Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton Mikroskopi için Fare Vestibüler Duyu epiteli bir İzole Yarı sağlam Hazırlık

doi: 10.3791/50471 Published: June 13, 2013

Summary

Vestibüler saç hücre fonksiyonu analizi kafatası, petröz temporal kemiğin en zor kısmı içinde derin konumlarına göre karmaşıktır. En işlevsel saç hücre çalışmaları akut izole saç hücrelerinin kullandık. Burada elektrofizyolojik ve iki-fotonlu mikroskop çalışmaları için fare vestibüler epitelyum bir yarı sağlam hazırlanması açıklanmaktadır.

Abstract

Anlamak vestibüler saç hücreleri normal koşullar altında işlev, ya da ne kadar travma, hastalık, ve bu fonksiyon bozabilir yaşlanma önleyici yaklaşımlar ve / veya yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi hayati bir adımdır. Ancak, anormal vestibüler fonksiyon bakarak çalışmaların çoğunluğu hücresel düzeyde olmuştur ama esas olarak yürüyüş analizleri ve vestibülookuler refleks performans olarak vestibüler fonksiyon bozukluğu davranış testleri odaklı değil. Bu iş terslik ne olur hakkında değerli bilgiler vermiştir olsa da, çok az bilgi disfonksiyon nedenleri ile ilgili toplanan edilir. Vestibüler fonksiyonu altında yatan hücresel ve hücre içi süreçleri odaklanmak çalışmaların, çoğu sinaptik bağlantıları ve destekleyici hücre çevre yoksun akut izole saç hücreleri, yararlanmıştır. Bu nedenle, büyük bir teknik meydan okuma bir hazırlık içinde zarif duyarlı vestibüler saç hücrelerinin erişimi olmuşturaration en fizyolojik, bozulur bu. Burada saç hücre / primer afferent kompleksleri dahil olmak üzere yerel mikro-çevre korur fare vestibüler duyu epitel bir yarı-sağlam hazırlık göstermektedir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Günlük hayatımıza vestibüler sistemin önemli bir katkı rağmen, yaşla birlikte vestibüler fonksiyonunda gözlenen düşüş sorumlu süreçlerin net bir anlayış zor kalır. Bu bilgi eksikliği bir nedeni vestibüler fonksiyonu bu düşüş neredeyse sadece vestibülookuler refleks (VOR), dışsal vestibüler fonksiyonun kesin bir gösterge dahil davranış testleri kullanılarak incelenmiştir, ancak içsel bileşenlerinin değişiklikleri içine sınırlı bilgiler sağlar . Bu sağlık, hastalık, ya da yaşlanma vestibüler saç hücre fonksiyonlarını daha iyi anlayabilmemiz için önemli bir engeldir.

Bireysel vestibüler saç hücrelerinin birçok çalışma varken, büyük bir eksiklik saç hücreleri ve hatta çanak afferent terminaller mekanik ve / veya enzimatik tedavi ile normal ortamdan kaldırılır akut saç hücresi hazırlıkları, üzerinde güven olmuştur. Bu tür yaklaşımlar kaçınılmazkızak kesici saç hücresi ve çanak ve saç hücre ve destekleyici hücre arasındaki hassas mikromimarisini bozabilir. Yarı sağlam hazırlıkları 1-5, ve izole bir fare labirent hazırlık 6 gelişmesiyle birlikte, daha yakından in vivo benzeyen bu koşullar altında sinaptik iletişim çeşitli şekillerde incelemek için bir fırsat şimdi var. Gerçekten de, Lim ve ark. (2011) I vestibüler saç hücreleri neuroepithelium içinde gömülü kaldığını kıyasla akut izole türünden kaydedilen tüm hücre akımları belirgin farklılıklar gösterdi. Özellikle, potasyum saç hücresi ve afferent çanak arasında, hücreler arası boşlukta birikir düşünülmektedir, ve önemli ölçüde saç hücresi yanıtı 7 değiştirebilir. Bu tür bilgiler burada açıklanan vestibüler duyusal epitelin yarı sağlam hazırlık olmadan elde etmek mümkün olacaktır. Biz fare krista 3 yarı sağlam hazırlık göstermekVe tam hücreli yama elektrofizyoloji elde edilen temsilcisi sonuçları ve iki foton kalsiyum görüntüleme göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Hayvanlar

  1. Fareler Avustralya Kemirgen Merkezi (ARC, Perth, Avustralya) elde edildi ve çevresel zenginleştirme ile normal 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsü Sidney Bosch Hayvan Tesisi Üniversitesi'nde düzenledi. Tanımlanan tüm deneyler Sidney Hayvan Etik Kurul Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
  2. Erkek ve dişi fareler (C57/BL6) bu gerginlik yaygın genetik manipülasyon için arka planı olarak kullanılır çünkü tüm deneyler için kullanıldı ve 8-9 vahşi-tipe eşdeğer kabul edilebilir.

2. Doku Hazırlanması

  1. 26 NaHCO3, 11 glukoz, 250, gliserol, 2,5 KCl, 1.2 NaH 2 PO 4, 1.2, MgCl2, ve 2.5 CaCI2: oluşan bir gliserol bazlı yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) (mM olarak) 300 ml hazırlayın. CaCl2 ilavesinden önce, karbojen gazı (% 95 O2 ve% 5 CO2) ile çözüm AP kurmak7.4 H ve önlemek kalsiyum yağış (bulutluluk). Bir buz bulamaç oluşmuştur, böylece, 45 dakika boyunca -80 ° C dondurucu içinde çözelti dondurun.
  2. Derin bir içi-periton enjeksiyon yoluyla ketamin (100 mg / kg) (Parnell, İskenderiye, Avustralya) ile fareler uyuşturan.
  3. Bir kez arka-bacak tutam refleksleri keskin paslanmaz çelik makas kullanarak yok başını kesmek fareler ve kafatası ortaya çıkarmak için bir jilet (# 22 yuvarlak) kullanarak sagital cilt kesi yapmak. Bu noktada ve adımları 2,3-2,8 boyunca kafatası, beyin, ve temel vestibüler cihaz doku üzerinde buz ACSF düzenli uygulama mümkün olduğunca serin tutulmalıdır.
  4. Standart desen makas sivri kolu (FST, Kuzey Vancouver, Kanada) kullanılarak Lambda de kafatasında küçük bir kesi yapmak ve sagital sütür boyunca kesilir. Beynin bu adımı sırasında kesme bıçağı ile "sürüklenen" olmadığından emin olun.
  5. Dikkatlice yanal parietal kemik ve oksipital kemik postero kabuğurly sığ viraj Pearson rongeurs (FST) kullanarak.
  6. Küçük bir paslanmaz çelik spatula yavaşça orta ve posterior kranial fossa yüzeyinden beyin kaldırmak için kullanılan ve maruz vestibulocochlea sinir (CNVIII) iç kulak ve ince iris bir makas ile beyin sapı arasında yarı yolda kesilir. Bu sinir kesme saç hücreleri ile birincil afferentleri ve bağlantılarının akson üzerinde aşırı gerginlik en aza indirir.
  7. CN VIII transeksiyonu takiben beyin toto uzaklaştırılmaktadır.
  8. Vestibüler labirent koklea anteromediale işaret ile, şimdi orta kranial fossada açıkça görülebilir. Hafifçe ön semisirküler kanal kavrama ve yanal çekerek eksize önce vestibüler labirent her iki tarafında RONGEUR.
  9. Bölüm 2.1 'de açıklanan buz gibi, sürekli gaz verilerek ACSF içeren bir diseksiyon çanak çıkarıldı labirentler (Şekil 1) bırakın. Bir stereomikroskopta altında, labirent tutunkoklea kavrayarak çanak taban. Ön semisirküler kanal ampulla örten kemik uzakta kazımak için ince forseps kullanın. Kemik küçük bir delik elde uzak bir kez Ampulla gelen kemik fiske başlar. Dikkat Bu temel membranöz labirent ve duyusal epitel zarar verebilir gibi kemik ile forseps itmek için değil alınmalıdır. Ön ve komşu yatay yarım daire membran kanalları ve ampullae hem (Şekil 2) maruz kalan kadar bu işleme devam edin.

Şekil 1
Şekil 1. İzole fare vestibüler labirent. A. Sol panel) izole fare vestibüler labirent şematik. Vestibüler duyu epitel erişim için referans önemli noktaları, salyangoz, ön ve yatay semisirküler kanallar laboratuarıeLED. Yıldız vestibüler duyu epitel içeren semisirküler kanal ampulla göstermektedir. B. 1 aylık fareden izole vestibüler labirent sağ panel) photomicrograph.

Şekil 2,
Şekil 2. Membranöz vestibüler labirent maruz kalması. Anterior ve yatay semisirküler kanal ampullae örten kemik siyah / kahverengi benekli membranöz ampullae ve ilgili ampuller sinirler (CNVIII) ortaya çıkarmak için çizilmiş. Alt panelinde şematik fotomikrografisine vurgulanan bölgedeki yapıların temsil eder ve ampullae ve CNVIII için semisirküler kanal kanalların ilişkiyi gösterir.

  1. Ince forseps kullanarak, yavaşça sağlanması, kemik labirent uzak ampullae ve ilgili kırbacık kaldırdıklarını ampullae merkez bölgesi (contaduyusal epitel) ining zarar değildir. Bazı durumlarda yarım daire membranöz kanal proksimalinde kemikten ampullae serbest bırakmak için iris makası ile kesmek gerekebilir.
  2. Leibovitz L-15 kültür ortamı (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) ile dolu bir Petri kabı içine iki ampullae ve kırbacık içeren üçlü aktarın. "Arka" dokuya optik bir fiber kullanın. Bu ampullae içinde duyusal epitel içeren kristanın açık görselleştirme sağlar.
  3. Dikkatlice ince iris makas ile kırbacık en benekli "çatı" bir kesi yapmak. Ön çatısı ve daha sonra yatay ampülleri ile bu kesi devam edin. Bu (Şekil 3A) irtibat kurmadan mümkün olduğunca duyu epitel kenarına yakın kesi yapmak. Duyusal epitel örten zarın hiçbir parça (Şekil 3B) olmadığından emin olun
  4. Küçük bir cam ile izole yarı sağlam hazırlanması aktarmas dipli kayıt odasına L-15 medya ile dolu. Düzleştirilmiş bir U-şekilli platin tel (Şekil 3B) sabitlenmiş ince naylon liflerden oluşan bir ızgara kullanarak hazırlanması aşağı tartılır. İdeal olarak, kılavuz teller duyusal epitel örter gerekir, ancak daha yüksek stabilite gerekli olduğu bazı durumlarda, belki de tercih duyu epitel kesilmesiyle tek bir fiber.

Şekil 3,
Şekil 3,. Yarı sağlam hazırlık ve elektrot yapılandırma vestibüler duyu epitel. A. şematik temsil izole yarı sağlam hazırlık. Crista örten ampulla duyusal epitel (yeşil) yüzeyine ortaya çıkarmak için "de-çatılı" olmuştur. Anterior (AC) ve yatay (hc) crista (kırbacık gösteren yarı sağlam 'üçlü' hazırlık B. photomicrograph olmak gizlenmiş) ac arka. Kayıt odasının tabanına hazırlanması sabitlemek için kullanılan naylon elyaf edin. Ölçek çubuğu:. 100 mikron C. bireysel vestibüler saç hücre yerleştirilmiş bir kayıt elektrot. Ölçek çubuğu: 15 mikron.

3. Elektrofizyoloji

  1. Sürekli oksijenli L-15 ortamı ile yarı sağlam hazırlanması serpmek. Medya kayıtları boyunca izlenmelidir ortamın pH göstergesi (fenol kırmızı) ve renk içerir. Oksijen ile pH 7.3-7.4 olacak ve kırmızı bir renk uygun olmalıdır.
  2. Bir elde etmek için bir mikropipet çektirmesi (model PP-830 Narishige, Japonya,) üzerinde:,: iki aşamalı bir protokol (50 ve ısı adım 2 72 ısı adım 1) ile 1.5 mm (1.19 mm ID) borosilikat cam kayıt pipetler hazırlayın MQ 3-4 nihai empedansı.
  3. MgCl2 (mM olarak) 110 KF, 12 KCI, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 mM EGTA, 1.8 içeren bir potasyum flüorür temelli bir iç çözelti 3-4 mm olan pipet şaft doldurun3. D-glikoz, ve 2 Na-ATP, KOH ile pH 7.4.
  4. Kadar aşağı elektrot izole ve pipet kapasitans azaltmak için parafilm ince bir şerit ile mümkün olduğunca ucu pipet 2-3 kez sap sarın ve.
  5. Dik bir mikroskop (Olympus BX51) düşük güç büyütme (5X) altında duyu epitel üzerinde pipet yerleştirin. Yüksek güç (40X) geçin ve bağlı bir CCD kamera ile tek tek vestibüler saç hücrelerinin görselleştirmek.
  6. Bir micromanipulator (Sutter Instruments, California, ABD) kullanılarak bir görsel saç hücresi (Şekil 3C) ve membran pozisyon pipet. Bir gigaohm sızdırmazlık elde edilir, kopma pipet tutucu bir emiş ağzı yoluyla uygulanan bir negatif basınç küçük bir miktarı ile hücre zarı.
  7. Standart teknikler kullanılarak 8-9 tam hücre voltaj sıkıştırma kayıtları yapın.

4. İki foton Mikroskopi

  1. 5 mM Oregon Yeşil içeren% 0.9 serum fizyolojik hazırlayın488 BAPTA-1 (OGB-1; hexapotassium bir tuzu; Invitrogen, Almanya).
  2. Duyusal epitel yukarıdan engelsiz sağlamak; hala batık ise, filtre kağıdı küçük bir parça (Millipore, Almanya 4X4 mm, kalın 0.8 mikron) üzerine "de çatılı" yarı-sağlam üçlü hazırlık yerleştirin.
  3. Sentetik kalsiyum 5 mM'lik bir çözeltisi bir başka 5 ul ile filtre kağıdı ve hazırlık bir puls jeneratörü ve bir geniş-bant amplifikatörünün kombinasyonundan oluşan bir Electroporator arasında tuzlu su kaplı taban platin elektrot (7 ul) üzerine ve kapağın aktarma Gösterge boya Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 (Şekil 4).

Şekil 4,
Şekil 4. Toplu elektroporasyon. A. elektroporasyon yapılandırmasının şematik bir enine kesitini göstermektedir. Yarı sağlam hazırlanması (*) kalsiyum DY batırılır filtre kağıdına yerleştirilirE (Oregon Green 488 BAPTA-1) ve akım 2 platin elektrot arasında uygulanmaktadır. Briggman ve Euler 2011 10 uyarlanmıştır.

  1. Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 çözümü yapılır ile irtibata geçtiğinizde hazırlanması yönünü bozmak için dikkatli olmak, yaklaşık 2 mm bir mesafede taban elektrot ile üst platin elektrot paralel getirin.
  2. 10-11; hazırlanması (+13 V, 10 msn darbe genişliği, 1 Hz frekans, 10 kare dalga darbe akım için Parametreler) arasında kısa bir akım darbe Min.
  3. L-15 ortamı ile doldurulmuş bir dipli cam kayıt odasının alt kısmında, yine duyu epitel yukarıda engelsiz olması sağlanmış, bunun üzerine silikon yağı ve pozisyon yarı sağlam hazırlanması küçük bir dab yerleştirin. (Noktası 2.13 bakınız) yukarıda açıklandığı gibi görüntüleme boyunca istikrarı sağlamak için, hazırlanması üzerinde naylon ızgara değiştirin.
  4. Iki foton mikroskop kullanılarak spontan optik kayıt yapmakstandart görüntüleme protokolleri 10-11 kullanarak duyusal epitel (Şekil 7) neous kalsiyum aktivite.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vestibüler saç hücrelerinin elektrofizyolojik özellikleri onlar 7 gömülü olduğu dahilinde kompleksin mikromimarisine bağlıdır. Yarı sağlam vestibüler epitel hazırlanması türü arasında ayırt etmek için kullanılabilir, Şekil 5'te de görüldüğü gibi bir saç hücreleri (Şekil 5A), tip II saç hücreleri (Şekil 5B) ve çanak birincil aferent (Şekil 5C) karakteristik tam hücre iletkenlikleri dayanmaktadır. Bu özellikler bir depolarizasyon sırasında telaffuz "sarkma" ve tip I saç hücresi büyük "çöken" kuyruk akımları ve çanak primer afferent içinde aksiyon potansiyelleri (Şekil 5C olarak Ok) temsil eden geçici içe sodyum akımların varlığını içerir.

Hazırlanması da ayrıca tek tek saç vestibüler hücre tipleri üzerinde yaşlanma etkisini ölçmek için kullanılabilir. Şekil 6, iletim (F karşılaştırırgenç ve yaşlı farelerde negatif bir dinlenme potansiyeli depolarize adımına cevap olarak tip II vestibüler saç hücrelerinin ŞEKIL 6A) inaktivasyonu ve özellikleri (Şekil 6B). Tip II saç hücreleri için - en hassas alt-anlamlı bir fark (tartışma) ya parametresinde gözlenmemiştir.

Bütün hücre özelliklerinin analizine ek olarak, yarı sağlam preparat ayrıca saç hücre fonksiyonu altında yatan mekanizmaların hücre içi büyük ölçekli analizi için çok uygundur. Şekil 7, bu tip I saç hücreleri ve primer kaliksin kalsiyum ayırıcı lokalizasyonu gösterir ileticilerin, aynı zamanda, bu hücre içinde kalsiyum alt hücresel organizasyonu. Şekil 7A, 100 mM KCI ilavesi için tek bir tip I saç hücre kalsiyum floresans değişimi göstermektedir. Bu değişim zaman ders Şekil 7B'de çizilir. Önemlisi, preparatizole saç hücreleri ve tek hücreli elektrofizyoloji kullanarak mümkün değil bir özellik - iyon aynı anda ve bir "normale yakın" çevre (Şekil 7C) birden fazla hücrelerinde hücre içi çözünürlükte saç hücresi faaliyet soruşturma için izin verir.

Şekil 5,
Şekil 5,. Tüm cep akımları fare vestibüler duyu epitel saç hücrelerinden kaydedildi. A. Tüm cep akımları büyük "çöken" kuyruk akımları (Ok) ile karakterize bir tür vestibüler saç hücre kaydedildi. B. Tüm hücre akımları vestibüler bir tip II kaydedilen saç hücresi. Kuyruk akımların olmadığına dikkat edin. Bir çanak primer afferent C. Tüm hücre kayıt negatif dinlenme potansiyeli (-120 mV) için geçici sodyum-aracılı akımları (Ok) aşağıdaki depolarizasyon ile karakterizedir. Tüm hücreler Bere -60 mV düzenlenen.

Şekil 6,
6 Şekil. Artan depolarizasyon süresi, genç (1 ay) ve büyük (9 ay) yanıt olarak farenin kaydedilen tip II saç hücreleri, genç ve yaşlı farelerde tip II saç hücrelerini duyarlılık ve etkisizleştirme karşılaştırması. A. I / V ilişkileri. B 100 milisaniye I / V eğrilerine göre genç ve yaşlı farelerde tip II saç hücrelerinin ortalama iletkenlik ve inaktivasyonu oranına sahiptir.

Şekil 7
Şekil 7. İki foton yarı sağlam fare vestibüler duyu epitel hazırlık kalsiyum görüntüleme. A. Sol üst panel) Normal L-15 perfüzat yanıt olarak BAPTA-1 Oregon Yeşil kalsiyum aktivasyonunu gösteren İki foton mikroskop(Üst) veya L-15, 100 mM KCI (alt) 'tür. Oklar KCl ilave edilmesinden önce ve sonra, tek bir kıl hücresi gösterir. B Hücrenin) paneli sağ üst Kalsiyum floresan profil bir. C. vurgulanır Tek tek saç hücrelerinin Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 yükleme gösteren duyu epitel alt panel) İki foton mikroskobu Alt panel Ankastre:. Bir tür çevreleyen tür saç hücre sitoplazma (ok) veya çanak primer afferent için kalsiyum hücre içi lokalizasyonu Ben saç hücresi (çift oklar).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denge duygumuzu altında yatan mekanizmaları diğer duyu sistemleri ile karşılaştırıldığında sınırlı dikkat aldık, görsel ve işitsel sistemleri gibi. Vestibüler veya denge fonksiyonu değişiklikleri araştırdık çalışmaların, en denge-vestibüler saç hücrelerinin kendilerini temel yapı taşlarından eksik bilgi ile, vestibülookuler refleks dahil olmak üzere davranışsal tedbirler odaklanmıştır. Kendi ana ortamdan kaldırılır akut izole saç hücreleri kullanarak bunu saç hücreleri üzerinde yoğunlaşmıştır bu çalışmaların hemen hemen her zaman yaptık. Bu yazıda bu kuruluş çalışmaları üzerine genişletir fare vestibüler duyu epitel bir yarı-sağlam hazırlık göstermektedir.

Vestibüler saç hücreleri nispeten sağlam olsa da, yarı sağlam hazırlık programı eksizyonu hızına kritik bağlıdır. Tipik olarak, bir hazırlık roo de canlı kalacaktırçıkarıldıktan sonra yaklaşık 2-5 saat arasında bir süre için sıcaklık m. Bu nedenle, hayvan kayıt ötenazi sırasında alınmıştır zamanı en aza indirmek önemlidir. Eksizyon (9 aylık farelerde kadar 25 dk) nispeten kolay ve 3 hafta eski fare (5-7 dakika toplam) için hızlı olabilir, ama eski bir hayvan giderek daha da zorlaşır olabilir. Bu eski Hayvanlarda, diseksiyon sıcaklık kritik bir belirleyicisidir - hazırlanması sürekli buz gibi oksijenli ACSF Normal katabolik süreçlerde inhibe edilir yıkandığı sağlayarak.

Leibovitz ortamı, L-15, ve tüm-hücre voltaj-kıskaç kayıtları iç KF çözeltisi 12 ile doldurulmuş olan cam mikroelektrot kullanılarak yapılmıştır oksijen ile Bölüm 3.1 'de açıklanan hazırlık sürekli olarak perfüze edildi. Iç ve dış ortamları bu kombinasyonu, diğer potasyum bazlı iç ve / veya Ringer daha kararlı ve uzun süreli kayıtları sağlamak için gösterilmiştirtabanlı dışı çözümler 13-14. Bu istikrar sırasıyla yama-kelepçe ve iki foton teknikleri kullanılarak saç hücrelerinin elektrofizyolojik özellikleri ve kalsiyum dinamiklerini incelemek için gerekli olan uzun protokoller için çok önemlidir.

Yarı sağlam hazırlık temel amacı mümkün olduğunca az rahatsız vestibüler saç hücrelerinin çalışma için bir model sağlamaktır. Hazırlanması akut izole saç hücreleri üzerinde net avantajlar sağlamaktadır ise - örneğin, tüm hücre akımların tam dinamikleri sadece yarı-sağlam hazırlık 3, 7 ile ortaya çıkar - aksamalar kaçınılması mümkün değildir. İlk olarak, kendiliğinden saç hücre sinyal üzerindeki ampulla "çatı" (ve muhtemelen ekli cupula) kaldırma etkisini değerlendirmek zordur. Normal fizyolojik koşullar altında, saç hücreleri cupula / saç paket kompleksinin bükme cevap. Bu karmaşık olmadan akla olduğunu kendiliğinden saç cell sinyal in vivo koşullarda temsil olmayabilir. Yarı sağlam hazırlanmasında İkinci olarak, elektrofizyolojik çoğunlukla taklit doğal aktiviteye spontan aktivite veya yanıtların ölçümleri (kıl hücresi ya da saç demetleri bükme mekanik olarak örneğin, akım enjeksiyon) ile sınırlıdır. Bu nedenle gerçek hayat aktivasyon (yani baş hareketleri) yanıt olarak temel saç hücresi özelliklerini incelemek mümkün değildir. Bununla birlikte, yarı-sağlam hazırlık bize saç hücre fonksiyonu anlamalarına yardımcı olmak için yeni bir araç temsil eder ve gelecekteki araştırmalar için yolları bir dizi açar.

Yarı sağlam hazırlık akut izole saç hücresi hazırlıkları üzerinde sağladığı bir önemli avantajı da izin vermektedir birden fazla saç hücreleri ve / veya ilişkili birincil afferentleri gelen eş zamanlı kayıtları. Ikili veya çok hücreli yama kelepçe kayıt teknikleri bu özelliği kullanarak değerlendirmek için bir araç sağlardoğrudan saç hücre / primer afferent sinyal, geleneksel izole hazırlıkları ile elde edilemez bir şey. Buna ek olarak, iki foton mikroskopi kullanılarak, yarı sağlam hazırlık duyusal epitel tam ölçüde alanlarındaki alt hücresel fonksiyonunun aynı anda ölçümü için izin verir. Bu kalsiyum sinyalizasyon ve hücre metabolizması hızlı ve bağlamında tahakkuk edilebilir ilgili bu bilgileri anlamına gelir. Son olarak, fareler kullanarak hedeflenen genetik manipülasyon sağlar (türü için bir belirteç olarak kalretinin ifade etiketli örneğin yeşil flüoresan protein Ben saç hücreleri ve çanak primer afferentleri). Yarı sağlam hazırlanması farklı şekilde saç hücreleri ve Birincil ileticilerin aktivitesini incelemek ve aynı anda için bir yöntem sağlar. Tek başına bu, vestibüler saç hücreleri ve primer afferentleri tespit etmek için etkileşim ve daha sonra baş ve vücut pozisyonu ile ilgili beyne iletilmesini bilgileri kodlamak nasıl ilgili yeni bilgi hazinesi sağlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Bu iş için finansman R. Lim ve AJ Camp bir Garnett Passe ve Rodney Williams Memorial Foundation Projesi hibe tarafından sağlandı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Leibovitz medium L-15 Sigma Aldrich L4386-10X1L
BAPTA-1-oregon green Invitrogen O6806
EQUIPMENT
Stereo microscope Leica Microsystems A60S
Upright microscope Olympus BX51WI
Two-photon microscope Olympus/La Vision BX51WI/ TriMScope II
Dumont #5 SF Forceps FST 11252-00
Friedman-Pearson Rongeurs FST 16221-14
Standard Pattern Scissors FST 14001-12
InstraTECH A-D converter HEKA ITC-18
Sutter Micromanipulator Sutter MP-225/M
multiclamp amplifier Axon Instruments 700B
Data acquisition software (electrophysiology) Axograph N/A
Imspector Data acquisition software (two-photon) Max Planck innovation N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
  2. Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, (2009).
  3. Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, (2009).
  4. Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, (2010).
  5. Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, (2010).
  6. Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
  7. Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
  8. Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
  9. Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170, 348-360 (2010).
  10. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  11. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
  12. Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
  13. Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
  14. Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).
Elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton Mikroskopi için Fare Vestibüler Duyu epiteli bir İzole Yarı sağlam Hazırlık
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tung, V. W. K., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50471, doi:10.3791/50471 (2013).More

Tung, V. W. K., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50471, doi:10.3791/50471 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter