår følelse av balanse har fått begrenset oppmerksomhet i forhold til andre sensoriske systemer, for eksempel de visuelle og auditive systemer. Av de studier som har undersøkt endringer i vestibular eller balanse funksjon, har mest fokusert på atferdsmessige tiltak, inkludert vestibulo-okulær refleks, med ufullstendig kunnskap om de grunnleggende byggesteinene i balanse-vestibular hårcellene selv. De studier som har konsentrert seg om hårcellene har nesten alltid gjort det ved hjelp av a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Midler til dette arbeidet ble gitt av en Garnett Passe og Rodney Williams Memorial Foundation Prosjekt tilskudd til R. Lim og AJ Camp.
Materials
| REAGENTS | |||
| Leibovitz medium L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Two-photon microscope | Olympus/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 SF Forceps | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Standard Pattern Scissors | FST | 14001-12 | |
| InstraTECH A-D converter | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter Micromanipulator | Sutter | MP-225/M | |
| multiclamp amplifier | Axon Instruments | 700B | |
| Data acquisition software (electrophysiology) | Axograph | N/A | |
| Imspector Data acquisition software (two-photon) | Max Planck innovation | N/A |
References
- Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
- Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. , (2009).
- Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. , (2009).
- Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. , (2010).
- Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. , (2010).
- Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
- Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
- Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
- Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170, 348-360 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
- Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
- Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).
